郝士婧 張黎 王琪

（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司 上海 200240）

肝素是世界上最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物，主要應(yīng)用于心腦血管疾病和血液透析治療，其中，其在血液透析治療中是唯一有效的特效藥物[1-2]。

中國(guó)藥典2020年版、美國(guó)藥典、歐洲藥典均收錄了生色底物法測(cè)定肝素鈉的效價(jià)[3-5]，文獻(xiàn)所報(bào)道的內(nèi)容多側(cè)重于生色底物法與兔全血法進(jìn)行方法對(duì)比[6-7]，抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子反應(yīng)特性[8-9]，減少實(shí)驗(yàn)試劑用量的研究[10-12]等。本研究使用兩種不同的測(cè)試手段進(jìn)行生色底物實(shí)驗(yàn)，考察兩種手段的實(shí)驗(yàn)特性，對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給實(shí)驗(yàn)室提供更加合適的實(shí)驗(yàn)方案。

實(shí)驗(yàn)生色底物法利用生色底物在特定可見光下的吸光度來定量反應(yīng)程度，可見光和吸光度可以由紫外可見分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀兩種技術(shù)手段提供，由于方法采用了生物檢定量反應(yīng)的平行線法，考慮酶標(biāo)儀樣品池恒溫并且一次多量的讀數(shù)方式更為便捷，但得到的數(shù)據(jù)可信限率經(jīng)常在5%以上[6-7]。采用紫外可見分光光度計(jì)需配備另外的恒溫裝置，由于紫外可見分光光度計(jì)所需求的待測(cè)溶液量較大，操作方法更復(fù)雜，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)成本也較高。實(shí)驗(yàn)室擬考察采用紫外可見分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀兩種方法，對(duì)比它們的便捷程度、實(shí)驗(yàn)成本、結(jié)果可靠信和可信限率。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

血液中Ⅱa因子和Ⅹa因子起到了凝血作用的90%以上，生色底物法就是測(cè)定肝素鈉抗Ⅱa因子活性和抗Ⅹa因子活性。肝素鈉激活抗凝血酶，被激活的抗凝血酶與加入的凝血酶反應(yīng)，隨即在體系中加入過量的生色底物，底物與未發(fā)生反應(yīng)的抗凝血酶結(jié)合，而體系中剩余的生色底物在一定的波長(zhǎng)下有光吸收，可經(jīng)過測(cè)定定量，即可反推出體系中的抗凝血作用量[9-11]。原理示意圖見圖1。

圖1 生色底物實(shí)驗(yàn)原理示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

UV2550/UV2700型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；Spectra Max M2型酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular公司）；中國(guó)藥典生物鑒定統(tǒng)計(jì)程序BS2000。

發(fā)色底物S-2238和S-2765、抗凝血酶Ⅲ（10 IU）、Ⅹa因子（71 nkat）（Chromogenix公司）；Ⅱa因子（580 IU，Hyphen BioMed公司）；三羥基氨基甲烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司-沃凱）；聚乙二醇6000（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；肝素鈉原料藥（東營(yíng)天東制藥有限公司提供）；肝素鈉注射液（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1）紫外可見分光光度法（UV-VIS） 根據(jù)CHP2020，抗Ⅱa因子效價(jià)測(cè)定：樣品與標(biāo)準(zhǔn)品分別配置成0.023 0、0.017 2、0.012 9、0.009 7 IU/mL的待測(cè)液，抗凝血酶0.25 IU/mL，凝血酶5 IU/mL，底物0.625 mmol/L。使用紫外可見分光光度法，反應(yīng)在37 ℃恒溫水浴中進(jìn)行，順次加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品100 μL，抗凝血酶100 μL，凝血酶200 μL，底物 200 μL，反應(yīng)終止劑50%醋酸200 μL，每隔12 s順次加入反應(yīng)試劑。在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，需平行測(cè)定兩次。

2）酶標(biāo)儀法（ELIASA） 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品分別配置成0.023 0、0.017 2、0.012 9、0.009 7 IU/mL的待測(cè)液，抗凝血酶0.25 IU/mL，凝血酶5 IU/mL，底物0.625 mmol/L。使用酶標(biāo)儀，反應(yīng)溫度37 ℃，利用酶標(biāo)儀自帶的加熱搖勻功能混勻。順次加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品25 μL，抗凝血酶25 μL，凝血酶 50 μL（16 IU/mL），底物 50 μL，反應(yīng)終止劑50%醋酸200 μL，反應(yīng)試劑的加入采用8通道移液槍差量加入法。在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定兩次。

3）抗Ⅹa因子效價(jià)測(cè)定 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品分別配置成0.049 0、0.034 3、0.024 0、0.016 8 IU/mL的待測(cè)液，抗凝血酶1 IU/mL，Ⅹa因子0.4 IU/mL，底物1 mmol/L。反應(yīng)方法參考抗Ⅱa因子效價(jià)測(cè)定方法[3]。

檢測(cè)數(shù)據(jù)通過BS2000統(tǒng)計(jì)得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸P值小于0.01，偏離平行P值大于0.05，二次曲線P值大于0.05，反向二次曲線P值大于0.05，且可信限率（FL）小于10%時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有效。

2 結(jié)果

2.1 UV-VIS測(cè)定肝素鈉效價(jià)

測(cè)定了3批原料藥和3批針劑的抗Ⅱa因子效價(jià)（表1）和Ⅹa因子效價(jià)（表2）。其線性回歸、偏離平行、二次曲線和反向二次曲線的P值均達(dá)到中國(guó)藥典2020年版四部通則1431生物檢定統(tǒng)計(jì)法可靠性測(cè)驗(yàn)的要求，而可信限率值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小。

表1 UV-VIS測(cè)定抗Ⅱa因子效價(jià)

表2 UV-VIS測(cè)定抗Ⅹa因子效價(jià)

2.2 ELIASA測(cè)定肝素鈉效價(jià)

同樣測(cè)定了3批原料藥和3批針劑的抗Ⅱa因子效價(jià)（表3）和Ⅹa因子效價(jià)（表4）。其線性回歸、偏離平行、二次曲線和反向二次曲線P值均達(dá)到要求，可信限率值小于10 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4 %。

表3 ELIASA測(cè)定抗Ⅱa因子效價(jià)

表4 ELIASA測(cè)定抗Ⅹa因子效價(jià)

2.3 兩種方法結(jié)果對(duì)比

兩種檢測(cè)方法所獲數(shù)據(jù)的對(duì)比表明，其所測(cè)效價(jià)較一致，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2%左右。UV-VIS的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差比ELIASA小2%左右，其實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性較好；UVVIS的可信限率較ELIASA小5%，故其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較準(zhǔn)確可信。不過，ELIASA的檢測(cè)用時(shí)明顯小于UV-VIS（表5）。

表5 兩方法測(cè)定肝素鈉效價(jià)的比較

3 討論

相較于文獻(xiàn)中使用更多的ELIASA測(cè)定法[6-10]，UV-VIS的可信限率明顯更低，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較準(zhǔn)確可信。UVVIS法需按待測(cè)順序每隔12 s順次加入反應(yīng)試劑，并進(jìn)行手動(dòng)混均，共計(jì)54次，對(duì)時(shí)間準(zhǔn)確性要求和實(shí)驗(yàn)人員操作要求較高。

UV-VIS由于需要的待測(cè)溶液量較大，所以實(shí)驗(yàn)成本較高，但在使用了石英黑壁微量比色皿，并在樣品池中加墊片后可大大減少待測(cè)溶液用量，大幅降低實(shí)驗(yàn)成本，可彌補(bǔ)UV-VIS試劑成本較高的缺陷。

無論采用UV-VIS還是ELIASA，生色底物法測(cè)定肝素鈉效價(jià)可獲得較精準(zhǔn)的測(cè)定數(shù)據(jù)，所采用的儀器設(shè)備和試劑試液相較于生物測(cè)定兔全血法更易于操作控制，實(shí)驗(yàn)誤差可控。兩種方法均可獲得可靠有效的檢測(cè)數(shù)據(jù)，有較好的實(shí)驗(yàn)室可行性。同時(shí)對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)方法的不斷優(yōu)化提出了進(jìn)一步要求，即進(jìn)一步降低UV-VIS法操作難度，進(jìn)一步降低ELIASA測(cè)定法的可信限率等。