常 霞，楊凱業(yè)，韓 萍，劉光榮，劉曉英，杜志云＊＊

（1.廣東工業(yè)大學生物醫(yī)藥學院 廣州 510006；2.無限極（中國）有限公司 江門 529000；3.佛山市康伲愛倫生物技術(shù)有限公司 佛山 528231）

皮膚色素沉著是人體皮膚由于多種原因損傷而使皮膚呈現(xiàn)不同顏色、不同范圍及深淺各異的色素變化，是一種常見的多發(fā)性皮膚疾病[1-2]。皮膚色素沉著主要是由表皮黑素細胞產(chǎn)生的黑色素的結(jié)果，黑素細胞活性、黑色素的類型和分布，是皮膚色素沉著多樣性的主要驅(qū)動因素[3-4]。皮膚色素沉著病因復雜，紫外曬傷、黑色素合成異常、氧化損傷、炎癥反應及內(nèi)分泌異常等均影響皮膚色素沉著[5]。黃褐斑、曬斑、炎癥后色素沉著等常見皮膚色素沉著疾病，不僅損傷了患者皮膚的健康和美觀，還對其心理健康造成極大危害。目前，常采用激光的方法進行皮膚色素沉著的治療，但該方法具有色素去除不徹底、形成永久斑點和皮膚損傷等問題，而氫醌、氨甲環(huán)酸等藥物也具有過敏和干燥的副作用，不能長期使用。鑒于目前皮膚色素沉著治療效果不理想、難以根治的現(xiàn)狀，開發(fā)新型抗皮膚色素沉著的藥物迫在眉睫。

紅花（Carthamus tinctorius L.）又稱草紅花或刺紅花，在歷代醫(yī)書及《本草綱目》中均有詳細記載，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛的效果，現(xiàn)常用于心血管、痛經(jīng)閉經(jīng)和跌打損傷等疾病[6]。紅花主要化學成分是紅花甙、前紅花甙、紅花黃色素、綠原酸、兒茶酚等。它是應用最廣泛的活血化瘀藥劑之一[7]，在皮膚方面，紅花可減輕皮膚氧化損傷，治療硬皮病，促進和毛發(fā)生長[8-10]，酪氨酸酶（Tyrosinase,TYR）是黑色素合成關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，近期有報道紅花中的黃色素具有抑制TYR的作用，呈劑量依賴性[11]，紅花種子乙酸乙酯組分對蘑菇酪氨酸酶有明顯的抑制作用[12]，紅花和丹參中原兒茶醛、羥基紅花黃和丹參酮具有較高的TYR抑制活性[13]，臨床上，研究應用口服紅花逍遙片，同時配合氨甲環(huán)酸片和激光的治療策略，能有效淡化患者色斑，降低復發(fā)率與不良反應發(fā)生率[14]。然而，紅花調(diào)控皮膚色素沉著的研究主要集中于不同活性物對TYR的調(diào)控，對于皮膚色素調(diào)控機制研究相對較少，限制了紅花在皮膚色素調(diào)控中應用。本研究首次利用網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合蛋白芯片的方式對紅花調(diào)控皮膚色素沉著的調(diào)控機制進行初步研究，通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺數(shù)據(jù)庫查找紅花活性物和皮膚色素沉著的靶標，并構(gòu)建“成分-靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)，分析篩選出紅花調(diào)控色素沉著的關(guān)鍵靶點和通路，并采用動物模型和蛋白芯片的檢測方式，對部分調(diào)控靶點進行驗證，為進一步研究紅花治療抗色素沉著疾病的作用機制提供理論基礎(chǔ)（圖1）。

圖1 紅花調(diào)控皮膚色素沉著研究的流程圖

1 資料與方法

1.1 紅花相關(guān)靶點的篩選

以紅花作為關(guān)鍵詞，在TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和SymMap（http://www.symmap.org/）收集紅花的活性成分，篩選標準為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，同時收集和整理出活性成分對應的靶標。

1.2 色素沉著相關(guān)靶點的篩選

以“skin hyperpigmentation”和“skin pigmentation”為關(guān)鍵詞，通過Gencards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）以Relevance score＞20為原則選取目標靶點，參考相關(guān)文獻對未篩選的靶點進行補充，刪除重復值后得到與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的靶點。隨后，利用Venny 2.1.0繪制韋恩圖，獲得紅花治療皮膚色素沉著的交集靶點。

1.3 蛋白相互作用PPI圖

利用STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）對交集的靶點進行蛋白相互作用分析，獲得潛在靶點的相互作用的圖，可根據(jù)相互作用的邊的數(shù)量，預估靶點的重要性。

1.4 通路富集分析

將紅花調(diào)控皮膚色素沉著的交集靶點導入David信息平臺（https://david.ncifcrf.gov/），設(shè)置閾值為P＜0.05，進行KEGG信號通路富集分析。隨后利用PubMed數(shù)據(jù)庫對通路進行搜索，去除與皮膚色素沉著文獻報道不相關(guān)的通路，最后獲得紅花調(diào)控皮膚色素沉著的潛在調(diào)控通路。

1.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化

1.6 動物實驗

1.6.1 動物

健康成年的花色Hartly豚鼠，SPF級，雌性，8周齡，體質(zhì)量250±80 g，24只，采購自廣東醫(yī)學院實驗動物中心（44007200086389）。實驗動物采取自由進食和飲水，飼養(yǎng)條件溫度為18-25℃，相對濕度為50%-70%。

1.6.2 試劑和儀器

抗MITF（microphthalmia-associated transcription factor，MITF），抗p38，抗 磷 酸 化p38，抗ERK（extracellular signal regulated kinase，ERK），抗磷酸化ERK，抗JNK（C-Jun,N-terminal kinase，JNK），抗磷酸化JNK，購自Affinity，根據(jù)提供的抗體，定制蛋白芯片（生物素標記的抗體陣列，載玻片格式）由RayBiotech（廣州RayBiotech，中國廣州，20190818）制備。硫化鈉、乙醇，無錫市展望化工試劑有限公司；紅花，北京同仁堂。

FA1004電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；離心機Z326K，德國Hermle公司；北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.6.3 樣品制備

將紅花經(jīng)粉碎過14目藥典篩，取50 g碎粉，按料液比（g·mL-1）為1:20加入70%乙醇溶液，經(jīng)超聲波在常溫條件下處理30 min后，再置于80℃保溫提取1.5 h，提取液經(jīng)過濾離心，于60℃濃縮至含生藥量為1 g·mL-1的紅花粗提取物，將其置于4℃冰箱密封保存，備用。

1.6.4 UVB照射豚鼠動物造模、分組及給藥

當前微課、慕課建設(shè)潮流已經(jīng)形成，各高校和中小學也投入了相當物力和人力，但教育資源形成后又難以融入日常教學體系，如果不能進入應用的良性循環(huán)之中，而是陷入制作——待用——擱置乃至最后失去使用價值的不良循環(huán)中，這無疑是巨大浪費。

參考文獻[15]方法構(gòu)建豚鼠皮膚色素沉著動物模型，豚鼠分為3組，空白組，模型組，紅花實驗組，每組6只。剃除豚鼠頸背部位置的毛發(fā)，直至完全顯露，為保證效果，顯露部分皮膚用濃度為6%硫化鈉涂抹在豚鼠上述位置，使絨毛充分脫掉，選擇1.5 cm×1.5 cm獨立的棕色皮膚區(qū)域，模型組和實驗組每日20 min UVB照射，照射10天，照射區(qū)域的色素明顯加深，皮膚粗糙脫屑，色素沉著的模型造模成功。實驗組開始涂抹給藥，紅花組涂抹100 μL（200 μg·mL-1）每天1次，持續(xù)20天。實驗結(jié)束后，對老鼠背部的皮膚進行拍照，隨后老鼠脫頸處死，分別取其脫毛部位皮膚組織，將皮膚組織分為2份，1份用于Fontana-Masson染色，1份放置-80℃保存，用于后續(xù)檢測。

1.6.5 蛋白芯片法檢測靶蛋白的表達

稱取皮膚組織0.1 g，加入裂解液制成勻漿，離心機12000 r·min-1離心15 min，吸取上清液，-20℃保存，BCA法測定蛋白濃度，隨后根據(jù)美國Raybiotech公司定制的抗體蛋白芯片操作方法進行測試，添加生物素對蛋白進行標記，將標記的蛋白稀釋到500μg·mL-1，與載有抗體的蛋白芯片過夜孵化。洗滌后，用Cy3標記的親和素混合物共同孵育2 h，隨后用InnoScan 300芯片掃描蛋白芯片，檢測熒光信號，用內(nèi)部陽性對照和RayBiotech分析工具對信號進行讀取和歸一化。

1.6.6 統(tǒng)計學處理

組織的染色圖片采用Image Pro Plus6.0軟件對圖像進行分析，計算表皮基底層黑色素細胞的積分光密度（光密度和切片面積的比值）；芯片信號選取可信值進行數(shù)據(jù)分析及對比，用SPSS19.0軟件統(tǒng)計分析，并采用t檢驗分析顯著性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 紅花的有效成分及其作用靶點的篩選

通過TCMSP平臺，分別以紅花為關(guān)鍵詞進行篩選，篩選標準為OB≥30%，DL≥0.18，共獲得22個成分（表1）。利用TCMSP平臺和SymMap平臺，分別對成分的靶點進行收集和去重，有2個成分6-Hydroxynaringenin和lupeol-palmitate，未收集到調(diào)控靶點，最后共得到20個成分的351個靶點。目前TCMSP是中藥主要查詢平臺，部分活性物收錄不全，存在局限性，研究中同時結(jié)合SymMap平臺進行活性物靶點的補充。

2.2 紅花調(diào)控色素沉著的“成分-靶點”預測

以“skin hyperpigmentation”和“skin pigmentation”為關(guān)鍵詞，通過Gencards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫篩選靶點刪除重復項，共獲得12122個靶點；以Relevance score＞20為原則選取目標靶點，獲得203個疾病靶點。紅花活性成分的靶點和色素沉著的靶點利用Venny 2.1.0進行交集分析，并繪制韋恩圖，獲得潛在作用靶點26個（圖2）。

圖2 紅花與皮膚色素沉著交互的26個靶點

2.3 潛在靶點的PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析

紅花調(diào)控皮膚色素沉著交集靶點蛋白相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)見圖3，包含26個蛋白節(jié)點，224條相互作用的關(guān)系。從圖中可以看出，關(guān)鍵節(jié)點主要包括Akt1（protein kinase B,Akt1）、VEGFA（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、TP53（Transformation-Related Protein 53,TP53）、EGFR（epidermal growth factor receptor,EGFR）、MAPK1（mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1/ERK2）、TNF（tumor necrosis factor,TNF）、IGF1（Insulin-like growth factor 1,IGF-1）等，這些靶點可能是紅花調(diào)控皮膚色素沉著的的核心靶點。

圖3 潛在靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 通路富集分析

利用David數(shù)據(jù)庫對紅花及皮膚色素沉著的候選作用靶點進行富集分析。KEGG通路分析篩選得到146條通路（P＜0.05），結(jié)合文獻檢索出色素沉著調(diào)控相關(guān)的通路，將無文獻報道通路剔除，共得到10個色素調(diào)控機制相關(guān)的通路。按通路富集的靶點數(shù)（n）進行排序見表2。

表2 通路富集分析信息

2.5 Cytoscape網(wǎng)絡(luò)圖

將紅花有效成分、共同靶點、疾病通路信息上傳Cytoscape 3.7.2得到有效成分-靶點-疾病通路網(wǎng)絡(luò)圖。紅花中調(diào)控皮膚色沉著的主要活性物有9個，根據(jù)節(jié)點的度值和此節(jié)點邊的條數(shù)進行分析，均排名前3的活性物分別為槲皮素（24）、木犀草素（13）、黃芩素（9），提示以上成分是紅花調(diào)控色素沉著的潛在活性成分；紅花調(diào)控皮膚色素沉著的交集靶點26個，根據(jù)靶點與活性成分相互作用的次數(shù)進行排序，排名前4的靶點分別為AKT1、TNF、MAPK1、VEGFA，提示以上靶點是潛在調(diào)控皮膚色素沉著的關(guān)鍵靶點；根據(jù)KEGG通路富集分析的P值排序，排名前6為的通路分別為黑色素瘤、EGFR、P13K-Akt、MAPK、HIF-1和TLR信號通路，提示以上信號通路的可能性與準確性較高。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果，后續(xù)動物實驗選擇MAPK1靶點及MAPK通路作為驗證的目標（圖4）。

圖4 紅花成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 紅花抗皮膚色素沉著動物實驗

皮膚組織的黑色素染色的結(jié)果見圖5，空白組的在基底層、棘皮層和毛囊有少數(shù)黑素顆粒（a），模型組的基底層和棘皮層可見大量的黑素顆粒，呈現(xiàn)連續(xù)分布（b），紅花組在基底層可見少量的黑素顆粒（c）。利用軟件計算表皮基底層黑色素細胞的積分光密度（d），模型組與空白組的積分光密度差異顯著（P＜0.01），相對于模型組，紅花組的黑素顆粒積分光密度顯著降低（P＜0.05）。

圖5 豚鼠皮膚組織的Fontana-Masson染色圖和積分光密度（200×）

利用蛋白芯片檢測皮損組織中相關(guān)色素沉著的MAPK/MITF通路靶點的熒光信號數(shù)值，每個樣品有3個熒光信號。其中不同組之間的相對于模型組的信號差異見表3。其中空白組與模型組相比，模型組的MITF（P＜0.05），p-ERK（P＜0.05）表達量顯著上調(diào)。紅花組與模型組相比，紅花組的MITF（P＜0.01）、p38（P＜0.05）、p-p38（P＜0.01）、p-ERK（P＜0.05）、p-JNK（P＜0.05）的表達均顯著下調(diào)。蛋白芯片的結(jié)果驗證了紅花可通過調(diào)控MAPK通路的靶點，進而抑制MITF的表達，減輕皮膚色素沉著的作用。

表3 色素沉著蛋白芯片的熒光信號數(shù)值（xˉ±s，n=6）

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學利用分析藥物與疾病相關(guān)的通路靶點，可預測藥物的治療效果，具有提高新藥臨床試驗的成功率，節(jié)省藥物的研發(fā)費用的優(yōu)勢[16]，通過參考網(wǎng)絡(luò)藥理學評價方法指南，將不同平臺數(shù)據(jù)信息收集和分析，利用該方法進行紅花治療皮膚色素沉著調(diào)控機制的探索，指導后續(xù)實驗驗證[17-18]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，預測出紅花治療皮膚色素沉著的功效成分20個，分別為槲皮素、黃芩素、山奈酚、兒茶素、芍藥苷、β-谷甾醇、豆甾醇等，其中槲皮素、木犀草素、黃芩素的作用靶點較多，可能是紅花潛在的作用成分。槲皮素具有抗氧化、抗炎、降血壓、降血糖、抑制癌細胞生長等功效，在色素調(diào)控方面，槲皮素以競爭性抑制劑的形式與TYR相互作用[19]，槲皮素對黑素細胞沒有殺傷作用，其抗炎和抗氧化的功能，可保護黑素細胞損傷[20]。黃芩素通過激活MAPK中ERK信號通路抑制黑素生成，同時黃芩素可通過激活轉(zhuǎn)錄因子2（Nrf 2）信號通路，保護黑色素細胞免受氧化應激損傷[21-22]。木犀草素具有抗炎和抗敏的功效，木犀草素可通過抑制CREB和MITF介導的TYR的表達來抑制黑色素的合成[23]。由此可見紅花中的活性成分，具有抗炎，抗氧化的效果，同時參與黑色素合成調(diào)控和抑制TYR的效果，并對黑素細胞沒有損傷，沒有影響到皮膚黑色素細胞的正常生理功能。

紅花活性成分收集到351個靶點和26個交集靶點，蛋白相互作用于KEGG分析，預測紅花參與色素沉著的主要調(diào)控通路有黑色素瘤、P13K-Akt、MAPK、EGFR、HIF-1和TLR信號通路，關(guān)鍵靶點為Akt1、TP53、EGFR、MAPK1、VEGFA、TNF。皮膚色素沉著與黑色素瘤調(diào)控密切相關(guān)，皮膚惡性黑色素瘤風險的增加與色素沉著基因的變異有關(guān)。Akt1可與PI3K產(chǎn)生級聯(lián)反應，可保護黑素細胞免于凋亡[24]，PI3K/AKT通路在黑素細胞存活中起著關(guān)鍵作用。MITF是黑色素合成的主要的調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控TYR、TRP-1、TRP-2，促進黑色素的合成，其受體介導MAPK信號通路，其中ERK、JNK和p38是MAPK通 路 的 關(guān) 鍵 蛋 白。MAPK1又名ERK2，他是MAPK信號通路中的關(guān)鍵靶點，臨床上藥物大沙替尼就是調(diào)節(jié)ERK/CREB/MITF通路抑制正常人黑素細胞中的信號轉(zhuǎn)導[25]。表皮生長因子EGF及其信號通路抑制激光誘導的黑色素生成[26]，外泌體miR-21對紫外線刺激的黑色素生成的抑制作用可能與EGFR的激活有關(guān)[27]。臨床實驗中EGF軟膏可作為激光治療曬傷的有效輔助手段[28]。p53在曬黑反應和病理性色素沉著中的發(fā)揮重要作用，p53直接調(diào)控紫外線誘導產(chǎn)生的POMC/MSH的表達[29]，同時p53是調(diào)控角質(zhì)細胞-黑色素細胞信號周期的重要組成部分[30]。HIF-1通路與細胞氧化損傷相關(guān)，通過抑制缺氧引起的HIF-1α蛋白上調(diào)，可抑制黑色素瘤細胞A375增殖和遷移[31]，UVB通過p38/HIF-1通路可誘導人角質(zhì)形成細胞的凋亡[32]。黑色素生成能顯著刺激血管生成的表達[33]，正常人黑素細胞VEGFR-2表達顯著上調(diào)，臨床發(fā)現(xiàn)黃褐斑皮損部位真皮血管密度增加和VEGF過度表達的現(xiàn)象[33]。最新研究表明，天然免疫刺激通過TLRs影響黑素合成和黑素小體運輸，調(diào)節(jié)皮膚色素沉著，其中TLR4和TLR9分別通過p38和NF-κB信號通路促進酪氨酸酶的表達和黑素生成[35]。TNF腫瘤壞死因子與IL-17聯(lián)合PKA和MAPK信號通路抑制黑色素的形成[36]。預測的結(jié)果和已有的研究發(fā)現(xiàn)，紅花參與色素沉著的調(diào)控的信號通路和靶點大都涉及細胞代謝、黑色素合成、光損傷、氧化應激、免疫調(diào)控等環(huán)節(jié)。

為了驗證網(wǎng)絡(luò)藥理的部分預測結(jié)果，本研究檢測了豚鼠皮膚組織中黑色素合成相關(guān)的MAPK通路相關(guān)靶點，包含MITF、ERK、p38、JNK等。結(jié)果表明：紅花提取物能使減輕紫外誘導的豚鼠皮膚色素顏色及損傷的癥狀，降低皮膚組織中MITF、p-ERK、p-p38、p-JNN蛋白的表達，此結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學的預測結(jié)果一致。

綜上所述，本研究初步揭示了紅花治療皮膚色素沉著的潛在活性成分及其可能的作用機制，紅花中槲皮素、木犀草素、黃芩素為潛在色素沉著的藥效成分，其潛在的調(diào)控靶點為Akt1、IL-6、VEGFA、MAPK1等，主要涉及的通路有黑色素瘤、PI3K-Akt、MAPK、TLR和HIF-1信號通路等，網(wǎng)絡(luò)藥理的分析結(jié)果預測了紅花通過抑制黑色素合成、減輕氧化損傷、抑制炎癥反應發(fā)揮治療皮膚色素沉著的作用，并進一步經(jīng)實驗證實，紅花可通過抑制MAPK/MITF通路中蛋白的表達，發(fā)揮治療皮膚色素沉著的功效，紅花在色素沉著中關(guān)于氧化應激和免疫調(diào)控功效驗證，以及紅花中主要活性成分的物質(zhì)基礎(chǔ)分析和應用還有待深入研究，本研究可為進一步紅花治療皮膚色素沉著的調(diào)控機制和應用研究提供參考。