劉永祥，蔡炳，許言，曾艷紅，周少虎，麥慶云*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，廣州 510405；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 510080

β-地中海貧血是由于基因點突變或移碼導(dǎo)致β珠蛋白肽鏈合成不足的一種遺傳性血紅蛋白病。據(jù)HbVar 數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，全球已發(fā)現(xiàn)300 多種突變類型[1]，其中，CD41/42（-CTTT）、CD17（A＞T）和IVS2-654（C＞T）構(gòu)成的突變，是最常見的β 突變類型[2]。β 珠蛋白基因的CD17 (A＞T）點突變是最早報道的與β 地貧相關(guān)的點突變之一。地中海貧血可通過骨髓或造血干細胞治療，但費用昂貴且很難尋找匹配的供者。近年來隨著CRISPR-Cas9 技術(shù)的發(fā)展，基因治療已成為重要的方向，但編輯效率很低，實驗重復(fù)性較差。“CORRECT”編輯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，在CRISPR/Cas9 靶向所需序列內(nèi)插入同義突變堿基到同源定向修復(fù)（homology-directed repair,HDR）修復(fù)模板中，可以在很大程度上阻止不良的再次編輯，提高ssODNs 的整合效率[3,4]。因此，本研究擬利用“CORRECT”新技術(shù)獲得β-地貧CD17（A＞T）突變基因型的HEK293T 細胞系，以期建立一種高效的基因點突變新方法，為后續(xù)的基因功能研究以及基因修復(fù)方法提供更有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和質(zhì)粒 HEK293T 細胞購自ATCC 細胞 庫，CRISPR/Cas9質(zhì)粒PX459（pSpCas9-2A-Puro（PX459）V2.0）購自Addgene。

1.1.2 主要試劑BbsI、T7E I、KspA I、T4 連接酶、T4磷酸化酶（New England Biolabs）；sgRNA 寡核苷酸鏈（生工生物）；4D-Nucleofector?電轉(zhuǎn)試劑盒（Lonza）；單鏈供體寡核苷酸（Genewiz）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco）；FBS 胎牛血清（Hyclone）。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA 的設(shè)計與Cas9-sgRNA 載體構(gòu)建 (1)根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫人類HBB（Gene ID: 3043）的基因序列，使用靶點在線設(shè)計網(wǎng)站https://zlab.bio/guidedesign-resources 設(shè)計sgRNA 靶點：HBB-sgRNA1（5’-CACGTTCACCTTGCCCCACA-3’）和HBB-sgRNA2（5’-CCTGTGGGGCAAGGTGAACG-3’）。在實驗中，我們也把sgRNA1稱為Correct1，sgRNA2稱為Correct2。(2) 根據(jù)靶點序列合成正負鏈sgRNA 引物，并在引物5'端加上BbsI酶切位點的黏性末端，正向引物：CACC-（N）20，反向引物：AAAC-（N）20R。利用T4磷酸化酶進行5'端磷酸化修飾，并經(jīng)退火（37 ℃，30 min；95 ℃，10 min）形成雙鏈片段，用于后續(xù)實驗。(3) 取100 ng經(jīng)BbsI酶切線性化的PX459 載體與2 μL上述磷酸化后的sgRNA 雙鏈用1 μL T4 連接酶，16℃過夜連接。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α 中，涂布于含氨芐抗性的LB 固體培養(yǎng)基37 ℃進行培養(yǎng)16～18 h。次日挑取單克隆菌落，37 ℃搖床擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測序鑒定陽性克隆。

1.2.2 ssODN 序列合成 ssODN 作為外源性同源重組修復(fù)模板，主要取sgRNA 靶點上下游各50 bp 序列，替換上CD17（A＞T）點突變堿基，同時依據(jù)氨基酸的簡并性，在PAM 序列附近引入同義突變堿基（G＞T）。2 條ssODNs 如下（突變堿基用小寫字母表示）：正 向 donor1（5’-ATGGTGCATCTGACTCCTGAG GAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCtAGGT tAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGC AGGTTGGTAT-3’）和反向donor2（5’-ATACCAA CCTGCCCAGGGCCTCACCACCAACTTCATCCACG TTaACCTaGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTT CTCCTCAGGAGTCAGATGCACCAT-3’）。

1.2.3 電轉(zhuǎn)染 通過消化處理得到的單細胞懸液按照Lonza 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將輕輕混勻的電轉(zhuǎn)混合液（82 μL 電轉(zhuǎn)液I、18 μL 的電轉(zhuǎn)液Ⅱ、PX459-sgRNACas9 共表達載體、donor）轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，上機程序參照說明書。電轉(zhuǎn)后，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

1.2.4 sgRNA 靶點有效性檢測 為了驗證不同靶點的切割效率和ssODN 的整合效率，將實驗分為5組：①Correct1+donor1；②Correct1+donor2；③Correct2+donor1；④ Correct2+donor2；⑤以及陽性對照組Sacas9+L+R+saDonor。將各組電轉(zhuǎn)染24 h 后用含有0.6 μg/mL Puro 的無血清培養(yǎng)基進行藥篩，培養(yǎng)48 h后收取細胞，提取DNA 進行PCR 擴增出包含靶點序列在內(nèi)的DNA 片段，最后取200 ng PCR 產(chǎn)物通過T7EI和KspA I雙酶切實驗，比較各組切割效率與整合效率。PCR 引物為HBB-FP：5'-GCAATTTGTACTGA TGGTATGG-3'；HBB-RP：5'-ATAACAGCATCAGGAG TGGAC-3'。

1.2.5 單克隆細胞篩選與測序 根據(jù)酶切實驗的結(jié)果，選擇整合效率最高的實驗組采用計數(shù)稀釋接種的方法進行單克隆篩選，吸取部分擴大培養(yǎng)后的單克隆集落細胞按照DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，PCR 擴增后測序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 PX459-sgRNA-Cas9 共表達載體的構(gòu)建

CRISPR/Cas9 原質(zhì)粒PX459 大小為9175 bp，如圖1 瓊脂糖凝膠電泳條帶2 所示，利用BbsI酶將PX459切成9153 bp 和22 bp 兩段。條帶1 原質(zhì)粒有2 條條帶，與質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)和線性3 種構(gòu)型吻合。條帶2 酶切后質(zhì)粒呈線性化狀態(tài)，且片段大小符合預(yù)期位置。回收線性化的PX459 載體并分別與退火后的sgRNA 連接，轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單克隆、提取重組質(zhì)粒并測序驗證。

圖1 PX459 質(zhì)粒Bbs I酶切結(jié)果Fig.1 PX459 plasmid digestion by Bbs I enzyme

2.2 電轉(zhuǎn)染效率

在HEK293T 細胞中電轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）質(zhì)粒，24 h 后觀察GFP 的表達情況，評估電轉(zhuǎn)染效率（圖2）。熒光顯微鏡下觀察，電轉(zhuǎn)染1 μg GFP 質(zhì)粒細胞中GFP 表達最少，不到20%。而電轉(zhuǎn)染2 μg 質(zhì)粒則表達GFP 的細胞比例達到90%，轉(zhuǎn)染效率較高。電轉(zhuǎn)染3 μg 質(zhì)粒表達GFP 的細胞比例達到95%以上。因此，為了減少電轉(zhuǎn)染的毒性又達到較好的電轉(zhuǎn)染效果，最終選擇了電轉(zhuǎn)染2 μg質(zhì)粒的量進行后續(xù)實驗。

圖2 HEK293T 細胞轉(zhuǎn)染GFP 質(zhì)粒的效率檢測 A: 電轉(zhuǎn)染1 μg GFP 質(zhì)粒B: 電轉(zhuǎn)染2 μg GFP 質(zhì)粒C: 電轉(zhuǎn)染3 μg GFP 質(zhì)粒Fig.2 Transfected efficiency detection of GFP in HEK293T cells A: 1 μg GFP plasmid; B: 2 μg GFP plasmid; C: 3 μg GFP plasmid

2.3 HBB 基因CD17（A＞T）點突變的HEK293T 細胞系的建立

2.3.1 雙酶切鑒定 T7EⅠ酶切割效率實驗：結(jié)果圖3-A 中顯示，PCR 總長度是578 bp，陽性對照組和各實驗組均被T7EⅠ切割，實驗組①～④酶切后分為3 條條帶：原有條帶578 bp，以及被切割后的340 bp 和238 bp 的兩條帶，結(jié)合灰度分析圖3-C，共同說明4組實驗組均有效率。

圖3 不同靶點和donors 編輯效率和整合效率比較A: T7E I 酶切電泳圖譜 B: KspA Ⅰ酶切電泳圖譜 C: T7E I 酶切電泳條帶灰度值分析 D: KspA Ⅰ酶切電泳條帶灰度值分析E: 不同靶點和不同donor 的整合效率比較F: 各組整合效率匯總表Fig.3 Comparison of editing efficiency and integration efficiency of different targets and donorsA: Electrophoresis patterns after T7E I digestion; B: Electrophoresis patterns after KspA Ⅰdigestion; C: Gray value analysis of image strip after T7E I digestion; D: Gray value analysis of image strip after KspA Ⅰdigestion; E:Comparison of integration efficiency of different targets and donors; F: Table of integration efficiency for each group

Donor 的整合效率（KspA Ⅰ酶切）實驗：當(dāng)donor 整合至目標(biāo)位置時，會被KspA Ⅰ酶識別并切割，如圖3-B的電泳圖所示，并結(jié)合圖3-D 膠圖灰度分析，對照組Sacas9組因donor 未引入KspA Ⅰ酶切位點，在切膠圖上表現(xiàn)為未切割，作為對照證明了Correct 方案可行，排除了實驗操作因素。結(jié)果顯示，4組實驗組均有KspA Ⅰ酶的切割效率，說明這4組均有donor 的整合，并圖3-E 和3-F 所示，實驗組③（Correct2+donor1）的整合效率最高，達到114.80%，而實驗組①、②、④分別為26.26%、34.22%和43.93%。值得注意的是實驗組③的整合效率計算后超過100%（理論上小于100%，因為切割后才有整合），可能是因為imageJ 軟件自身的敏感度缺陷所致。計算公式：整合效率＝（KspAⅠ酶切效率/T7EⅠ酶切效率）×100%，

2.3.2 測序鑒定 將野生型293T 細胞和四組實驗組的PCR 產(chǎn)物進行Sanger 測序，如圖4 所示，donor 作為同源模板與基因組DNA 發(fā)生了整合，這四組實驗組均引入了β-地中海貧血基因型CD17（A＞T）和同義突變堿基（G＞T），因未行單克隆挑選，故顯示為雜合的峰圖。

圖4 各組總細胞提DNA 后進行PCR 測序的峰圖藍箭頭示β17 致病點突變堿基(A＞T) 紅箭頭示同義突變堿基(G＞T)Fig.4 PCR sequencing after DNA extraction from total cells of each groupThe blue arrow showed β17 pathogenic point mutation base (A＞T),and the red arrow showed synonymous mutation base (G＞T)

2.4 地中海貧血β17（A＞T）點突變的單克隆293T 細胞系的建立

根據(jù)酶切實驗結(jié)果，實驗組③的整合效率最高，故對實驗組③的總體細胞進行單克隆篩選，PCR 擴增并測序鑒定。一共挑選12 個單克隆集落進行測序，獲得1 株含純合突變的單克隆細胞系，測序結(jié)果圖5顯示，單克隆293T 細胞系引入了β-地中海貧血CD17（A＞T）和同義突變（G＞T）堿基。另外，12 個單克隆中還包含2 個雜合突變以及9 個無相應(yīng)堿基突變的野生型單克隆。

圖5 野生型293T 細胞與β17 突變型單克隆293T 細胞系的測序峰圖藍箭頭示β17 致病點突變堿基(A＞T) 紅箭頭示同義突變堿基(G＞T)Fig.5 Sequencing of wild-type 293T cells verse β17 mutant monoclonal 293T cellsThe blue arrow showed β17 pathogenic point mutation base (A＞T),and the red arrow showed synonymous mutation base (G＞T)

3 討論

全球有超過50000 種人類遺傳疾病，大部分是由基因點突變引起的。因此，對基因組點突變的研究不僅能揭示重要的生物學(xué)機理，更有利于人類疾病治療手段的開發(fā)。CRISPR/Cas9 是一種新興的基因編輯工具，與傳統(tǒng)ZFN 和TALEN 兩種人工核酸酶相比具有編輯效率高、操作簡便、定點編輯等優(yōu)點，因此也被廣泛用于基因缺陷細胞和動物模型的構(gòu)建。

構(gòu)建點突變主要分為兩類，一類是對基因組DNA 產(chǎn)生雙鏈斷裂并通過同源重組的方式引入突變位點。在sgRNA 的靶向定位下，DNA 雙鏈被Cas9 精確剪切，如果引入一個攜帶靶片段同源臂和突變位點序列的模板，將會通過同源重組實現(xiàn)片段插入或定點突變[5]。第二類就是堿基編輯器，也屬于CRISPR 技術(shù)的一種，通過對Cas 蛋白的改造，使其只具有切割DNA 單鏈的能力，結(jié)合堿基脫氨酶的催化活性，實現(xiàn)核酸鏈上特定位點堿基的改變[6]。但堿基編輯器的發(fā)展與應(yīng)用尚不成熟，編輯效率較低，存在較高的脫靶率[7]。而且編輯窗口有限，無法進行任意四種堿基的互相替換，也無法解決堿基缺失和插入的基因致病突變類型，因此該方法仍需進一步的優(yōu)化與研究。

目前報道的基因修復(fù)方法大多是以dsDNA 質(zhì)粒為供體模板進行同源修復(fù)，但也有報道質(zhì)粒供體部分骨架（在同源臂之外）也整合到目標(biāo)基因組位點上[8]。這些不希望的骨架整合頻率在不同的位點之間有很大的差異，據(jù)報道甚至“從0 到100%不等”[9]。與雙鏈DNA(如質(zhì)粒或病毒載體) 修復(fù)機制不同，以單鏈寡核苷酸(ssODN)作為供體模板，ssODN 不參與NHEJ，因此不太可能插入非特異性裂解位點，不太可能隨機整合到基因組中，從而產(chǎn)生安全、精確的基因編輯[10]。Zorin等[11]發(fā)現(xiàn)，與質(zhì)粒等dsDNA 供體模板相比，單細胞綠藻萊茵衣藻中的ssODN 模板隨機整合到基因組中的傾向大大降低。此外，單鏈寡核苷酸更容易批量生產(chǎn)、更經(jīng)濟，具有高純度和安全特性。因此，相對于利用dsDNA 供體或其他遺傳操作進行小片段插入、缺失或點突變，利用ssODN 供體的CRISPR 技術(shù)是一種高效和引人注目的技術(shù)。在我們的實驗中，則應(yīng)用了“CORRECT”方法，在修復(fù)模板（ssODN）引入了同義突變的堿基，有效減少了Cas 蛋白的再次編輯，提高了編輯和整合效率。在我們的實驗中，4組實驗組的編輯效率均達到60%以上（圖3-C）。而從整合效率來看，Correct2 靶點顯示了較高的整合效率，達到40%以上。

利用CRISPR/Cas9 和ssODN 對人類遺傳疾病基因進行組合編輯是修復(fù)和產(chǎn)生點突變的有效策略。在可靠地將DNA 改變引入已建立的細胞系之后，這項技術(shù)又被推廣到體內(nèi)外的研究。Aarts等[12]在小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem，ES）細胞中，利用ssODNs 成功地在視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinoblastoma，Rb）中實現(xiàn)密碼子替換（N570F）。Niu等[13]指出，ssODN 與CRISPR/Cas9 結(jié)合能夠糾正在β-地貧誘導(dǎo)型多能干細胞（iPSCs）中的HBB基因CD41/42 突變。而“CORRECT”是Tessier等[3,4]發(fā)現(xiàn)的新方法，他們在人類干細胞中無瘢痕地引入與疾病相關(guān)的純合和雜合突變，并發(fā)現(xiàn)在編輯人iPSCs 時，高達95%的已編輯位點的序列會被再次編輯，造成額外的indel 突變破壞。因此，他們通過在PAM 序列（protospacer adjacent motif,PAM）附近整合能夠有效地阻斷多個位點的再次編輯的同義突變或致病突變，這些Casblocking 突變能以高效率與精度選擇性引入單等位或雙等位基因序列，使HDR 的編輯精度提高到每個等位基因的10 倍。在極端情況下，CORRECT 只需要挑選幾百個克隆，而如果不采用阻斷突變策略，則可能需要幾萬個克隆。他們還表示，最接近切割位點，其HDR 的整合效率最高。對于ssODN 的長度是否影響整合效率的問題，實驗中我們與其他研究者類似[4,14]，都使用短片段來進行單點突變的引入。在我們實驗中應(yīng)用了一段100 nt 的單鏈寡核苷酸（位于sgRNA 靶點上下游各50 nt），對于較高效率的Correct2（sgRNA2）靶點，實驗顯示正向的ssODN 整合效率更高。此外，有文獻報道，對于短片段（100 bp 內(nèi)）的插入，單鏈寡核苷酸要比雙鏈具有更高的插入效率[15]。

對于CRISPR/Cas9 而言，CORRECT編輯后細 胞系的脫靶分析同樣重要。但是，應(yīng)用了同樣的導(dǎo)向RNA，因此很可能不會擴大潛在脫靶位點的數(shù)量。但在多種細胞類型中多個基因組位點上的脫靶程度還有待闡明。本研究雖然沒有Western blot 檢測β 珠蛋白的表達，同時也沒有進行了基因點突變后細胞的功能驗證，但在方法學(xué)上為我們提供了一種高效的點突變的編輯方法，為后續(xù)的研究提供了堅實的模型基礎(chǔ)。

本研究成功將“CORRECT”方法應(yīng)用于293T 細胞系，獲得高效的地中海貧血癥β17 單堿基突變細胞系，發(fā)現(xiàn)同義突變的引入使得整合效率得到了極大的提高，并且有效減少在每個基因編輯階段手工挑選單克隆的時間。本研究對單堿基突變細胞系以及單堿基突變動物模型的建立具有重要意義。