劉亞峰 賀棟偉 石菲

胃癌又稱胃腺癌，是世界上第四大癌癥類型，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。研究表明，胃癌發(fā)生與性別和年齡有關(guān)，男性發(fā)病率高于女性，>50歲人群中胃癌的發(fā)病率明顯升高[2,3]。胃癌在亞洲、拉丁美洲、中歐和東歐的發(fā)病率較高[1]。由于在早期階段，胃癌沒有臨床表現(xiàn)，許多患者在疾病的晚期才被診斷，因此胃癌的治療效果欠佳[2]。雖然病理診斷和手術(shù)治療是提高胃癌患者生存率的有效手段，但由于胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，胃癌患者的5年生存率仍然很低[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)在許多疾病和病理生理過程中起至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用如腫瘤發(fā)生、白血病、心肌重塑、胚胎發(fā)育和造血干細(xì)胞分化等。越來越多的證據(jù)表明，miRNA對胃癌發(fā)生發(fā)展的有重要調(diào)節(jié)作用，miRNA代謝的紊亂可能是胃癌的潛在發(fā)病機(jī)制[4-6]。有研究表明，miR-213在乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和舌細(xì)胞癌中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7-10]，而miR-213對胃癌的調(diào)控作用尚不明確。本研究探討miR-213對胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 收集2018年1月至2020年1月陜西省榆林市第一醫(yī)院普外科住院行胃腺癌切除術(shù)患者30例的胃癌組織及癌旁正常組織。標(biāo)本收集患者均知情同意并簽署知情同意書后。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理確診為胃腺癌，年齡40～70歲；排除標(biāo)準(zhǔn)：近5年間罹患高血壓、糖尿病、冠心病及其他惡性腫瘤，有過胃腸道手術(shù)病史。

1.2 材料與儀器 澳洲胎牛血清(美國Gibco公司，貨號：10100147)、低糖的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司，貨號：31330095)、I型膠原(美國Gibco公司，貨號：A1048301)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司，貨號：11668030)；miRNA核苷酸序列(miR-213序列)(生工生物公司)；RNA的抽提試劑盒(日本Takara公司，貨號：639505)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司，貨號：639549)、擴(kuò)增試劑盒(日本Takara公司，貨號：639503)；q-PCR引物由生工生物公司合成；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(碧云天公司，貨號：b4758)；EdU染色試劑盒(南京舟達(dá)生物科技公司，貨號：zd2546)；抗p-PI3K抗體(美國Abcam公司，貨號：ab21475)；抗PI3K抗體(美國Abcam公司，貨號：ab21463)；抗p-Akt抗體(美國Abcam公司，貨號：ab36547)；抗Akt抗體(美國Abcam公司，貨號：ab36563)；和抗GAPDH抗體(美國Abcam公司，貨號：ab78453)；DNA內(nèi)切酶及連接酶(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：BTN130639和BTN130653)。實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司，型號：ABI7500fast)；酶標(biāo)儀(上海沛歐分析儀器有限公司，型號：SPS5845)；顯微鏡(日本Olympus公司，型號：cx21fs1)；電泳儀及發(fā)光儀(中國天能公司，型號：天能EPS600)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:人正常為黏膜上皮細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞系MNK-45、MGC803、SCG-7901、AGS購買自蘇州思瑞坦細(xì)胞庫。根據(jù)轉(zhuǎn)染寡核苷酸序列不同分為轉(zhuǎn)染miR-213陰性對照序列(5’-CAG GGC UAU GGC UAU GGC UAU GC-3’)的對照組和轉(zhuǎn)染miR-213模擬序列(5’-AGC AGC CUU GUA CAG GGC UAU GA-3’)的模擬物組[11]。轉(zhuǎn)染時將普通培養(yǎng)基去除，換為低血清的、不含雙抗的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h；在此期間，將Lipofectamine 2000和由公司合成的miRNA相關(guān)核苷酸序列混合均勻，室溫放置30 min，待脂質(zhì)體將核苷酸序列充分包裹；在培養(yǎng)6 h后將適量上述脂質(zhì)體混合液加入到上述低血清培養(yǎng)基中(miRNA相關(guān)核苷酸序列濃度為80 nmol/L)繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)6 h，隨后更換上述培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3.2 q-PCR檢測RNA表達(dá)量:按照說明書利用RNAiso進(jìn)行細(xì)胞裂解，室溫裂解2 min后加入適量的三氯甲烷震蕩，待溶液完全乳化，室溫放置10 min后見萃取分層，高速離心后取無色上清加入等體積的異丙醇，充分混合后冰凍過夜。離心后棄去上清，加入無水乙醇充分洗滌沉淀，棄去上清，加入DEPC水溶解RNA。根據(jù)說明書配制反應(yīng)液，根據(jù)說明書內(nèi)容設(shè)置參數(shù)，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：37℃預(yù)熱15 min；42℃加熱15 min；85℃加熱5 s，反應(yīng)結(jié)束后得到的cDNA用于后續(xù)實驗。根據(jù)擴(kuò)增試劑盒說明書配制反應(yīng)液，經(jīng)過預(yù)變性和擴(kuò)增反應(yīng)等步驟完成擴(kuò)增步驟，利用相對定量法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃維持5 s，60℃維持34 s，進(jìn)行40個循環(huán)[11]。

1.3.3 EdU染色檢測細(xì)胞增殖:將5 mmol/L的EdU染料加入細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，在拍攝前30 min固定細(xì)胞，利用Hoechcst染料對細(xì)胞核進(jìn)行染色，隨后利用激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞內(nèi)的熒光進(jìn)行拍攝。每組選取5個視野進(jìn)行計數(shù)，計算細(xì)胞核EdU染色陽性的細(xì)胞百分比[11]。

1.3.4 CCK-8發(fā)檢測細(xì)胞增殖:根據(jù)CCK-8試劑盒說明書配制反應(yīng)液，將上述反應(yīng)液按照一定的濃度加入到培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞系MNK-45中，隨后再將細(xì)胞放入常規(guī)孵箱培養(yǎng)，利用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞的吸光度[11]。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:利用緩沖液制備的細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為1×106/ml)，按照Annexin-V/PI凋亡試劑盒說明，制備反應(yīng)用細(xì)胞懸液，然后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡[12]。

1.3.6 Western Blot技術(shù)檢測蛋白表達(dá)量:利用蛋白酶裂解液制備蛋白樣本；在蛋白樣本中加入緩沖液，利用煮沸方法制備蛋白樣品。按照以下參數(shù)將上述上樣蛋白進(jìn)行電泳：95 V進(jìn)行30 min完成濃縮膠的電泳，隨后調(diào)整為120 V電泳90 min完成分離膠的電泳；繼續(xù)調(diào)整參數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜：250 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h；按照p-Akt(1∶3 000稀釋)、Akt(1∶5 000稀釋)、p-PI3K(1∶3 000稀釋)、PI3K(1∶5 000稀釋)和GAPDH(1∶10 000稀釋)抗體說明書配制一定濃度的一抗，室溫孵育一抗4 h，取出條帶后沖洗干凈，配制帶有辣根過氧化物酶的二抗孵育液，隨后室溫孵育1 h，進(jìn)行發(fā)光[11]。

1.3.7 熒光素酶報告基因系統(tǒng)的構(gòu)建和檢測:通過靶基因預(yù)測軟件的預(yù)測，確定潛在靶基因肉瘤基因(sarcoma,SRC)的結(jié)合序列，并對其進(jìn)行人工合成，即可得到非編碼(untraslated regions,UTR)序列，對上述序列進(jìn)行突變即可得到突變(mutation,MUT)序列。利用DNA內(nèi)切酶及連接酶將合成的上述基因插入到質(zhì)粒中，將上述質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增并抽提。隨后利用制備得到的質(zhì)粒和UTR或者M(jìn)UT序列共轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞(細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法同前)。隨后利用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活[11,12]。

2 結(jié)果

2.1 miR-213在胃腺癌組織和胃癌細(xì)胞系中低表達(dá) 與癌旁組織比較，胃癌組織中miR-213低表達(dá)(P<0.05)。與正常為黏膜上皮細(xì)胞GES-1比較，胃癌細(xì)胞系MNK-45、MGC803、SCG-7901和AGS中miR-213低表達(dá)(P<0.05)。見表1、2。

表1 樣本中miR-213的相對含量檢測

表2 胃黏膜細(xì)胞及胃癌細(xì)胞系中miR-213的相對含量檢測

2.2 轉(zhuǎn)染miR-213模擬序列能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-213的水平 轉(zhuǎn)染miR-213模擬物序列能夠大幅上調(diào)MNK-45細(xì)胞內(nèi)miR-213的水平(P<0.05)。見表3。

表3 胃癌細(xì)胞系MNK-45內(nèi)miR-213的含量

2.3 轉(zhuǎn)染miR-213模擬序列抑制胃癌細(xì)胞系MNK-45的增殖 與對照組比較，miR-213模擬物組細(xì)胞的EdU染色陽性率下降(P<0.05)；與對照組比較，miR-213模擬物能夠抑制MNK-45細(xì)胞的增殖(P>0.05)。見圖1，表4。

圖1 EdU染色法和CCK-8法檢測MNK-45細(xì)胞的增殖能力；A熒光顯微鏡觀測EdU染色；B CCK-8檢測細(xì)胞增殖曲線

表4 MNK-45細(xì)胞EdU染色陽性細(xì)胞率

2.4 miR-213模擬物促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡 利用流式細(xì)胞儀檢測miR-213陰性對照序列和miR-213模擬物轉(zhuǎn)染后MNK-45細(xì)胞的凋亡情況，與對照組比較，miR-213模擬物組細(xì)胞凋亡增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表5。

圖2 流式細(xì)胞儀的方法檢測轉(zhuǎn)染后MNK-45細(xì)胞的凋亡情況

表5 MNK-45細(xì)胞的相對凋亡水平

2.5 miR-213模擬物減少p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá) 利用Western Blot技術(shù)檢測MNK-45細(xì)胞中和p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt指標(biāo)蛋白的表達(dá)，與對照組比較，miR-213模擬物組p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)減少(P<0.05)。見圖3，表6。

圖3 Western Blot檢測MNK-45細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)(蛋白灰度圖)

表6 Western Blot檢測MNK-45細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.6 SRC是miR-213的靶基因 為了進(jìn)一步研究miR-213抑癌的機(jī)制，我們利用Targetscan和MiRanda等靶基因預(yù)測軟件預(yù)測了miR-213的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)SRC基因的3’UTR上存在miR-213的潛在結(jié)合位點。繼而，我們利用熒光素酶報告基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-213能夠顯著抑制SRC 3’UTR質(zhì)粒的熒光素酶活性，提示SRC是miR-213的直接作用靶基因。見表7。

表7 熒光素酶相對活性

3 討論

由于胃癌在疾病的早期沒有明顯臨床表現(xiàn)，大多數(shù)患者在疾病的后期才被發(fā)現(xiàn)，此時的康復(fù)機(jī)會較低[1-3]。故深入研究胃癌發(fā)病機(jī)制及尋求治療新靶點成為近年來的研究熱點。而miRNA研究較為深入，已有多種miRNA藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗[13]。

我們在文獻(xiàn)回顧中發(fā)現(xiàn)miR-213在乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和舌細(xì)胞癌中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7-10]，為探討miR-213在胃腺癌中的作用，我們又在正常胃黏膜細(xì)胞和多種胃癌細(xì)胞系中驗證了這個結(jié)論，同樣發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞系中miR-213低表達(dá)。上述結(jié)果暗示miR-213可能發(fā)揮抑癌作用。隨后我們在胃癌細(xì)胞系MNK-45中上調(diào)miR-213的表達(dá)并發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-213表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞系的增殖和遷徙，這與之前學(xué)者報道[9,10]一致。學(xué)者證明，miR-213在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)，過表達(dá)miR-213能夠抑制鱗狀細(xì)胞癌的增殖和遷徙[9]。也有學(xué)者報道，miR-213能夠抑制舌細(xì)胞癌的增殖和侵襲作用[10]。但也有學(xué)者報道，miR-213在乳腺癌中高表達(dá)，能夠促進(jìn)乳腺癌的增殖和侵襲[7,8]。miR-213在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖方面的差異可能是由于腫瘤細(xì)胞來源不同，這同時也反映出miR-213在細(xì)胞增殖調(diào)控中的復(fù)雜性。凋亡失衡被認(rèn)為是腫瘤發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵途徑，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-213表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞系的凋亡，另有學(xué)者證實，miR-213能夠在細(xì)胞修復(fù)和應(yīng)激過程中促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[14]，本研究與之一致。

PI3K/Akt信號通路是腫瘤發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵途徑，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中被激活，能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程，被認(rèn)為是腫瘤治療的重要靶點[15,16]。有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌干細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路中的多種關(guān)鍵蛋白高表達(dá)，且與胃癌的惡性程度相關(guān)[17]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-107可通過靶向調(diào)控PI3K/Akt信號通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖[18]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-213抑制了胃癌細(xì)胞系PI3K/Akt信號通路的活化。這也從一個方面解釋了miR-213抑制胃癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡的原因。

研究表明，在人類的多種腫瘤中SRC基因被過度激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長[19]。已經(jīng)研究證實，抑制SRC基因的活化可以發(fā)揮有效的抑癌作用[20,21]。為探究miR-213抑制胃癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的機(jī)制，我們首先利用生物信息學(xué)分析技術(shù)預(yù)測了miR-213可能的靶基因，我們發(fā)現(xiàn)miR-213與SRC基因有著較高的匹配度。為了進(jìn)一步驗證miR-213與SRC基因的結(jié)合，通過熒光素酶報告基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)了miR-213可以直接靶向作用于癌基因SRC，這可能是miR-213發(fā)揮抑癌作用的重要方式。

綜上所述，胃癌組織及胃癌細(xì)胞系內(nèi)低表達(dá)miR-213，miR-213可通過靶向SRC抑制胃癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡。