潘 輝 劉 芳 曾志浩 周麗麗 袁宗勝

（1. 閩江學(xué)院海洋研究院，福建 福州 350108；2. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

植物內(nèi)生細(xì)菌是指生活史的一定階段或全部階段均生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，并且與植物建立了和諧共關(guān)系的細(xì)菌[1]。內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)自身產(chǎn)生代謝產(chǎn)物或借助信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響，主要在促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)宿主植物抗性及提高植物修復(fù)能力等方面[2]，如Microbacterium具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[3]，Bacillus具有良好的生防潛力[4]，Sphingomonas對(duì)植物自我修復(fù)功能[5]等。相思類(lèi)樹(shù)種屬含羞草科（Mimosaceae）金合歡屬（Acacia）的常綠喬木。研究表明，相思類(lèi)樹(shù)種生長(zhǎng)迅速、萌生能力強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)，耐貧瘠、鹽堿和干旱，是沿海地區(qū)沙質(zhì)土壤更新造林的理想樹(shù)種[6]。圍繞相思類(lèi)樹(shù)引種、栽培技術(shù)及經(jīng)營(yíng)管理等方面已經(jīng)開(kāi)展了系列研究[7-8]，關(guān)于相思樹(shù)根際與內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)差異性及關(guān)鍵微生物功能的研究鮮有報(bào)道，而這些方面的研究可為充分發(fā)揮相思樹(shù)種土壤改良、維持地力、水土保持功能等生態(tài)效益功能提供科學(xué)依據(jù)。本研究基于 Illumina NovaSeq 測(cè)序平臺(tái)，對(duì)不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征及差異性進(jìn)行分析，并根據(jù)它們的分類(lèi)預(yù)測(cè)內(nèi)生細(xì)菌種群的功能，為揭示相思樹(shù)內(nèi)生功能菌株的挖掘和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采樣地設(shè)在中國(guó)福建省漳浦中西國(guó)有林場(chǎng)，該區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)氣候，地理座標(biāo)為117°56′ E，24°28′ N，年平均氣溫21.8 ℃，年降水量1 600 mm，地形為低山丘陵，土壤為沙質(zhì)頁(yè)巖發(fā)育的紅壤。2019年11月，分別采集厚莢相思（Acacia crassicarpa）、卷莢相思（A. cincinnata）、黑木相思（A. melanoxylon）、直 干 相 思（A. mearnsil）、馬占相思（A. mangium）等樹(shù)種（樹(shù)齡為8～10 a）的根部樣本。

樣本采集：隨機(jī)選取健壯植株，在距樹(shù)干1 m左右的位置用鐵鏟挖取50～60 cm深的樹(shù)根，將樹(shù)根取出作為根部樣本，樣本采集后立即放入無(wú)菌樣本袋中，24 h 內(nèi)放入 -20 ℃保存。本研究共采集樣本15個(gè)，每個(gè)植物種類(lèi)3個(gè)重復(fù)樣本，每個(gè)植物種類(lèi)樣本編號(hào)分別為厚莢相思的根（HJ.A）、卷莢相思的根（JJ.A）、黑木相思的根（HM.A）、直干相思的根（ZZ.A）、馬占相思的根（MZ.A）。

1.2 樣本基因組DNA提取及高通量測(cè)序

采用試劑盒TIANGEN Plant Genomic DNA kit并按照其說(shuō)明書(shū)的步驟提取樣本基因組DNA。采用瓊脂糖電泳檢測(cè)基因組 DNA 的濃度和純度，將檢測(cè)合格的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增形成測(cè)序文庫(kù)[9]，并將質(zhì)檢合格的文庫(kù)在Illumina NovaSeq PE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行16Sr RNA V5-V7區(qū)高通量測(cè)序。

1.3 分析方法

通過(guò)對(duì)測(cè)序得到的雙端 Reads（PE Reads）進(jìn)行拼接、過(guò)濾、除去嵌合體序列，最終得到有效數(shù)據(jù)；在對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行在 97%相似度水平下的聚類(lèi)后，獲得分類(lèi)操作單元（OTU）。采用RDP Naive Bayesian Classifier分類(lèi)算法進(jìn)行注釋。使用BioVenn在線軟件進(jìn)行Venn 圖繪制；使用Qiime 軟件計(jì)算觀測(cè)物種數(shù)、豐富度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)等，分析不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征及差異[10-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果及OUT分析

經(jīng)測(cè)序分析，5個(gè)相思樹(shù)種的15個(gè)樣本共獲得1 197 357 條clean tags，各樣本clean tags在69 799～86 919 之間。根據(jù)相似度在97%以上的序列聚類(lèi)為一個(gè) OTU原則進(jìn)行有效OTUs統(tǒng)計(jì)，從圖1稀釋曲線可以看出，當(dāng)樣本測(cè)序深度達(dá)15 000條時(shí)，稀釋曲線都趨于平緩，表明本次測(cè)序深度足以可靠地描述與樣本相關(guān)的細(xì)菌群落。

圖 1 相似度為97%水平下的稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves at 97% sequence similarity

圖2為不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌 OTUs Venn圖。從不同樣本來(lái)源來(lái)看，不同種相思樹(shù)根部樣本 OTU 數(shù)目表現(xiàn)為直干相思 ＞ 厚莢相思 ＞ 馬占相思 ＞ 卷莢相思 ＞ 黑木相思。5種不同種相思樹(shù)根部樣本有365個(gè)共有OTUs，厚莢相思、卷莢相思、黑木相思、直干相思及馬占相思獨(dú)有的OTUs分別為282、110、100、341個(gè)及288個(gè)。

圖 2 OTU數(shù)量與分布Fig. 2 OTU distribution and Venn graphs

2.2 根內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

由表1可知，不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量排序分別為：直干相思 ＞ 厚莢相思 ＞ 馬占相思 ＞卷莢相思 ＞ 黑木相思；不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌多樣性排序分別為：直干相思 ＞ 厚莢相思 ＞ 馬占相思 ＞ 卷莢相思 ＞ 黑木相思。由此可知，不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌的豐富度和多樣性的差異較大，直干相思根內(nèi)生細(xì)菌的豐富度和多樣性最高。

表 1 不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌多樣性和物種豐富度Table 1 Diversity and relative abundance of endophytic bacterial community in root of Acacia species

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

比較了綱水平上的根內(nèi)生細(xì)菌群落的相對(duì)豐度，如圖3a所示，在綱水平占據(jù)主導(dǎo)地位的主要包括Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria。在厚莢相思、卷莢相思的根內(nèi)生細(xì)菌中Alphaproteobacteria占主導(dǎo)地位，其次為Gammaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria；黑木相思和直干相思的根內(nèi)生細(xì)菌中Alphaproteobacteria占主導(dǎo)地位，其次為Unidentified_Actinobacteria和Gammaproteobacteria；而馬占相思的根內(nèi)生細(xì)菌中，則以Gammaproteobacteria為主導(dǎo)地位，其次為Alphaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria。在綱水平，不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

在目水平上，如圖3b所示，不同種相思樹(shù)樣本優(yōu)勢(shì)菌群存在較大差異。在厚莢相思、卷莢相思和直干相思的根內(nèi)生細(xì)菌中Rhizobiales占主導(dǎo)地位，其次為unidentified_Gammaproteobacteria和Pseudonocardiales；黑木相思的根內(nèi)生細(xì)菌中Rhizobiales占主導(dǎo)地位，其次為unidentified_Gammaproteobacteria和Frankiales；而馬占相思的根內(nèi)生細(xì)菌中，則以Rhizobiales、Enterobacteriales和Unidentified_Gammaproteobacteria為主導(dǎo)地位，不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌群落在目水平相對(duì)豐度存在較大差異，其中馬占相思樹(shù)種根內(nèi)生細(xì)菌群落中Enterobacteriales相對(duì)豐度最高。

在科水平上如圖3c所示，5 組樣本豐度前10的細(xì)菌包括Xanthobacteraceae、Beijerinckiaceae、Enterobacteriaceae、Pseudonocardiaceae、Burkholderiaceae、unidentified_Gammaproteobacteria、Pseudomonadaceae、unidentified_Acidobacteriales、Caulobacteraceae、Acidothermaceae。 通過(guò)比較不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌群落豐度比例可知，在厚莢相思和直干相思的根內(nèi)生細(xì)菌中Xanthobacteraceae占主導(dǎo)地位，其次為unidentified_Acidobacteriales；卷莢相思和黑木相思的根內(nèi)生細(xì)菌中Xanthobacteraceae占主導(dǎo)地位，其次為Beijerinckiaceae；而馬占相思的根內(nèi)生細(xì)菌中，則以Enterobacteriaceae為主導(dǎo)地位，其次為Burkholderiaceae、Xanthobacteraceae、Pseudonocardiaceae、Pseudomonadaceae等。Beijerinckiaceae在卷莢相思和黑木相思細(xì)菌群落豐度比例較大；unidentified_Acidobacteriales在厚莢相思和直干相思樹(shù)種中群落豐度比例較大；Enterobacteriaceae在馬占相思樹(shù)種中所占豐度比例最大。不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌群落在科水平相對(duì)豐度存在較大差異。

圖 3 不同種相思樹(shù)根內(nèi)生細(xì)菌群落的相對(duì)豐度Fig. 3 Relative abundance of endophytic bacterial community in root of Acacia species

3 結(jié)論與討論

根部是植物的重要組織，是植物主要的營(yíng)養(yǎng)和水份的吸收組織，內(nèi)生細(xì)菌在植物組織內(nèi)，依賴(lài)植物提供的有機(jī)物質(zhì)和其他衍生物而存活，其活動(dòng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)植物的生長(zhǎng)也起著重要的作用。植物根的分泌物和粘液衍生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸引了無(wú)數(shù)的有機(jī)體到根際環(huán)境中，但植物相關(guān)的細(xì)菌必須高度競(jìng)爭(zhēng)才能成功地在根內(nèi)定殖[13-16]，而不同樹(shù)種根部可能存在著不同的營(yíng)養(yǎng)吸收和分泌物的能力，可能導(dǎo)致了定殖在根內(nèi)的細(xì)菌群落的差異性[17-22]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，大部分相思樹(shù)綱水平上占優(yōu)勢(shì)的根際細(xì)菌是Alphaproteobacteria，目水平上占優(yōu)勢(shì)的是Rhizobiales。這不僅表明相思樹(shù)根際細(xì)菌群落的建立有一定的細(xì)菌菌群建立規(guī)律；而且Rhizobiales目的菌尤其是根瘤菌屬的菌能與豆科植物共生固氮，對(duì)豆科植物及種植地土壤都有良好作用[23-24]，如根瘤菌屬和慢性根瘤菌屬都能從豆科植物根毛侵入根內(nèi)形成根瘤，并在根瘤內(nèi)成為分枝的類(lèi)菌體，類(lèi)菌體將分子氮還原成NH3，分泌至根瘤細(xì)胞內(nèi)，并合成酰胺類(lèi)或酰尿類(lèi)化合物，輸出根瘤，由根的傳導(dǎo)組織運(yùn)輸至宿主地上部分供利用。宿主為根瘤菌提供碳源和能源以及其他必需營(yíng)養(yǎng)，而根瘤菌則為宿主提供氮素營(yíng)養(yǎng)[25-26]。同時(shí)根菌瘤在生活過(guò)程中可利用多種碳水化合物，并分泌相當(dāng)量的胞外粘液把有機(jī)氮帶到土壤中，這樣就可以從環(huán)境中吸引了大量的根際微生物和生物從而大大提高了土壤的肥力[25]。這說(shuō)明可通過(guò)人為選擇種植相思樹(shù)來(lái)“管理”土壤細(xì)菌群落，管理土壤肥力，從而改變和改善人工林的土壤養(yǎng)分和結(jié)構(gòu)，這對(duì)人工林具有長(zhǎng)期良好的影響。

在科水平上，厚莢相思、卷莢相思、直干相思和黑木相思的根內(nèi)生細(xì)菌中優(yōu)勢(shì)菌為Xanthobacteraceae，該科的細(xì)菌多為無(wú)動(dòng)力、氧化酶陽(yáng)性的革蘭陰性桿菌，主要存在于有水的環(huán)境和潮濕的環(huán)境里[11]。而在馬占相思的根內(nèi)生細(xì)菌中，則以Enterobacteriaceae占主導(dǎo)地位，該科的多數(shù)細(xì)菌有周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，可在土壤或水中生存[11]。馬占相思與其他幾種相思樹(shù)相比，其生長(zhǎng)速度較快，涵養(yǎng)水源，木質(zhì)均勻，葉蛋白質(zhì)和氨基酸含量豐富。黃維南等[27]報(bào)道按每株馬占相思的干葉狀柄平均按26.1 kg計(jì)算，則其含有14.44 g尿囊素。尿囊素是一種脈類(lèi)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可增強(qiáng)光合能力，提高根際微生物活性。

植物與內(nèi)生細(xì)菌在長(zhǎng)期的共同進(jìn)化中已經(jīng)建立了一種和諧聯(lián)合的共生關(guān)系[1]?，F(xiàn)有研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌可以通過(guò)自身的代謝或借助于信號(hào)傳導(dǎo)作用對(duì)植物體施加影響[2-5]。目前微生物菌劑或生物菌肥等受到人們的重視，其目標(biāo)菌種多為從土壤中篩選得到，而內(nèi)生菌可以從植物體表進(jìn)入植物體內(nèi)，并能夠在植物體內(nèi)定殖[28]，因此，內(nèi)生細(xì)菌作為重要的微生物資源在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有良好的研究和開(kāi)發(fā)潛力。加強(qiáng)植物內(nèi)生細(xì)菌資源的研究，加強(qiáng)內(nèi)生細(xì)菌與植物之間生態(tài)關(guān)系的研究，以及建立各種功能內(nèi)生細(xì)菌的資源庫(kù)具有重要的意義。