安雪菲 但漢龍 羅旭璐 劉 云 李永和 趙 平

（1. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2. 云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650224）

貴州省特有植物無(wú)子刺梨（Rosa Sterills）與刺梨（R. roxburghii）同屬薔薇科（Rosaceae）薔薇屬多年生攀援灌木[1-3]，其成熟果實(shí)香甜爽口，酸味適中，加工鮮食均可[4]。有關(guān)刺梨的化學(xué)成分和生物活性的研究報(bào)道較多，研究表明多酚、黃酮和三萜是刺梨的主要有效成分，具有提高免疫功能、延緩衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、預(yù)防癌癥、降血脂和抗糖尿病等生理活性[5-7]。自1985年時(shí)圣德[1]首次報(bào)道無(wú)子刺梨新分類群以來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)無(wú)子刺梨的研究主要集中在其形態(tài)分類[2-3]、親緣關(guān)系[8-9]、繁殖[10]、光合生理[11]和成分分析[2,12-14]等方面，而對(duì)無(wú)子刺梨果實(shí)的抗氧化活性及其主要化學(xué)成分含量分析研究至今未見(jiàn)報(bào)道。

活性篩選實(shí)驗(yàn)方法分為體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)雖然具有快速高效的優(yōu)點(diǎn)，但不涉及被篩選物質(zhì)的吸收、分布和代謝等問(wèn)題，其篩選結(jié)果往往與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符，而以斑馬魚(yú)（Danio rerio）建立的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可以彌補(bǔ)體外實(shí)驗(yàn)的不足。斑馬魚(yú)模型既具有體外實(shí)驗(yàn)快速高效的優(yōu)勢(shì)，又具有哺乳類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)性強(qiáng)、可比度高等優(yōu)點(diǎn)，加之其發(fā)育周期快、繁殖能力強(qiáng)、胚胎透明和易于觀察，近年來(lái)已發(fā)展成為國(guó)內(nèi)外高效篩選藥理活性的理想模式動(dòng)物模型[15-17]。本實(shí)驗(yàn)以貴州省興仁縣產(chǎn)無(wú)子刺梨新鮮成熟果實(shí)為原料，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2′-連氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基清除活性和活性氧簇（ROS）清除活性測(cè)試方法評(píng)價(jià)其果汁提取物和果渣提取物的體內(nèi)外抗氧化活性，并采用紫外分光光度法分別對(duì)果汁和果渣中總多酚、總黃酮和總?cè)频戎饕瘜W(xué)成分的含量進(jìn)行測(cè)定，以期為無(wú)子刺梨進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1）材料 無(wú)子刺梨新鮮成熟果實(shí)，于2014年10月采自貴州省興仁縣回龍鎮(zhèn)獅子村生長(zhǎng)良好的植株。

2）試劑、藥品 對(duì)照品沒(méi)食子酸、蘆丁和齊墩果酸購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，福林酚試劑、DPPH、ABTS、還原型谷胱甘肽（GSH）和ROS特異性熒光染料購(gòu)自Sigma公司，AB-8大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自北京慧德易科技有限責(zé)任公司，碳酸鈉、抗壞血酸鈉、果膠酶、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、香蘭醛、冰乙酸、高氯酸、維生素C（Vc）、二甲基亞砜（DMSO）、甲醇和乙醇均為分析純，水為重蒸餾水。

3）儀器 CP224C電子天平（奧豪斯儀器有限公司，美國(guó)），UV-2500紫外分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司，中國(guó)），高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司，中國(guó)），SG250HDT超聲波儀（上海冠特超聲儀器有限公司，中國(guó)），賽特路斯BT244S型萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，中國(guó)），EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1001型（東京理化器械有限公司，日本），96孔酶標(biāo)板（Costar Technologies Inc.，美國(guó)），Mithras LB940多功能酶標(biāo)儀（Berthold Technologies Inc.，德國(guó)）。

1.2 供試樣品制備

無(wú)子刺梨果實(shí)經(jīng)榨汁過(guò)濾，果汁密封后冷凍備用。所得果渣置于50 ℃鼓風(fēng)烘箱烘干至恒質(zhì)量，粉碎過(guò)40目篩后于陰涼干燥處保存?zhèn)溆?。冷凍果汁解凍后量?00 mL置于燒杯中，加入抗壞血酸鈉12.5 mg和果膠酶25 mg，于50 ℃水浴上恒溫保持4 h，過(guò)濾備用；稱取無(wú)子刺梨干燥果渣粉末15 g，采用超聲輔助乙醇提取法[18]，在料液比1∶23、乙醇體積分?jǐn)?shù)52%、提取時(shí)間70 min條件下提取4次，提取液于50 ℃減壓濃縮，得到剩余水溶液備用。上述所得的2種樣品溶液分別通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂層析柱（35 mm×550 mm）吸附，依次用1 000 mL蒸餾水洗脫、1 000 mL乙醇解吸附，收集乙醇洗脫液于50 ℃減壓濃縮干燥，得到果汁提取物和果渣提取物。

1.3 測(cè)定及分析方法

1.3.1 體外抗氧化活性的測(cè)定與分析

采用張鏡等[19]和Feng等[20]的方法，取不同質(zhì)量濃度的供試樣品溶液分別與DPPH工作液、ABTS工作液反應(yīng)，分別按下式計(jì)算供試樣品的自由基清除率。根據(jù)供試樣品溶液的DPPH和ABTS自由基清除曲線，分別計(jì)算半清除濃度（SC50值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。

式中：Aa為樣品溶液和DPPH工作液反應(yīng)后的吸光值，Ab為乙醇和DPPH工作液的吸光值；Ax為樣品和ABTS工作液反應(yīng)后的吸光值，Ax0為乙醇和樣品溶液的吸光值，A0表示混合溶液為乙醇和ABTS工作液時(shí)的吸光值。

1.3.2 體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定與分析

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為成年野生型AB系斑馬魚(yú)，按照李美娟等[21]的方法進(jìn)行培養(yǎng)。平均每對(duì)能產(chǎn)200～300個(gè)胚胎。在受精后6 h和24 h對(duì)胚胎進(jìn)行清理（移除已死亡胚胎），并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎。在28 ℃條件下用養(yǎng)魚(yú)用水孵育胚胎（養(yǎng)魚(yú)用水水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3）。因?yàn)榕咛タ梢詮淖陨淼穆腰S囊中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以在受精后9 d不需要喂食。

樣品濃度在3.0 μg/mL時(shí)，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)沒(méi)有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，因此選擇3.0 μg/mL作為樣品的濃度。實(shí)驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行，每板設(shè)計(jì)1個(gè)陰性對(duì)照組、1個(gè)模型組、1個(gè)溶劑組、1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組和8個(gè)樣品檢測(cè)組，每樣品組8個(gè)孔；陰性對(duì)照組沒(méi)有斑馬魚(yú)，其他各組均每孔1尾魚(yú)?；钚匝跄Ｐ徒M為ROS特異性熒光染料處理的斑馬魚(yú)；陰性對(duì)照組只含ROS染料的養(yǎng)魚(yú)用水，不含斑馬魚(yú)；溶劑對(duì)照組為0.1% DMSO處理組；陽(yáng)性對(duì)照組為GSH處理組；所有實(shí)驗(yàn)組均含有相同濃度的溶劑。化合物處理結(jié)束后，應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀對(duì)各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行熒光定量分析，取6孔斑馬魚(yú)熒光值作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用方差分析和Dunnett'st-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表明具有顯著性差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用± SE表示。樣品的ROS清除率按公式（3）計(jì)算。

1.3.3 3種主要化學(xué)成分含量的測(cè)定與分析

分別精密稱取4.0 mg果汁提取物和果渣提取物，用70%乙醇溶解后定容至10 mL，配制成0.4 mg/mL的溶液。按照Lee等[22]的方法進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將測(cè)得的樣品吸光度值帶入本實(shí)驗(yàn)室已建立的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程（y=3.222 3x+0.034 1，R2=0.999 9）[23]，并結(jié)合稀釋倍數(shù)分別計(jì)算出果汁和果渣原料中總多酚的含量。

參考梁倩等[24]的方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=10.174x-0.021 6（R2=0.999 6），表明蘆丁在0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密稱取10 mg果汁提取物和果渣提取物，用70%乙醇溶解后定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的溶液。之后按梁倩等[24]的方法進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將測(cè)得的樣品吸光度值帶入上述回歸方程，并結(jié)合稀釋倍數(shù)分別計(jì)算出果汁和果渣原料中總黃酮的含量。

采用毛得獎(jiǎng)等[25]的方法，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=5.782x+0.103（R2=0.999 9），表明齊墩果酸在0.06～0.42 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。準(zhǔn)確稱取10 mg提取樣品，用乙醇溶解后定容至10 mL，配制成1.0 mg/mL的溶液。之后按毛得獎(jiǎng)等[25]的方法進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將測(cè)得的樣品吸光度值帶入上述回歸方程，并結(jié)合稀釋倍數(shù)分別計(jì)算出果汁和果渣原料中總?cè)频暮俊?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)子刺梨果汁和果渣提取物的體外抗氧化活性

由圖1可知，Vc對(duì)DPPH自由基的清除率在10～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(18.23±1.73) μg/mL。Vc對(duì)ABTS自由基的清除率在50～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(77.45±1.01) μg/mL。

圖 1 果汁和果渣提取物的DPPH和ABTS自由基清除率Fig. 1 DPPH and ABTS free radical scavenging rates of the juice and pomace extracts

由表1可知，果汁提取物對(duì)DPPH自由基的清除率在4～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(17.58±0.48) μg/mL；對(duì)ABTS自由基的清除率在50～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(56.26±3.07) μg/mL。與Vc清除DPPH和ABTS自由基的SC50相比，表明果汁提取物的抗氧化活性稍強(qiáng)于Vc。果渣提取物對(duì)DPPH自由基的清除率在4～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(45.38±0.68) μg/mL；對(duì)ABTS自由基的清除率在50～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好，SC50值為(101.67±1.15) μg/mL，與Vc的SC50相比，表明果渣提取物的抗氧化活性弱于Vc。

表 1 無(wú)子刺梨果汁和果渣提取物對(duì)DPPH和ABTS自由基的半清除濃度Table 1 SC50 values of juice and pomace extracts of R. sterilis against DPPH and ABTS free radicals

2.2 無(wú)子刺梨果汁和果渣提取物的體內(nèi)抗氧化活性

由表2可知，ROS清除率分別為(84.8±3.4)%(P＜0.001)、(83.8±3.6)%和(52.2±6.7)%，表明無(wú)子刺梨果汁提取物和果渣提取物的ROS清除能力相當(dāng)，且優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照GSH。

表 2 果汁和果渣提取物的ROS清除率Table 2 ROS scavenging rates of fruit juice and pomace extracts %

2.3 無(wú)子刺梨果汁和果渣中3種主要化學(xué)成分的含量

由表3可知，無(wú)子刺梨果汁中總多酚、總黃酮和總?cè)频暮烤謩e高于果渣中的含量。其中，果汁總多酚達(dá)(32.81±0.19) mg/g，是果渣總多酚含量的1.51倍；果汁中的總黃酮含量為(29.62±0.06) mg/g，與果汁總多酚含量較為接近，是果渣總黃酮含量的2.45倍；果汁中的總?cè)坪扛哌_(dá)(61.88±0.62) mg/g，為果渣總?cè)坪康?.08倍。

表 3 果汁和果渣中3種主要化學(xué)成分的含量Table 3 Contents of total polyphenols, total flavonoids and total triterpenoids in the juice and pomace mg/g

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用DPPH、ABTS自由基清除活性和ROS清除活性測(cè)試方法評(píng)價(jià)了無(wú)子刺梨果汁提取物和果渣提取物的體內(nèi)外抗氧化活性，結(jié)果顯示，果汁提取物對(duì)DPPH和ABTS自由基的SC50分別 為(17.58±0.48) μg/mL和(56.26±3.07) μg/mL，果渣提取物對(duì)DPPH和ABTS自由基的SC50分別為(45.38±0.68) μg/mL和(101.67±1.15) μg/mL，果汁提取物和果渣提取物的ROS清除率分別為(84.80±3.40) %和(83.80±3.60) %，表明果汁提取物的體外抗氧化活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照Vc和果渣提取物。在DPPH自由基清除活性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)果汁和果渣提取物的自由基清除率并未隨著樣品濃度的增加而遞增，可能是由于樣品溶液的顏色隨著濃度的增加而增加所致[20]。果汁提取物和果渣提取物的ROS清除率分別為(84.80±3.40)%和(83.80±3.60)%，表明2種提取物的體內(nèi)抗氧化活性相當(dāng)，且均強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照GSH。同時(shí)，采用紫外分光光度法分別對(duì)果汁和果渣中主要有效成分總多酚、總黃酮和總?cè)频暮窟M(jìn)行了測(cè)定，果汁中總多酚、總黃酮和總?cè)频暮糠?別 為(32.81±0.19)、(29.62±0.06)、(61.88±0.62)mg/g，果渣中總多酚、總黃酮和總?cè)频暮糠謩e為(21.66±0.29)、(12.11±0.05)、(15.16±0.22) mg/g，表明果汁中總多酚、總黃酮和總?cè)频戎饕瘜W(xué)成分的含量均高于果渣，并與其體外抗氧化能力呈正相關(guān)關(guān)系。

許多研究表明，多酚、黃酮及三萜類物質(zhì)是果蔬中主要的抗氧化物質(zhì)[26-29]，其抗氧化能力通常和這些物質(zhì)的含量呈正相關(guān)關(guān)系。如陳玉霞等[30]分析比較了常見(jiàn)25種蔬菜的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)抗氧化活性與總多酚和總黃酮含量之間存在較大的相關(guān)性。在本研究中，無(wú)子刺梨果汁中總多酚、總黃酮和總?cè)频戎饕瘜W(xué)成分的含量均高于果渣中的含量，且果汁提取物的體外抗氧化能力也強(qiáng)于果渣，同樣也呈類似的正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明這些物質(zhì)是無(wú)子刺梨體外抗氧化活性的主要化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，果汁提取物和果渣提取物中的總多酚、總黃酮和總?cè)频暮坎町愝^大，但二者的體內(nèi)抗氧化活性非常接近，推測(cè)可能是由于果渣提取物中含有其他的抗氧化物質(zhì)所致，值得進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)無(wú)子刺梨果汁提取物和果渣提取物的體內(nèi)外抗氧化活性及其主要化學(xué)成分含量進(jìn)行了測(cè)定，其化學(xué)成分的分離鑒定和進(jìn)一步的活性評(píng)價(jià)等值得深入研究，將為無(wú)子刺梨功能性產(chǎn)品進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用等提供參考。