李楷原,劉 翠,鄧雅姍,薛 曉,許 慧,王繁業(yè)

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系,山東 青島 266042)

0 引言

絲裂霉素是一類(lèi)具有抗腫瘤活性的抗生素，臨床廣泛用作抗癌藥物.但由于其毒性較高,易導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)，所以其在臨床應(yīng)用上受到一定限制[1].目前,通過(guò)各種化學(xué)方法已成功合成了絲裂霉素類(lèi)化合物，但化學(xué)法仍存在一些缺點(diǎn)，如反應(yīng)步驟繁瑣、選擇性差、反應(yīng)條件苛刻等[2-3].酶催化法具有化學(xué)選擇性高、反應(yīng)條件溫和、合成效率高、立體選擇性高和對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[4],該方法有可能避免上述問(wèn)題.

脂肪酶是在有機(jī)合成領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的多功能酶，在C—C鍵的形成、C—雜原子鍵的形成、氧化和水解反應(yīng)中顯示出良好的催化能力[5].盡管脂肪酶催化水解反應(yīng)與酯化的動(dòng)力學(xué)模型已被廣泛研究[6],但脂肪酶催化Michael加成反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型研究鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道.本文所采用的T.laibacchii脂肪酶是一種胞內(nèi)水解酶，由于其優(yōu)良的催化特性，所以該酶已被用于酮洛芬的動(dòng)力學(xué)拆分[7]、手性1,3-氧硫雜環(huán)戊烷的立體選擇性合成[8]和ε-己內(nèi)酯直接原位開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)[9].酶的固定化[10]是改善酶特性的有效方法，在酶固定化后其穩(wěn)定性增加，便于運(yùn)輸和貯存，且其特異性[11]、對(duì)抑制劑或化學(xué)品的耐受性和可重復(fù)使用性[12-13]都有較大程度提升.本文采用聚乙二醇PEG4000 /K2HPO4雙水相體系對(duì)T.laibacchii脂肪酶進(jìn)行部分純化，并添加硅藻土載體實(shí)現(xiàn)脂肪酶的原位固定[14].疏水性[15]的硅藻土可在疏水環(huán)境中吸附殘留物，降低對(duì)酶的抑制作用[16].

本文以固定化T.laibacchii脂肪酶為催化劑，在檸檬酸鹽緩沖溶液(pH值為7.0)中催化2-甲基-1,4-苯醌與正丁胺合成2-甲基-3-正丁胺酰-1-氫-4-醌,對(duì)脂肪酶催化Michael加成反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了探索,并建立了隨機(jī)順序雙雙機(jī)制反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2-甲基-1,4-苯醌(化合物1,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)和正丁胺(化合物2,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%)均購(gòu)自中國(guó)上海阿拉丁生化科技有限公司.所用酶為T(mén)richosporonlaibacchii(T.laibacchii)CBS5791的固定化脂肪酶,酶活力為1 280 U·g-1,該酶為本實(shí)驗(yàn)室自制活性酶.

1.2 固定化T. laibacchii脂肪酶的制備

稱取一定量的粗脂肪酶(細(xì)胞勻漿液),加入一定量的PEG4000、 K2HPO4和水，形成12% PEG4000/

13% K2HPO4的雙水相體系,利用旋渦混合器使體系充分混合，在室溫下以3 000 rpm的轉(zhuǎn)速離心5 min以加速相分離，小心地吸出上相(含有脂肪酶)并稱其質(zhì)量.往上相中加入適量的硅藻土(每單位活力脂肪酶加硅藻土0.8 mg)可使固定的脂肪酶易于過(guò)濾回收,將得到的混合物在30 ℃、150 rpm轉(zhuǎn)速條件下保溫2 h,過(guò)濾,用磷酸鹽緩沖液洗滌并真空干燥后,得到固定化的T.laibacchii脂肪酶[17].

1.3 固定化T.laibacchii脂肪酶催化2-甲基-1,4-苯醌與正丁胺的Michael加成反應(yīng)

為解決底物溶解性問(wèn)題,在反應(yīng)體系中添加體積分?jǐn)?shù)為2%～4%的甲醇,向20 mL反應(yīng)瓶中加入10 mL pH值為7.0的檸檬酸緩沖溶液，加入一定量的化合物1,使其物質(zhì)的量濃度為0.1 mmol·L-1,化合物2與化合物1的物質(zhì)的量之比為1.05∶1.00，然后加入固定化T.laibacchii脂肪酶，酶活性為25～50 U·mL-1,在轉(zhuǎn)速為200 rpm、溫度為40～50 ℃條件下反應(yīng)20～24 h.在反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液過(guò)濾以除去固定化T.laibacchii脂肪酶，濾液用乙酸乙酯萃取3次,合并萃取后的有機(jī)相,用無(wú)水MgSO4干燥,最后減壓蒸餾濃縮.用硅膠柱層析法對(duì)濃縮液進(jìn)行進(jìn)一步純化，用石油醚(PE)和乙酸乙酯(EA)作為洗脫劑，最終得到的產(chǎn)物為2-甲基-3-正丁胺酰-1-氫-4-醌(化合物3).

1.4 內(nèi)、外擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

在不同轉(zhuǎn)速(50～250 rpm)下進(jìn)行外擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，采用不同粒徑(0.1～0.9 mm)的固定化脂肪酶進(jìn)行內(nèi)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，其他試驗(yàn)條件與1.2節(jié)相同.

1.5 脂肪酶活性測(cè)定

采用“橄欖乳化法”[18]測(cè)定脂肪酶活力,在40 ℃、pH值為8.0的條件下，使用固定化T.laibacchii脂肪酶催化橄欖油水解反應(yīng)，1 min生成 1 μmol脂肪酸所需的脂肪酶被定義為一個(gè)脂肪酶活力單位(U).

1.6 HPLC分析

HPLC分析采用安捷倫Agilent1200高效液相色譜儀，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm).流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=80∶20,流速為0.5 mL·min-1,樣品進(jìn)樣體積為5 μL，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm.化合物3和2-甲基-3,5-正丁胺酰-1,4-苯二醇(化合物4)的保留時(shí)間分別為3.602 min和3.803 min.

2 動(dòng)力學(xué)模型

2.1 反應(yīng)機(jī)理及動(dòng)力學(xué)模型

反應(yīng)路線如圖1所示.固定化脂肪酶催化化合物2與化合物1進(jìn)行Michael加成反應(yīng)生成化合物3,化合物3有可能還會(huì)進(jìn)一步反應(yīng)生成二胺化副產(chǎn)物(4).在脂肪酶催化的Michael加成反應(yīng)中,由于反應(yīng)條件(如酶的活性、反應(yīng)溫度、反應(yīng)介質(zhì)的pH值等)是不同的,所以反應(yīng)可能會(huì)產(chǎn)生2種不同的產(chǎn)物.若脂肪酶有較好的區(qū)域選擇性,則產(chǎn)物以化合物3為主,否則副產(chǎn)物化合物4的生成量會(huì)增加.

化合物1

化合物3

化合物4

脂肪酶通過(guò)酸堿催化Michael加成反應(yīng)，由于在底物中沒(méi)有離去基團(tuán)，所以在反應(yīng)中不產(chǎn)生?；竅19].對(duì)于T.laibacchii脂肪酶催化正丁胺與2-甲基-1,4-苯醌的Michael加成反應(yīng)，本文提出一種初步的反應(yīng)機(jī)理:(i)底物與酶結(jié)合后，氧陰離子空穴使2-甲基-1,4-苯醌的α,β-不飽和羰基極化，這樣不僅有利于增加復(fù)合物的親電子能力，而且有利于后續(xù)烯醇化中間體的生成;(ii)正丁胺與上述步驟的復(fù)合物反應(yīng)可催化組氨酸使正丁胺去質(zhì)子化，并與極化后的苯醌進(jìn)行加成反應(yīng).在苯醌的C3處加入親核試劑后，質(zhì)子化的組氨酸將苯醌的α-碳質(zhì)子化生成雙鍵，使烯醇和羰基結(jié)構(gòu)相互轉(zhuǎn)化.

對(duì)于T.laibacchii脂肪酶催化的雙底物反應(yīng)，通常有乒乓機(jī)制[20-22]和三元復(fù)合機(jī)制2種反應(yīng)機(jī)理(如有序雙雙和隨機(jī)雙雙機(jī)制[23-26]).對(duì)于化合物1與化合物2的Michael加成反應(yīng)，由于底物缺少離子化基團(tuán)，所以乒乓機(jī)制并不適用.本文將對(duì)這2種機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，包括相關(guān)動(dòng)力學(xué)模型的建立和模擬值與實(shí)驗(yàn)值的比較，最終推測(cè)出底物與酶最可能的結(jié)合順序.將基于以下2種不同的機(jī)理建立動(dòng)力學(xué)方程.

2.1.1 隨機(jī)雙雙機(jī)制 采用King-Altman方法建立的隨機(jī)雙雙機(jī)制的速率方程如下:

[A]=[A0](1-Y1-Y2),

[B]=[B0](1-Y1-2Y2),

其中[A]為2-甲基-1,4-苯醌的物質(zhì)的量濃度(mmol·L-1);[A0]為2-甲基-1,4-苯醌的初始物質(zhì)的量濃度(mmol·L-1);[B]為正丁胺的物質(zhì)的量濃度(mmol·L-1);[B0]為正丁胺的初始物質(zhì)的量濃度(mmol·L-1);Y1為化合物3的產(chǎn)率(%);Y2為化合物4的產(chǎn)率(%).

∑K=K1+K2[A]+K3[B]+K4[A][B]+K5[B][B]+K6[A][A]+K7[A][B][B]+K8[A]·[A][B]+K9[A][A][B][B]+K10[B][B][B],

dY1/dt=K11exp(-K12/RT)[A][B][E0]/

[A0]/∑K,

(1)

dY2/dt=K13exp(-K14/RT)[A][B][B][E0]/

[B0]/∑K,

(2)

其中R為氣體常數(shù)(8.314 J·mol-1·K-1),T為溫度(K).式(1)和式(2)分別代表產(chǎn)物P1(3)和P2(4)的反應(yīng)速率,它們構(gòu)成一個(gè)微分方程組,共有14個(gè)模型參數(shù)(見(jiàn)表1).

2.1.2 有序雙雙機(jī)制 同樣采用King-Altman方法，建立了有序雙雙機(jī)制的速率方程,包含10個(gè)模型參數(shù).

∑K=K1+K2[A]+K3[B]+K4[A][B]+K5[B][B]+K6[A][B][B],

dY1/dt=K7exp(-K8/RT)[A][B][E0]/[A0]/

∑K,

(3)

dY2/dt=K9exp(-K10/RT)[A][B][B][E0]/

[B0]/∑K.

(4)

其中R為氣體常數(shù)(8.314 J·mol-1·K-1),T為溫度(K).

2.2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的估計(jì)

聯(lián)合使用解微分方程和最優(yōu)化方法計(jì)算反應(yīng)速率方程中的動(dòng)力學(xué)參數(shù).通過(guò)最小化目標(biāo)函數(shù)擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)估算模型參數(shù)(K1,K2,…,K14):

F=∑∑∑|(Yestimijk-Yexpijk)/Yestimijk|×100.

(5)

其中Yestimijk、Yexpijk為估產(chǎn);i=1,2(即產(chǎn)品3和4),j=1,2,3(即40 ℃,45 ℃,50 ℃);k為實(shí)驗(yàn)點(diǎn),k=1,2,…,12.

由式(5)可見(jiàn)，通過(guò)對(duì)計(jì)算后的常微分方程數(shù)值解的分析，擬定了最優(yōu)化方法，實(shí)驗(yàn)將2者進(jìn)行充分結(jié)合，K1～K14的參數(shù)估計(jì)如表1所示.本文用擬合值與實(shí)驗(yàn)值之差的絕對(duì)值進(jìn)行計(jì)算，不會(huì)增加偏差的非線性相關(guān)數(shù)值.利用Matlab6.5軟件計(jì)算，使用子程序ode45數(shù)值求解微分方程(1)和(2)或(3)和(4),用優(yōu)化子程序fmincon進(jìn)行最優(yōu)化計(jì)算.

表1 動(dòng)力學(xué)模型的估計(jì)參數(shù)

3 結(jié)果與討論

3.1 內(nèi)外擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

3.1.1 內(nèi)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 使用不同粒徑的固定化酶顆粒進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，粒徑范圍為0.1～0.9 mm，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.由圖2可見(jiàn):當(dāng)固定化T.laibacchii酶粒徑為0.1～0.5 mm時(shí)，化合物3的產(chǎn)率沒(méi)有明顯變化,此時(shí),可忽略內(nèi)擴(kuò)散限制.當(dāng)固定化T.laibacchii酶粒徑大于0.5 mm時(shí)，隨著粒徑的增大，產(chǎn)率降低，這表明當(dāng)固定化脂肪酶的粒徑大于 0.5 mm時(shí)，反應(yīng)受內(nèi)部擴(kuò)散傳質(zhì)的影響從而控制了產(chǎn)物產(chǎn)量.此時(shí)，內(nèi)擴(kuò)散傳質(zhì)對(duì)產(chǎn)物的影響不能忽略.底物首先經(jīng)內(nèi)擴(kuò)散到達(dá)催化劑表面并在達(dá)到一定濃度后與酶蛋白結(jié)合，才能發(fā)生酶促反應(yīng).在該反應(yīng)體系中，當(dāng)固定化酶粒徑大于0.5 mm時(shí)， 隨著內(nèi)擴(kuò)散阻力的增加，對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率也有一定影響.因此,本文選擇粒徑為0.5 mm的固定化脂肪酶用于后續(xù)催化實(shí)驗(yàn).

注:溫度為50 ℃,攪拌速度為200 rpm.

3.1.2 外擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 采用不同轉(zhuǎn)速(50～250 rpm)進(jìn)行了外擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，考察轉(zhuǎn)速對(duì)2-甲基-1,4-苯醌的產(chǎn)率的影響，其他實(shí)驗(yàn)條件與內(nèi)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)相同,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.在含有固定化酶的非均相體系中，底物和產(chǎn)物都需要在本體溶液和固定化酶顆粒之間擴(kuò)散[27-28].由圖3可見(jiàn):當(dāng)攪拌速度從50 rpm增加到150 rpm時(shí)，化合物3的產(chǎn)率從31.0%增加到67.5%，這表明在此轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)存在限制外擴(kuò)散傳質(zhì)的因素.當(dāng)轉(zhuǎn)速度從175 rpm增加到250 rpm時(shí)，化合物3的產(chǎn)率并沒(méi)有明顯增加，這表明當(dāng)轉(zhuǎn)速大于175 rpm時(shí)外擴(kuò)散限制可忽略不計(jì).所以,本文選擇轉(zhuǎn)速為200 rpm進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)以達(dá)到最佳的催化效果.

注:溫度為50 ℃,固定化酶粒徑為0.5 mm.

由上述討論可知，當(dāng)固定化脂肪酶顆粒直徑為0.5 mm、攪拌速度為200 rpm時(shí)，內(nèi)外擴(kuò)散傳質(zhì)阻力均可忽略，此時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)為固有動(dòng)力學(xué).

3.2 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行了固定化脂肪酶催化2-甲基-1,4-苯醌和正丁胺的Michael加成實(shí)驗(yàn)，底物正丁胺和苯醌的物質(zhì)的量之比為1.05∶1.00,pH值為7.5.圖4分別給出了在40 ℃、45 ℃和50 ℃下化合物3的產(chǎn)率.如圖4所示，單胺化產(chǎn)物3的最高產(chǎn)率約為98.0%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其副產(chǎn)物化合物4的產(chǎn)率(最高產(chǎn)率約為1.6%,圖4中未給出).上述結(jié)果表明所使用的固定化脂肪酶對(duì)2-甲基-1,4-苯醌和正丁胺的Michael加成反應(yīng)具有良好的區(qū)域選擇性.

對(duì)于酶催化反應(yīng)，產(chǎn)物產(chǎn)率取決于酶的選擇性、反應(yīng)介質(zhì)的pH值和底物的比例[29].S. Hertera等[30]利用漆酶合成了絲裂霉素單胺化產(chǎn)物，結(jié)果表明:當(dāng)pH值為7.0且苯醌與胺的物質(zhì)的量之比為1.00∶1.20時(shí)，單胺產(chǎn)物的產(chǎn)率較高.相反，當(dāng)pH值為5.0且苯醌與胺的物質(zhì)的量之比為1.00∶2.50時(shí)，二胺產(chǎn)物生成量相對(duì)較多.K. Haghbeen等[31]也報(bào)道了合成對(duì)苯醌和鄰苯醌的類(lèi)似實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在使用過(guò)量胺供體的核胺化反應(yīng)中，二胺化產(chǎn)物的生成也會(huì)增加[32-33].

3.3 溫度的影響

考察了不同溫度對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響.當(dāng)攪拌速度為200 rpm、脂肪酶活性為50 U·mL-1、底物物質(zhì)的量之比n(苯醌)∶n(胺)=1.00∶1.05時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.由圖4可知:當(dāng)反應(yīng)溫度從40 ℃升高到50 ℃時(shí)，產(chǎn)物3的產(chǎn)率逐步上升.在50 ℃時(shí)反應(yīng)12 h后，產(chǎn)物3的產(chǎn)率為97.2%；而在45 ℃反應(yīng)15 h時(shí)，化合物3的產(chǎn)率達(dá)到97.2%；在40 ℃反應(yīng)19 h時(shí)化合物3的產(chǎn)率達(dá)到97.1%，這說(shuō)明:隨著溫度的升高，反應(yīng)呈現(xiàn)加速趨勢(shì).

圖4 化合物3的改進(jìn)隨機(jī)雙雙模型模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

一般來(lái)說(shuō)，較高的溫度有利于酶催化反應(yīng)的速率增加，也有利于降低反應(yīng)物與酶底物復(fù)合物形成的反應(yīng)能壘，從而提高反應(yīng)速率與轉(zhuǎn)化率[20].本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:T.laibacchii脂肪酶在50 ℃下具有良好的熱穩(wěn)定性.因此,為保持固定化脂肪酶的催化效率,本文選擇50 ℃為最適溫度，此時(shí)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率是相對(duì)最高的.

3.4 底物物質(zhì)的量濃度的影響

在一般情況下，若在酶催化反應(yīng)中底物物質(zhì)的量濃度過(guò)高,則相應(yīng)的反應(yīng)速度反而會(huì)下降，導(dǎo)致底物抑制產(chǎn)率下降[34].由于單一底物或雙底物對(duì)酶都可能有抑制作用，所以本文可以通過(guò)保持一種底物的恒定然后改變另一種底物的物質(zhì)的量濃度來(lái)分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn).但是,在該生物催化反應(yīng)中，2種底物的物質(zhì)的量濃度都很低，因此酶的抑制作用可以忽略.通過(guò)改變這2種底物的物質(zhì)的量濃度進(jìn)行底物抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖5所示.由圖5可知:當(dāng)化合物1的物質(zhì)的量濃度從5 mmol·L-1增加到15 mmol·L-1(即n(化合物2)∶n(化合物1)=1.05∶1.00)時(shí)，底物物質(zhì)的量濃度的增加對(duì)化合物3的產(chǎn)率沒(méi)有明顯影響.因此，當(dāng)化合物1的物質(zhì)的量濃度范圍為5～15 mmol·L-1時(shí),2種底物對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)都沒(méi)有抑制作用.

注:溫度為50 ℃，固定化酶粒徑為0.5 mm，攪拌速度為200 rpm.

3.5 動(dòng)力學(xué)模型

圖4給出了化合物3和4的產(chǎn)率的隨機(jī)雙雙機(jī)制模型的模擬值與實(shí)驗(yàn)值，化合物3和4的最高產(chǎn)率分別約為98.0%和1.6%，化合物3的產(chǎn)率遠(yuǎn)高于化合物4.根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物3的隨機(jī)雙雙機(jī)制的模擬產(chǎn)率與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比,對(duì)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)偏差分布進(jìn)行擬合,其平均偏差與最大偏差分別為11.25%和28.57%，且偏差數(shù)據(jù)服從關(guān)于y=0的軸對(duì)稱分布(見(jiàn)圖6).這表明模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合匹配程度很高.根據(jù)有序雙雙機(jī)制模擬得到的模擬值與實(shí)驗(yàn)值的實(shí)時(shí)偏差分布，得到其平均偏差與最大偏差分別為21.7%與68.6%，且偏差數(shù)據(jù)服從關(guān)于y=0的軸不對(duì)稱分布,這說(shuō)明模型擬合程度并不適合Michael加成反應(yīng).因此,從擬合效果來(lái)看，隨機(jī)雙雙機(jī)制模型優(yōu)于有序雙雙機(jī)制模型.本文同時(shí)使用不同溫度的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用于估計(jì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，將微分方程數(shù)值解與非線性優(yōu)化方法結(jié)合，直接確定了包括活化能在內(nèi)的多個(gè)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，在一定程度上簡(jiǎn)化了動(dòng)力學(xué)參數(shù)的估計(jì)過(guò)程，提高了計(jì)算效率.

注:包括78個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn).相對(duì)偏差為(Yestimijk-Yexpijk)/Yestimijk×100.(a)采用改進(jìn)的隨機(jī)雙雙機(jī)制,(b)采用改進(jìn)的有序雙雙機(jī)制.

大多數(shù)生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的活化能范圍為2～40 kJ·mol-1,2種模型動(dòng)力學(xué)模型的活化能均在7.68～23.5 kJ·mol-1之間(見(jiàn)表1),這說(shuō)明本文所提出的動(dòng)力學(xué)模型較好地?cái)M合了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).一般地,所有的吸附或平衡常數(shù)都必須為正符號(hào)，而表1中的所有模型常數(shù)都恰好滿足這一點(diǎn).根據(jù)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的優(yōu)劣程度來(lái)判斷反應(yīng)機(jī)制[25],由于基于隨機(jī)雙雙機(jī)制的模型的擬合效果顯著優(yōu)于有序雙雙機(jī)制,所以可以判斷本研究的固定化脂肪酶催化Michael加成反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)制是改進(jìn)的隨機(jī)雙雙機(jī)制.對(duì)于本次研究中所使用的固定化脂肪酶，可以忽略內(nèi)部和外部傳質(zhì)阻力的影響.

4 結(jié)論

本文進(jìn)行了固定化T.laibacchii脂肪酶催化的2-甲基-1,4-苯醌與正丁胺的Michael加成反應(yīng)制備絲裂霉素類(lèi)似物2-甲基-3-正丁胺酰-1-氫-4-醌的動(dòng)力學(xué)模型研究.該反應(yīng)在檸檬酸緩沖溶液(pH值為7.0)中進(jìn)行,固定化脂肪酶選擇性良好,產(chǎn)物產(chǎn)率達(dá)到98%,并建立了反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型.本文提出的Michael加成反應(yīng)機(jī)理是:在底物與酶結(jié)合后，氧陰離子空穴使2-甲基-1,4-苯醌的α,β-不飽和羰基極化，這不僅有利于增加復(fù)合物的親電子能力，而且有利于后續(xù)烯醇化中間體的生成.正丁胺與上述步驟的復(fù)合物反應(yīng)可催化組氨酸使正丁胺去質(zhì)子化，并與極化后的苯醌進(jìn)行加成反應(yīng).本文提出了改進(jìn)的有序雙雙與隨機(jī)雙雙機(jī)制，經(jīng)比較最終判斷該反應(yīng)遵循改進(jìn)的隨機(jī)雙雙反應(yīng)機(jī)制，并確定了相關(guān)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)，得到的模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值的平均相對(duì)偏差為11.25%，且偏差服從關(guān)于y=0的軸對(duì)稱分布.采用微分方程數(shù)值解與非線性優(yōu)化方法，確定了最優(yōu)動(dòng)力學(xué)參數(shù).通過(guò)內(nèi)外擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)得到反應(yīng)的最適條件:固定化酶粒徑為0.5 mm，攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm.此時(shí)消除了內(nèi)外擴(kuò)散的影響,底物濃度較低,未見(jiàn)明顯底物抑制,建立的動(dòng)力學(xué)模型為固定化酶固有動(dòng)力學(xué)模型.