李德雄 曹潤(rùn)源 陳江

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，福州 350000；2.福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔顱面種植研究中心，福州 350002

在臨床種植中，尤其是在美學(xué)區(qū)種植中，充足的口腔軟組織厚度常常是術(shù)區(qū)輪廓豐滿度和避免唇側(cè)牙槽骨吸收的保障[1]。但患者往往存在不同程度的軟組織厚度不足，需要施行軟組織增量手術(shù)。這往往需要在術(shù)區(qū)植入自體軟組織或人工替代材料以增加局部軟組織的厚度，從而達(dá)到恢復(fù)缺損輪廓豐滿度、改善美觀及保障種植成功率的目的[2]。

目前，盡管上皮下結(jié)締組織移植仍然是最有效的軟組織增厚方式[3-4]，但自體組織移植需開辟額外術(shù)區(qū)，增加了患者感染、疼痛、不適等并發(fā)癥。因此，探索其替代材料便成為了研究熱點(diǎn)[4]。目前常用于軟組織增厚的替代材料主要為脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及膠原基質(zhì)。然而，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)厚度不足，需折疊使用才能獲得足夠的初始厚度，但將其折疊一定程度上可能會(huì)影響移植后局部組織的血運(yùn)重建[5-6]。而膠原基質(zhì)的降解速率快，移植后收縮率較高，效果不及自體結(jié)締組織移植[7-8]，而交聯(lián)后的膠原雖然降解時(shí)間延長(zhǎng)，但生物相容性會(huì)受到影響，植入初期炎癥反應(yīng)較重[9-10]。因此，自體結(jié)締組織移植在口腔軟組織增厚中的“金標(biāo)準(zhǔn)”地位依然穩(wěn)固，要想獲得理想的替代材料，還需要更多的相關(guān)研究。理想的口腔軟組織增厚材料應(yīng)當(dāng)在具備良好生物相容性的前提下，能夠獲得三維空間上軟組織量的增加，并長(zhǎng)期維持穩(wěn)定。因此，保證支架材料具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和適當(dāng)?shù)慕到庑阅?，是探索口腔軟組織增厚材料的關(guān)鍵。

絲素蛋白作為一種天然來源的材料，近年來被廣泛應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)、肌肉或神經(jīng)重建，臟器再生等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[11-14]，但在口腔軟組織增厚方面的研究卻鮮有報(bào)道。絲素蛋白分子存在SilkⅠ和SilkⅡ兩種構(gòu)型，Ⅰ型結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易降解；Ⅱ型結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，其占比越高，材料機(jī)械強(qiáng)度越大，可降解性越低[11]，而SilkⅠ、Ⅱ兩種結(jié)構(gòu)的相對(duì)比例受到許多因素（如絲素種類、溫度、濃度、處理方式）的影響。因此，通過控制制備過程中的各項(xiàng)因素，就可以調(diào)節(jié)絲素蛋白材料的機(jī)械性能和降解速率[15]，從而獲得適用于口腔軟組織增厚的絲素蛋白支架，達(dá)到“因地制宜”的效果。

本研究旨在利用不同濃度的再生絲素蛋白溶液制備多孔支架材料，通過檢測(cè)其理化性能及體內(nèi)生物學(xué)性能，初步探索絲素蛋白支架材料在口腔軟組織增厚方面的應(yīng)用潛能。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

甲醇（汕頭市西隴化工廠有限公司），純度≥99.5%的無水碳酸鈉（Sigma 公司，美國(guó)），ⅩⅣ型蛋白酶（鏈蛋白酶E）（Sigma 公司，美國(guó)）；吉特瑞醫(yī)用膠原基質(zhì)（福州市福建博特生物有限公司），4%Biosharp 組織固定液（合肥蘭杰柯科技有限公司），純度99.9%溴化鋰；36 mm 析袋，Mas‐son 三色染色試劑盒（福州邁新生物有限公司），蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosinra，HE）染色液（廈門泰普生物技術(shù)有限公司）。

1.2 不同濃度絲素蛋白多孔支架的制備與表征檢測(cè)

洗凈后的蠶繭殼在0.02 mol·L-1的碳酸鈉水溶液中經(jīng)30 min 煮沸脫膠多次、去離子水沖洗及烘干后制得蠶絲，取20 g 蠶絲于60 ℃下溶解于100 mL溴化鋰（9.3 mol·L-1）溶液中，經(jīng)透析、離心、過濾后獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的絲素蛋白原液。將原液進(jìn)一步稀釋為質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、3%及5%后，分別加入24 孔模具中冷凍，再經(jīng)真空冷凍干燥，甲醇浸泡30 min 以獲得不溶性，一級(jí)水反復(fù)沖洗，真空干燥箱內(nèi)干燥，最終得到3種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的絲素蛋白多孔支架：1%記為SF1組、3%記為SF3組、5%記為SF5組。

利用EVO18 型掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）（Zeiss 公司，德國(guó)）、Nicolet 6700 型傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜（fourier transform in‐frared spectrum，F(xiàn)TIR）（Thermo Scientific 公司，美國(guó)）、D8 Advanced 型X 射線衍射（X-ray dif‐fraction，XRD）（Bruker 公司，德國(guó)）、Sta205 型差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，D-SC）（Netzsch 公司，德國(guó)）檢測(cè)3 組支架的物理表征。使用Image J 軟件旋轉(zhuǎn)SEM 圖片的5 個(gè)區(qū)域孔隙，分析支架的孔徑大小。支架孔隙率則用液體（甲醇）稱重法測(cè)得，每組均取5 個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)試。

1.3 支架降解性檢測(cè)

將3 組支架分別稱重（n=5），記錄初始質(zhì)量m0，在37 ℃環(huán)境下浸泡于1 U·mL-1含鏈蛋白酶E的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer solution，PBS）中，分別于2、4、8、12、24 h及3、5、7、10、14、21 d時(shí)間點(diǎn)取出支架，沖洗、烘干后再次稱重，記錄剩余質(zhì)量m1，剩余質(zhì)量百分比=m1/m0×100%。

1.4 動(dòng)物模型的建立

將12 只雄性新西蘭大白兔（2～3 月齡，2.5～3.0 kg）隨機(jī)分為3 組，根據(jù)將要植入的支架材料分別記為SF1、SF3、SF5組，每組各4只，分別于上頜左右兩側(cè)隨機(jī)植入絲素蛋白支架（實(shí)驗(yàn)側(cè)）及膠原基質(zhì)（對(duì)照側(cè)）。

具體術(shù)式如下：耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉實(shí)驗(yàn)兔，起效后于上頜切牙遠(yuǎn)中3 mm 處作一約5 mm 垂直切口達(dá)骨膜（圖1A），隨后沿切口向遠(yuǎn)中鈍性分離黏膜，形成一“軟組織袋”（圖1B），然后在袋內(nèi)將預(yù)先潤(rùn)濕修剪為5 mm×5 mm×5 mm的3 組支架或膠原基質(zhì)分別植入，縫合關(guān)創(chuàng)（圖1C、D）。術(shù)后肌注青霉素鈉（1×105U·kg-1）預(yù)防感染，進(jìn)軟食3 d。

1.5 黏膜厚度及形態(tài)觀測(cè)

分別于術(shù)前（T0）、術(shù)后即刻（T1）及術(shù)后3個(gè)月（T2）記錄實(shí)驗(yàn)兔的黏膜厚度變化情況，黏膜厚度測(cè)量方法如下：采用10#K 銼垂直于術(shù)區(qū)黏膜刺入黏膜直達(dá)骨面，將K 銼橡膠墊與黏膜表面輕輕接觸，銼尖端至橡膠墊的距離即為該處黏膜厚度（取5點(diǎn)記平均值）。

1.6 組織學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)兔處死后切取術(shù)區(qū)及周圍1 mm 范圍組織，經(jīng)4%多聚甲醛液固定、脫水、浸蠟、包埋后制作石蠟切片，分別利用HE 染色及Masson 三色染色切片后觀察：1）材料降解程度；2）炎癥反應(yīng)程度；3）新生血管；4）新生膠原纖維。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

本研究采用SPSS 22.0 軟件處理和分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)的展示均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s），采用K-S檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性，并利用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）統(tǒng)計(jì)差異性，多組間比較采用Tukey法，檢驗(yàn)效能取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 絲素蛋白多孔支架的表征

圖2 示：3 種不同濃度的絲素溶液冷凍干燥形成的支架都具有相互連通的不規(guī)則多孔隙結(jié)構(gòu)，其孔壁呈薄葉狀；而不同濃度的支架孔徑大小及孔隙率則略有不同，SF1、SF3、SF5 組的孔徑分別為（80.61±30.63）、（133.40±22.85）、（34.88±15.96）μm；孔隙率分別為95.13%±6.56%、90.05%±4.23%、86.85%±3.13%。同樣的合成方法下，隨著濃度的增加，絲素蛋白多孔支架的孔隙率呈遞減趨勢(shì)（SF1 組＞SF3 組＞SF5 組）；而孔徑大小則是SF3組＞SF1組＞SF5組。

3組支架的不同表征分析結(jié)果見圖3。圖3A 中3 組支架材料均在1 630 cm-1波段附近出現(xiàn)吸收峰，表明其主要結(jié)構(gòu)為更加穩(wěn)定的SilkⅡ型。圖3B 的XRD 結(jié)果也顯示3 種濃度的支架都在20°左右出現(xiàn)Silk Ⅱ結(jié)構(gòu)的特征峰；而在10°～35°區(qū)間內(nèi)，SF1衍射峰比SF3 及SF5 更加陡峭，表明其結(jié)晶度更高，β 折疊結(jié)構(gòu)占比更高。DSC 曲線（圖3C）顯示：3 組支架均在50 ℃附近出現(xiàn)一個(gè)吸熱峰，在250～300 ℃出現(xiàn)第二個(gè)吸熱峰，3 組材料的吸熱峰和降解峰未發(fā)現(xiàn)明顯差異，表明其結(jié)晶度或二級(jí)結(jié)構(gòu)接近。熱重結(jié)果（圖3D）表明：3 組材料在300 ℃附近才出現(xiàn)了明顯的失重，熱重曲線接近，也說明了3組支架的主要結(jié)構(gòu)相似，濃度的差異并未對(duì)其基礎(chǔ)構(gòu)象造成太大影響。

2.2 支架體外降解結(jié)果

鏈蛋白酶E 對(duì)3 種支架中的蛋白酶解后支架剩余質(zhì)量比重的結(jié)果如圖4所示：SF1、SF3、SF5三組支架的酶解趨勢(shì)相似，在前7 d 最為迅速，而后逐漸變緩；但不同SF 濃度的支架在24 h 內(nèi)的質(zhì)量變化稍有不同，降解量SF1組最大，隨著絲素蛋白濃度的增加，SF3、SF5 組的降解量逐漸減??；浸泡于鏈蛋白酶E-PBS 溶液中21 d 后，SF1、SF3、SF5組的剩余質(zhì)量分別為65.85%、73.67%、76.28%。

2.3 實(shí)驗(yàn)兔黏膜厚度改變

圖5A 顯示了實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)3 個(gè)時(shí)間T0、T1、T2時(shí)的術(shù)區(qū)黏膜厚度變化，由此可見，3 組的實(shí)驗(yàn)側(cè)在術(shù)后即刻（T1）的黏膜厚度都明顯增加，除SF1 組外，增加幅度也大致相同；而到術(shù)后3 個(gè)月（T2），SF1 實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)的黏膜厚度明顯萎縮，SF3 組實(shí)驗(yàn)側(cè)的厚度略微減少，SF5 組實(shí)驗(yàn)側(cè)的厚度維持較穩(wěn)定。

圖5B 則進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析了術(shù)后3 個(gè)月黏膜凈增厚量Δ（T2-T0）與材料收縮量Δ（T2-T1）：與術(shù)前（T0）相比，術(shù)后3 個(gè)月（T2）各組實(shí)驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)黏膜厚度Δ（T2-T0）均有增加；但相比于對(duì)照側(cè)的增加量，除SF1組與對(duì)照側(cè)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，SF5 及SF3 組厚度的增加量均遠(yuǎn)大于對(duì)照側(cè)（F=1 131，P＜0.000 1）；而相對(duì)于術(shù)后即刻（T1），各組材料在3 個(gè)月后的黏膜厚度都有一定收縮量Δ（T2-T1），但是SF5＜SF3＜SF1＜對(duì)照側(cè)（F=608.9，P＜0.000 1）。

2.4 組織學(xué)染色結(jié)果

術(shù)后3 個(gè)月的組織切片染色結(jié)果如圖6 所示，圖6可見對(duì)照側(cè)的HE及Masson染色未見膠原基質(zhì)殘留及炎癥浸潤(rùn)，難以明確鑒別新生組織（圖6A、B），膠原纖維排列較密集（圖6C）。

在SF1 組中，HE 染色也未見明顯支架殘留或炎癥浸潤(rùn)，骨膜上方可見新生膠原纖維，與黏膜下層原有膠原纖維排列方向不同，之間可見較多新生血管（圖6E）；Masson 染色可見藍(lán)染的新生膠原纖維（圖6F）。

而在SF3 組中，HE 染色可見SF3 支架大部分降解，無明顯炎癥浸潤(rùn)，新生組織中可見數(shù)量較多的血管與膠原纖維，個(gè)別層面可觀察到細(xì)小的、尚未完全降解的支架碎片（圖6H），有的碎片周圍有膠原纖維包裹，纖維中可見少量炎癥細(xì)胞；Masson 染色可見較密集的新生膠原纖維及血管（圖6I）。

SF5 組的HE 染色可以明顯發(fā)現(xiàn)支架內(nèi)部仍未降解，外周被新生的膠原纖維包裹，中心部可見支架碎片殘留及大量蛋白黏液滲出物（圖6J），纖維包囊中可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，如紅色箭頭示巨噬細(xì)胞（圖6K）；Masson 染色（圖6L）可觀察到材料中心的殘留及大量滲出物，外周被致密的膠原纖維包裹。

3 討論

支架材料用于口腔軟組織增厚具有良好的應(yīng)用前景，但降解過快等問題很大程度限制了諸如目前常用的膠原基質(zhì)材料在軟組織增厚應(yīng)用的遠(yuǎn)期效果[9]。與膠原在體內(nèi)的快速降解不同，結(jié)構(gòu)呈高度結(jié)晶狀的天然絲素蛋白在體內(nèi)完全降解需要數(shù)月甚至數(shù)年[11]，且其可通過工藝改善和調(diào)節(jié)其降解性能并加工成纖維、凝膠或三維支架等各種形態(tài)[16-17]。

通常冷凍干燥法制得的絲素蛋白材料易溶于水，為了使其獲得不溶性，一般采用水退火或甲醇浸泡處理，但是水退火處理后材料無定形結(jié)構(gòu)更多，易降解，而經(jīng)甲醇浸泡處理后會(huì)形成更多的SilkⅡ型結(jié)構(gòu)，相同條件下降解速率減慢[18-20]。本研究中，SF1、SF3、SF5 主要構(gòu)象也均為穩(wěn)定性較高的SilkⅡ型，其體外降解速率也較以往對(duì)絲素蛋白支架的研究類似，在1周內(nèi)稍快，而后降解率逐漸減慢并穩(wěn)定，但總體較以往研究為慢[21-23]。結(jié)合體內(nèi)病理觀測(cè)到的3個(gè)月后的支架殘留，可以發(fā)現(xiàn)除SF1 外，SF3、SF5 的降解周期要大于3個(gè)月。

不同濃度絲素蛋白也會(huì)影響支架的性能[15]，其中支架的孔隙等微觀結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖有著重要的影響，足夠大小的孔徑以及孔隙內(nèi)部的相互連通對(duì)新生組織內(nèi)氧的傳輸及代謝產(chǎn)物的排出十分重要[24-25]。Salem 等[25]提出，適宜的組織工程學(xué)支架孔徑大小應(yīng)該在30～500 μm之間。對(duì)于孔隙率而言，有研究[26-27]指出，90%以上的孔隙率可能有利于細(xì)胞長(zhǎng)入支架內(nèi)部及增殖。本研究中，除SF5 的孔徑及孔隙率較低外，SF1、SF3 均滿足生物應(yīng)用要求。冷凍干燥制作支架的方式則能夠通過冰晶的升華從而在支架內(nèi)直接產(chǎn)生空的腔隙，其產(chǎn)生的孔隙最適合于細(xì)胞的生長(zhǎng)與組織的新生。濃度增加后，絲素蛋白溶液更為黏稠，導(dǎo)致制取的支架孔隙隨濃度增加而減小。但相比于SF3，SF1濃度低而孔徑卻小，可能是由于其支架結(jié)構(gòu)較疏松，抗壓能力較差，甲醇浸泡過程中支架體積收縮所致。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在評(píng)價(jià)材料的組織相容性方面有重要意義，對(duì)于軟組織支架材料，現(xiàn)有研究多采用大鼠背部皮下移植或兔頭皮下移植作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚21,23,28-32]，雖易于操作和取材觀察，但無法模擬口腔內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)首次選擇兔上頜前、后牙之間的口腔黏膜作為術(shù)區(qū)，不僅定點(diǎn)容易，左右兩側(cè)均可手術(shù)，手術(shù)僅有一垂直切口，創(chuàng)傷小，移植材料不易暴露，并且該處黏膜較薄，黏膜下骨面平坦，易于研究和測(cè)量取材，可重復(fù)性好，將支架材料植入此處，一定程度上能夠模擬材料在口腔的受力情況。此外，盡管本實(shí)驗(yàn)未能模擬臨床上常見的牙槽嵴缺損或軟組織量不足的實(shí)際情況，但有研究[33-34]指出，人為創(chuàng)造的牙槽嵴缺損在短期內(nèi)會(huì)產(chǎn)生自發(fā)性修復(fù)的現(xiàn)象，故本研究?jī)H將支架材料植入黏膜下，單純觀察和對(duì)比各種材料在軟組織中的支架作用和組織整合能力。

支架材料植入口腔軟組織后受力復(fù)雜，手術(shù)方式、切口設(shè)計(jì)、植入物大小等諸多因素的影響使得植入部位具體的受力情況難以分析，因而難以依據(jù)機(jī)械性能對(duì)材料進(jìn)行篩選或直接測(cè)量口腔內(nèi)的各種作用力，體外采用生物模擬器等也難以精準(zhǔn)模擬[35]。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)前將各組材料于生理鹽水中浸泡，隨后將它們的厚度均修剪為5 mm，SF1 支架抗壓強(qiáng)度顯然不足，其植入實(shí)驗(yàn)兔口腔黏膜下后，受局部組織牽拉和表面黏膜壓力的影響，連同黏膜測(cè)得厚度僅為3.52 mm±0.10 mm，而SF3 和SF5 支架在植入即刻能夠維持一定的厚度（分別為4.86 mm±0.02 mm及5.01 mm±0.05 mm）。

術(shù)后3個(gè)月，術(shù)區(qū)黏膜厚度較術(shù)前均有所增加（SF1＜對(duì)照＜SF3＜SF5），但與材料植入即刻相比，SF1 組絲素蛋白支架及對(duì)照側(cè)膠原基質(zhì)收縮率較大，3個(gè)月時(shí)材料已完全降解，軟組織厚度都出現(xiàn)了顯著的減小；SF5組支架增厚效果最明顯，并且與術(shù)后即刻相比，術(shù)后3個(gè)月時(shí)黏膜厚度幾乎無變化，提示在此期間，SF5組支架能夠抵抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口腔內(nèi)各種作用力，很好地維持了支架的空間形態(tài)。然而，其組織學(xué)染色結(jié)果顯示，SF5組支架大部分未降解，內(nèi)部主要為蛋白黏液滲出物，而組織長(zhǎng)入較少，并在周圍的纖維包囊中觀察到了明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，說明SF5 植入后異物反應(yīng)較重，自體細(xì)胞難以長(zhǎng)入支架內(nèi)部，材料被新生膠原纖維包裹，且炎癥持續(xù)存在；SF3組黏膜增厚效果介于SF1 組和SF5 組之間，且術(shù)后3 個(gè)月大部分已降解，有較密集的新生血管與膠原纖維，雖然在個(gè)別層面上觀察到了尚未完全降解的細(xì)小支架碎片，但其周圍膠原纖維包囊中炎癥細(xì)胞數(shù)量已明顯減少，倘若增加觀察時(shí)間，這些殘留材料能夠完全降解的可能性很大。

不過，本研究仍存在一些局限：首先，采用穿黏膜法測(cè)量實(shí)驗(yàn)兔的口腔軟組織厚度，雖然簡(jiǎn)便，但精確度欠佳，多點(diǎn)測(cè)量取平均值亦難以避免誤差，且無法反映術(shù)區(qū)三維體積的變化，取模后數(shù)字化掃描-計(jì)算機(jī)重建-三維分析的方法（Moiré 法）[36]精確度更高，并且能反映特定區(qū)域組織三維體積的變化；其次，本實(shí)驗(yàn)組織學(xué)觀察未做免疫組化染色分析，因而無法量化分析新生血管密度等指標(biāo)，后續(xù)研究中，應(yīng)分階段、系統(tǒng)地觀察材料在體內(nèi)的降解模式，并且需要更長(zhǎng)的觀察時(shí)限，從而更好地評(píng)估增厚組織長(zhǎng)期的穩(wěn)定性。

綜上所述，形態(tài)學(xué)測(cè)量以及組織病理學(xué)染色結(jié)果初步證明了絲素蛋白支架應(yīng)用于增厚口腔軟組織的可行性，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的絲素蛋白支架的理化性能、組織相容性及黏膜增厚效果最佳。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。