曹牛奔 劉笑夢 鄧愉 劉歆嬋 辛雨 于維先，3，4

1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙周病科，長春 130021；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院種植科，長春 130021；3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院老年口腔科，長春 130021；4.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室，長春 130021

牙周炎是破壞牙周支持組織的細菌感染性疾病，我國第四次口腔健康流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，約90%的成年人罹患牙周病，其中將近30%的成年人患有重度牙周炎[1]。重度牙周炎不僅危害局部口腔健康，而且與2型糖尿病、阿爾茨海默病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種系統(tǒng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2]。非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fat‐ty liver disease，NAFLD）是最常見的慢性肝病之一，在全球范圍內(nèi)患病率約為25.2%[3]。近期一項流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在1 226 例患有NAFLD的成人人群中，牙周探診深度（probing depth，PD）≥4 mm的比率顯著，且NAFLD的發(fā)病率隨牙周炎嚴重程度的增加而上升[4]。由此可見牙周炎與NAFLD關(guān)系密切，但其具體機制尚未明了。

氧化應(yīng)激微環(huán)境是一系列慢性疾病的基礎(chǔ)[5]，也是牙周炎和NAFLD 共同致病因素?；钚匝酰╮e‐active oxygen species，ROS）在氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，被認為是氧化應(yīng)激反應(yīng)的“馬達”[6]。研究[7]表明，ROS 作為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）的上游調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控該信號分子的表達。其中，c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是MAPK 家族成員之一，介導(dǎo)對外界應(yīng)激信號做出反應(yīng)的基本生物過程，被認為是炎癥反應(yīng)和先天免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[8]。當(dāng)JNK 信號分子被多種細胞應(yīng)激活動如氧化應(yīng)激、遺傳毒性應(yīng)激和滲透應(yīng)激等激活后可促進炎癥介質(zhì)的釋放，進而加劇胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)和凋亡，最終造成組織損傷[9]。此外，NF-κB 作為JNK 的下游信號因子，在傳導(dǎo)細胞凋亡和炎癥信號中亦發(fā)揮了關(guān)鍵作用[10-11]。由于JNK/NF-κB 信號分子在多種細胞功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用，因此當(dāng)JNK/NFκB 信號分子被ROS 過度激活后可引發(fā)機體內(nèi)環(huán)境紊亂。

目前針對NAFLD 的防治依舊缺乏有效的措施和特異性藥物，未來以牙周炎為靶點可能為NAFLD的防治提供一種新的策略。因此，深入探討牙周炎誘導(dǎo)NAFLD的相關(guān)機制，對于NAFLD的防治具有重要意義。綜上，本研究旨在探討ROS/JNK/NFκB信號分子在牙周炎誘導(dǎo)肝損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

Micro-CT系統(tǒng)（SCANCO公司，瑞士）；油紅O 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；MitoSOX red 試劑（Thermo Fisher Science 公司，美國）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondial‐dehyde，MDA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotrans‐ferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotrans‐ferase，AST）生化試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Hoechst 染液（Sigma 公司，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；引物由上海生工生物工程有限公司合成；抗體JNK、磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（phosphorylation of c-Jun N-ter‐minal kinase，P-JNK）、NF-κB、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）（Cell Signaling Technolo‐gy 公司，美國）；BCL2-Associated X 的蛋白質(zhì)（BCL2-Associated X，Bax）、B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、β-肌動蛋白（β-ac‐tin）、二抗（Proteintech公司，美國）；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀、石蠟切片機（Ther‐mo 公司，美國）；實時熒光定量擴增儀（Agilent公司，美國）；RIPA 裂解液、BCA 試劑盒、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP 缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒和電化學(xué)發(fā)光（electrochemilumi‐nescence，ECL）顯色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；全自動化學(xué)發(fā)光凝膠成像顯影儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠牙周炎模型的構(gòu)建 12 只SPF 級雄性Wistar大鼠（6 周齡，200～220 g）隨機分為對照組和牙周炎組，每組各6只（購于吉林大學(xué)動物實驗中心）。牙周炎組大鼠在2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，采用0.2 mm 正畸結(jié)扎絲在雙側(cè)上頜第一磨牙頸部結(jié)扎構(gòu)建牙周炎模型。8周后檢查牙周臨床指標(biāo)并處死，然后迅速采集上頜骨、肝臟和血液用于后續(xù)實驗[12]。動物實驗經(jīng)吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準（批準編號：2021 年研審243號）。

1.2.2 牙周臨床指標(biāo)檢查 探查各組大鼠上頜第一磨牙牙齦狀況，并記錄牙周臨床指標(biāo)，具體如下。1）PD：用牙周探針在上頜第一磨牙頰腭側(cè)的近遠中及中央6 個位點進行探診，記錄PD 測量結(jié)果并取均值。2）牙齒動度（tooth mobility，TM）：用鑷子檢查上頜第一磨牙TM 情況。評價標(biāo)準為0：生理動度；1：僅頰腭向松動；2：頰腭及近遠中向松動；3：頰腭、近遠中向及垂直向均松動。3）出血指數(shù)（bleeding index，BI）：將牙周探針輕探入齦溝或袋底，取出探針30 s 后，觀察有無出血及出血程度，以Mazza 出血指數(shù)為評價標(biāo)準，0：牙齦健康，無炎癥和出血；1：牙齦輕度水腫，探診不出血；2：探診后有點狀出血；3：探診后出血沿齦緣擴展；4：探診后出血并溢出齦溝；5：自發(fā)性出血[13]。

1.2.3 Micro-CT 分析 采用Micro-CT 系統(tǒng)掃描上頜骨。Micro-CT 系統(tǒng)設(shè)置參數(shù)為70 kV、200 mA和300 ms 曝光時間（體素大小為10 μm×10 μm×10 μm），使用IPL軟件進行圖像處理并重建牙槽骨三維結(jié)構(gòu)。Image J 軟件分析上頜第一磨牙近中、中央及遠中釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x并取平均值。

1.2.4 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 采集大鼠上頜骨及肝組織，上頜骨置于10%乙二胺四乙酸溶液中脫鈣后，制作石蠟切片；肝組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定后制作石蠟切片。常規(guī)進行HE染色后鏡下觀察并拍照。

1.2.5 油紅O（oil red O）染色 采用油紅O 試劑盒對肝臟冰凍切片染色，以評估肝組織脂肪變性。4%多聚甲醛固定肝組織冰凍切片，沖洗后滴加油紅O 染液染色10 min，之后用60%異丙醇分化至間質(zhì)清晰并流水沖洗，蘇木精復(fù)染5 min，沖洗后甘油明膠封片，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對圖像進行分析并計算肝臟脂肪光密度總和。

1.2.6 MitoSOX red 染色 4%多聚甲醛固定肝臟冰凍切片，沖洗后滴加MitoSOX red 試劑。在37 ℃黑暗環(huán)境中孵育30 min，Hoechst 染液對細胞核進行染色，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 肝功能和氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定 采用商用生化試劑盒檢測血清中肝功指標(biāo)AST 和ALT 及肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA 和GSH，實驗步驟按照說明書指示進行。

1.2.8 qRT-PCR 檢測 Trizol 試劑提取肝組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后采用SYBRPrime-Script-TM qRT-PCR Kit 試劑盒進行qRT-PCR 反應(yīng)，檢測白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα-α，TNF-α）、NF-κB、Bax 和Bcl-2 mRNA 表達情況，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 基因序列Tab 1 Genetic sequence

1.2.9 Western blot 檢測 RIPA 裂解液提取新鮮肝組織總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST 洗滌后加入抗體JNK（1∶2 000）、

P-JNK（1∶2 000）、NF-κB（1∶2 000）、Caspase-3（1∶2 000）、Bax（1∶8 000）、Bcl-2（1∶2 000）、β-actin（1∶8 000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜后與二抗（1∶8 000）室溫孵育1 h，最后使用ECL顯色并通過Image J軟件分析灰度值。

1.2.10 TUNEL 染色 根據(jù)TUNEL 試劑盒說明書對肝組織石蠟切片進行染色，Hoechst 染液對細胞核進行染色后，在熒光顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

利用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用xˉ±s來表示，組間比較采用t檢驗分析，P＜0.05則認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建牙周炎模型

肉眼觀察對照組牙齦呈粉紅色，形態(tài)菲薄，質(zhì)地堅韌（圖1a）；而牙周炎組牙齦充血紅腫，齦緣肥厚，質(zhì)地松軟（圖1b）。牙周組織切片HE 染色結(jié)果顯示，與對照組相比，牙周炎組牙周組織上皮連續(xù)性破壞，固有層中有大量炎癥細胞浸潤，牙槽嵴吸收明顯（圖1c、d）。Micro-CT顯示牙周炎組牙槽骨骨質(zhì)較對照組吸收明顯（圖1e、f），且釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x（1.06 mm±0.09 mm）明顯大于對照組（0.68 mm±0.02 mm）（t=3.934，P=0.017）。此外，牙周炎組牙周臨床指標(biāo)PD、BI 和TM 值均明顯升高（表2）。以上結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建牙周炎模型。

表2 大鼠牙周臨床指標(biāo)Tab 2 Periodontal clinical indices of rats xˉ±s

2.2 肝大體照及組織病理學(xué)檢測結(jié)果

肉眼觀察牙周炎組肝臟較對照組體積增大，顏色變淺，邊緣圓鈍（圖2a、b）。肝組織HE 染色結(jié)果顯示，牙周炎組肝索排列紊亂，小葉內(nèi)及匯管區(qū)可見炎癥細胞浸潤，肝細胞胞漿內(nèi)可見白色脂肪空泡（圖2c～f）。油紅O 染色結(jié)果顯示，牙周炎組肝組織胞漿內(nèi)紅色脂滴明顯多于對照組（圖3）。以上結(jié)果表明牙周炎可誘導(dǎo)肝組織發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。

2.3 MitoSOX red染色結(jié)果

線粒體是產(chǎn)生ROS 的主要場所，MitoSOX red試劑可靶向檢測ROS含量。MitoSOX red是一種線粒體超氧化物熒光染料，被超氧化物氧化后可呈現(xiàn)紅色熒光，從而評估ROS含量。實驗結(jié)果示，牙周炎組肝組織中紅色熒光強度較對照組明顯增強，表明牙周炎組肝組織中ROS含量升高（圖4）。

2.4 氧化應(yīng)激標(biāo)志物和肝功檢測結(jié)果

SOD 和GSH 是生物體內(nèi)重要的抗氧化劑，MDA 是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物。AST 和ALT 是評價肝功能損傷的重要指標(biāo)。結(jié)果顯示，與對照組相比，牙周炎組肝組織中SOD、GSH 含量顯著降低，MDA 含量升高。血清中AST、ALT 含量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明牙周炎可誘導(dǎo)肝組織中發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)且損害肝功能（表3）。

表3 生化指標(biāo)檢測結(jié)果Tab 3 Biochemical index test results xˉ±s

2.5 qRT-PCR檢測結(jié)果

qRT-PCR 檢測肝組織中IL-6、TNF-α、Bax、NF-κB 和Bcl-2 mRNA 表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，牙周炎組肝組織中IL-6、TNF-α、Bax和NF-κB mRNA 表達水平顯著升高，Bcl-2 mRNA表達水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明牙周炎組肝組織中炎癥介質(zhì)和凋亡相關(guān)mRNA表達水平較對照組升高（圖5）。

2.6 Western blot檢測結(jié)果

提取肝組織總蛋白，Western blot 檢測肝組織中P-JNK/JNK、NF-κB、Caspase-3、Bax 和Bcl-2表達水平。與對照組相比，牙周炎組肝組織中PJNK/JNK、NF-κB、Caspase-3、Bax 表達水平明顯增高，Bcl-2 表達水平降低，Bax/Bcl-2 比值升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，與對照組相比，牙周炎組肝組織中JNK/NF-κB 信號分子被激活，且凋亡相關(guān)蛋白表達水平顯著升高（圖6）。

2.7 TUNEL染色結(jié)果

TUNEL 染色可將凋亡細胞呈現(xiàn)綠色熒光。結(jié)果顯示，牙周炎組肝組織中綠色熒光強度較對照組增強，表明牙周炎組肝組織中凋亡水平升高（圖7）。

3 討論

牙周炎和NAFLD 均為慢性炎癥性疾病，有共同的危險因素，兩者間相互作用，均表現(xiàn)為組織內(nèi)部發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，然而牙周炎誘發(fā)肝損傷的具體機制尚不清楚。因此，本研究以氧化應(yīng)激為切入點，探討牙周炎誘導(dǎo)肝損傷的具體機制。

ROS 在機體內(nèi)發(fā)揮“雙刃劍”作用：一方面ROS 本身具有殺菌抗菌能力，在生理狀態(tài)下可以幫助殺死入侵機體的病原菌。另一方面，當(dāng)ROS被過度激活在體內(nèi)大量積累會引起機體氧化-抗氧化失衡，導(dǎo)致機體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終引起組織損傷[16]。Mohs 等[17]研究報道，ROS 的過度產(chǎn)生可導(dǎo)致脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的破壞，從而導(dǎo)致肝細胞內(nèi)脂質(zhì)的過度積累。因此，氧化應(yīng)激是NAFLD 發(fā)病和進展的重要因素之一。

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者齦溝液、唾液和血清中氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物水平較牙周健康者顯著升高[18]。而通過手術(shù)或非手術(shù)治療等方式對牙周炎進行干預(yù)可有效降低全身氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物水平[19]?；谝陨涎芯坎聹y牙周炎不僅能改變牙周局部氧化應(yīng)激水平，也可影響全身氧化還原狀態(tài)。本研究根據(jù)肝組織病理學(xué)檢測結(jié)果以及肝功指標(biāo)水平變化發(fā)現(xiàn)牙周炎可誘導(dǎo)肝臟發(fā)生結(jié)構(gòu)改變和功能障礙，表明本研究成功構(gòu)建大鼠牙周炎相關(guān)肝損傷模型。在此模型基礎(chǔ)上，通過MitoSOX red染色和檢測肝組織中氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物水平進一步證實我們的猜想。結(jié)果顯示，牙周炎組肝組織中ROS 含量升高，且氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物SOD 和GSH 水平降低，MDA 水平升高，表明牙周炎可誘導(dǎo)肝組織中發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

An 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，ROS 大量積累可觸發(fā)JNK/NF-κB 信號分子的激活，進而引起一系列細胞反應(yīng)。前文所述，由于JNK/NF-κB 信號分子可參與多種信號的傳導(dǎo)，當(dāng)該通路被過度激活時可導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境紊亂。本研究結(jié)果顯示，牙周炎組肝組織中JNK 蛋白磷酸化水平和NF-κB 基因及蛋白表達水平明顯較對照組升高，表明JNK/NF-κB 信號分子在牙周炎誘導(dǎo)肝損傷過程中可能發(fā)揮重要作用。因此，根據(jù)以上研究結(jié)果初步認為牙周炎可能通過誘導(dǎo)肝臟中ROS 大量積累，導(dǎo)致肝組織內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而激活JNK/NF-κB 信號分子，最終造成肝損傷。

細胞凋亡是機體的一種生理機制，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。然而，當(dāng)機體受到氧化應(yīng)激等信號刺激導(dǎo)致凋亡水平上升時，巨噬細胞無法清除過多的凋亡細胞，未清除的凋亡細胞可加劇體內(nèi)炎癥反應(yīng)[7]。Zhou 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在NAFLD 進展中伴隨細胞凋亡水平增加。此外，Veskovic等[22]通過改善促凋亡和抗凋亡介質(zhì)平衡可有效緩解肝臟炎癥和損傷。由此可見NAFLD發(fā)病機制與細胞凋亡水平改變密切相關(guān)。本研究通過探討JNK/NF-κB 信號分子對細胞凋亡的調(diào)控作用，進一步揭示牙周炎誘導(dǎo)肝損傷的具體機制。目前研究[23]發(fā)現(xiàn)，JNK信號分子在細胞內(nèi)源性和外源性凋亡途徑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。激活后的JNK 通過磷酸化14-3-3α 或14-3-3ζ 蛋白（bax 的胞質(zhì)錨定蛋白）介導(dǎo)bax 活化并將其轉(zhuǎn)位到線粒體，進而誘導(dǎo)線粒體外膜滲透。線粒體外膜滲透可導(dǎo)致細胞色素C 和其他促凋亡蛋白從線粒體膜間空間釋放，觸發(fā)Caspase-9 級聯(lián)反應(yīng)[24]。同時，JNK也可通過磷酸化Bim 和Bmf 蛋白，從而抑制Bcl-2及其同系物的抗凋亡活性，最終誘導(dǎo)細胞凋亡[20]。此外，NF-κB 作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過傳導(dǎo)凋亡和炎癥信號參與細胞損傷過程[11]。本實驗結(jié)果顯示牙周炎組肝組織中凋亡細胞數(shù)量明顯增多，促凋亡介質(zhì)Bax 和Caspase-3 表達水平顯著升高，抗凋亡介質(zhì)Bcl-2 表達水平下降，且炎癥因子表達水平亦明顯上升。綜上，牙周炎可能通過誘導(dǎo)肝組織中發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活JNK/NF-κB 信號分子，導(dǎo)致肝組織中細胞凋亡水平上升，促進炎癥介質(zhì)大量釋放，最終引起肝損傷。

本研究存在一定的局限性，即未使用JNK/NFκB 信號分子的阻斷藥物觀察牙周炎誘導(dǎo)的肝損傷是否得到有效緩解。然而大量研究證實，通過抑制JNK/NF-κB 信號分子可有效減輕ROS 大量積累對組織和細胞造成的氧化損傷。Chen 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血-再灌注期間，ROS 大量積累造成心肌細胞受損和功能障礙，而Zhou 等[26]通過體內(nèi)應(yīng)用阻斷藥物抑制JNK/NF-κB 信號通路可以有效減輕心肌組織功能障礙和免疫紊亂。由于氧化應(yīng)激是缺血-再灌注損傷和牙周炎誘導(dǎo)的NAFLD 的共同致病因素之一，上述結(jié)果在為后續(xù)通過使用阻斷藥物抑制JNK/NF-κB 信號通路從而緩解牙周炎誘導(dǎo)的肝損傷的過程中提供強有力的理論支撐。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ROS/JNK/NF-κB 信號分子可能在牙周炎誘導(dǎo)肝損傷過程中發(fā)揮了重要作用，未來可通過應(yīng)用JNK 和NF-κB 的靶向藥物做進一步研究。期待以牙周炎為靶點為NAFLD 的防治提供新策略。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。