張景茜 任璐頔 錢秀清，2

0 引言

青光眼作為不可逆致盲眼病之一，現(xiàn)已影響全球超過7 000萬人，且患病人數(shù)逐年上升，有研究預(yù)計(jì)，到2040年全球患青光眼患者比例為3.54%，患病人數(shù)將上升至1.1億[1]。目前青光眼的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但研究發(fā)現(xiàn)病理性眼壓升高是青光眼發(fā)病的重要影響因素。建立慢性高眼壓動(dòng)物模型是研究青光眼發(fā)病機(jī)制的主要手段之一，常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括猴、兔、鼠等[2-3]，由于鼠與靈長類動(dòng)物角膜緣有相似的解剖結(jié)構(gòu)，且其眼壓升高后能產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性、視神經(jīng)纖維丟失等與人眼青光眼相似的病理變化[4]，除此外還有操作方便、成本較低等優(yōu)勢，因此應(yīng)用廣泛。

慢性高眼壓的作用會(huì)影響視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的光學(xué)功能[5-8]，視覺電生理技術(shù)可以檢測視網(wǎng)膜和視神經(jīng)功能學(xué)的改變。視神經(jīng)發(fā)源于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突延伸到視神經(jīng)乳頭處，穿出篩板從而形成有髓視神經(jīng)。視網(wǎng)膜在受到圖形或者光的刺激之后，光感受器細(xì)胞內(nèi)會(huì)引起光化學(xué)反應(yīng)和光電反應(yīng)，產(chǎn)生電位改變并形成神經(jīng)沖動(dòng)，視覺電生理技術(shù)可對這種電位變化進(jìn)行記錄與處理[9]，并無創(chuàng)、客觀地對視功能進(jìn)行檢測與評估。視覺電生理技術(shù)主要包括閃光視網(wǎng)膜電圖(flash electroretinogram，F(xiàn)-ERG)、閃光視覺誘發(fā)電位(flash visual evoked potential，F(xiàn)-VEP)等[10-11]。目前，有大量研究通過對慢性高眼壓模型進(jìn)行視覺電生理的測試，獲取慢性高眼壓作用下視網(wǎng)膜功能學(xué)的損傷規(guī)律。有研究發(fā)現(xiàn)在慢性高眼壓模型建立3周后，F(xiàn)-ERG的a波振幅顯著下降，而b波與振蕩電位(oscillatory potential，OP)波的振幅較為敏感，于建模后1周就出現(xiàn)下降情況。此外，VEP的潛伏期在建模2周后顯著延長，同時(shí)其振幅顯著下降[5-7]。慢性高眼壓作用下視網(wǎng)膜功能學(xué)的損傷可能發(fā)生在造模后1～3周之間，且損傷隨著高眼壓作用時(shí)間的延長而呈現(xiàn)進(jìn)行性趨勢。

視網(wǎng)膜功能學(xué)的改變可能與視神經(jīng)穿過篩板時(shí)受到的擠壓作用有關(guān)。視神經(jīng)軸突通過篩孔穿出眼球，研究發(fā)現(xiàn)眼壓升高會(huì)導(dǎo)致篩板變形，從而擠壓視神經(jīng)，影響視神經(jīng)中的軸漿運(yùn)輸和視神經(jīng)功能學(xué)的改變[12-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，眼壓升高會(huì)導(dǎo)致篩板微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如部分篩孔形狀從圓形變?yōu)闄E圓形[15-16]。篩板微結(jié)構(gòu)的變化可能導(dǎo)致視神經(jīng)軸突的損傷，有研究在誘導(dǎo)高眼壓模型后，在電鏡下觀察到視神經(jīng)軸突嚴(yán)重?fù)p傷且軸突密度顯著下降[3]。因此，研究高眼壓作用下篩板微結(jié)構(gòu)的改變對青光眼致病機(jī)制的研究有重要意義。

本研究通過烙閉鞏膜上靜脈結(jié)合球結(jié)膜下注射氟尿嘧啶以獲得慢性高眼壓大鼠模型，對其進(jìn)行眼壓監(jiān)測，綜合考慮慢性高眼壓作用下視覺電生理與形態(tài)學(xué)的改變，選擇慢性高眼壓造模后2周和4周作為時(shí)間觀察點(diǎn)；對大鼠進(jìn)行視覺電生理測量，通過激光共聚焦顯微鏡觀察篩板組織圖像，并計(jì)算篩板組織孔隙率。最終得到鼠眼的視網(wǎng)膜功能和篩板形態(tài)隨著高眼壓持續(xù)作用的變化規(guī)律，為青光眼致病機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康、雄性成年SD大鼠，體重介于300～450 g，雙眼角膜狀況良好、眼底正常、屈光間質(zhì)清，且無其他全身疾病。本實(shí)驗(yàn)采取自身對照方案，左眼作為對照組，右眼為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供，在溫度和濕度適宜的環(huán)境中飼養(yǎng)，保證晝夜12 h交替，并提供標(biāo)準(zhǔn)的水和食物。實(shí)驗(yàn)遵循中國科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并嚴(yán)格按照國際眼科和視覺科學(xué)研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的 ARVO 聲明進(jìn)行處理。

1.2 眼壓測量

分別對處在清醒狀態(tài)下的正常大鼠和造模前、造模后2 d以及造模后每周的慢性高眼壓模型大鼠進(jìn)行眼壓測量，保證在每日同一時(shí)段內(nèi)(15∶00-16∶30)由專人使用TonoLab眼壓筆(iCare，芬蘭)進(jìn)行測量工作。眼壓筆在測量時(shí)應(yīng)保證筆頭垂直且輕觸在鼠眼角膜中央處，勿過度用力，選取3次有效測量值的平均值作為該眼的最終眼壓值。

1.3 慢性高眼壓模型建立

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行全身麻醉后，烙閉鞏膜上靜脈，然后在球結(jié)膜下注射氟尿嘧啶(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。左眼作為對照眼，不作處理。之前的研究已經(jīng)證明造模使用的藥物氟尿嘧啶對眼壓沒有影響[17]，因此本次實(shí)驗(yàn)沒有建立藥物對照組。

1.4 閃光視網(wǎng)膜電圖測量

分別對正常大鼠和造模后2周、4周大鼠各6只用Espion E3視覺電生理儀(Diagnosys，美國)進(jìn)行閃光視網(wǎng)膜電圖的測量。

實(shí)驗(yàn)前對大鼠進(jìn)行完全暗適應(yīng)(時(shí)間定為2 h)，腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行全身麻醉，右眼滴入散瞳滴眼液(日本參天制藥有限公司)并散瞳20 min。記錄電極為環(huán)狀電極，分別置于雙眼眼角鞏膜緣；參考電極為針狀電極，置于大鼠鼻內(nèi)；接地電極平行于身體置于尾部。實(shí)驗(yàn)使用全視野刺激器，按照國際臨床視覺電生理學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)化方案順序記錄視桿反應(yīng)、最大混合反應(yīng)、振蕩電位，明適應(yīng)10 min后記錄視錐反應(yīng)及閃爍光反應(yīng)(30 Hz)。

閃光視網(wǎng)膜電圖的典型波形如圖1所示，a波是一個(gè)負(fù)相波，起源于感光細(xì)胞的內(nèi)段，其振幅的變化主要反映視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層功能變化；b波是ERG中的正相成分，它起源于視網(wǎng)膜的內(nèi)核層，其振幅的變化可反映視網(wǎng)膜第二級神經(jīng)元和放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能變化；OP由一組小波組成，它們重疊出現(xiàn)在 b波的上升支上，反映內(nèi)核層至內(nèi)叢狀層功能。由于OP2子波受a波幅值影響較小，幅值較高，波形穩(wěn)定，故以O(shè)P2作為OP 參數(shù)中的重要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)主要觀察指標(biāo)包括：Rod-ERG的b波潛時(shí)、幅值；Max-ERG的a、b波潛時(shí)、幅值；OP的平均幅值與OP2子波的潛時(shí)、幅值；Cone-ERG的a、b波潛時(shí)、幅值；Flick-ERG的峰值幅值。

圖1 F-ERG典型波形

1.5 閃光視覺誘發(fā)電位測量

分別對正常眼壓和造模后2周、4周各6只大鼠用RETI-port/scan 21羅蘭視覺電生理儀(Roland Consult，德國)進(jìn)行閃光視覺誘發(fā)電位的測量。

實(shí)驗(yàn)前打開實(shí)驗(yàn)臺(tái)的水浴加熱裝置，在實(shí)驗(yàn)過程中保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)溫?zé)?。?shí)驗(yàn)時(shí)，腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行全身麻醉，雙眼滴入散瞳液并進(jìn)行20 min的散瞳，兩耳連線中點(diǎn)處備皮，放置電極。記錄電極置于兩耳連線中點(diǎn)皮下，平行于身體長軸；參考電極插于耳郭，接地電極置于尾部。開始測試前應(yīng)保證各電極阻抗小于5 kΩ。將大鼠置于刺激器內(nèi)，測量眼向內(nèi)，非測量眼用自制不透光眼罩蓋住。測量順序?yàn)橄葴y量實(shí)驗(yàn)眼，再測量對照眼。在測量過程中保證周圍環(huán)境其余電源全部關(guān)閉，避免產(chǎn)生干擾。

根據(jù)國際臨床視覺電生理學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)化方案對大鼠進(jìn)行F-VEP測試。采用全視野刺激器，參數(shù)設(shè)置為：閃光顏色白色；刺激頻率1.6 Hz；疊加次數(shù)100次。每只眼連續(xù)測試3次，取其平均值作為最終結(jié)果記錄。閃光視覺誘發(fā)電位的典型波形如圖2所示，負(fù)相波用N表示，正相波用P表示，相鄰兩波間的幅值差大小反應(yīng)視神經(jīng)軸索功能狀態(tài)，波形出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)為潛時(shí)，其反應(yīng)視神經(jīng)髓鞘功能狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)主要觀察指標(biāo)包括N1、P1、N2、P2潛時(shí)，N1-P1、N2-P2幅值。

圖2 F-VEP典型波形

1.6 孔隙率計(jì)算

選取正常和造模后2周、4周各6只大鼠進(jìn)行篩板形態(tài)學(xué)的觀察。以10 μm厚度對篩板組織進(jìn)行連續(xù)冷凍切片，一個(gè)樣本約保留160 μm，即16張切片，然后通過膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)對組成其主要結(jié)構(gòu)的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。通過LeicaTCS SP8正置激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)的油鏡(物鏡放大倍數(shù)為60倍)對篩板部位組織切片進(jìn)行圖像采集，將得到的圖像導(dǎo)入ImageJ(NIH，美國)進(jìn)行篩孔面積和篩板面積的獲取，并計(jì)算孔隙率：孔隙率=孔隙面積/總面積。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 眼壓測量結(jié)果

通過對18只正常大鼠清醒狀態(tài)下的眼壓測量(15∶00-16∶30)，得到大鼠正常眼壓左眼為(12.58±1.47)mmHg，右眼為(13.17±2.21)mmHg。

開展教研活動(dòng)的主要目的是提高教師的專業(yè)素質(zhì)、教學(xué)能力以及課程實(shí)踐能力。而若想有效開展好教研活動(dòng)，以真正發(fā)揮出其作用、實(shí)現(xiàn)其目的，首先必須要確保教研活動(dòng)的科學(xué)規(guī)劃，即明確教研主題，找準(zhǔn)問題所在，將教研活動(dòng)當(dāng)作一項(xiàng)科研活動(dòng)來開展，并保證其有序進(jìn)展。

隨機(jī)抽取12只大鼠，對這12只大鼠行烙閉鞏膜上靜脈結(jié)合氟尿嘧啶球結(jié)膜下注射方法，以獲得慢性高眼壓模型，分別于烙閉前及烙閉后2 d、1周及每周進(jìn)行眼壓測量。烙閉前，實(shí)驗(yàn)眼、對照眼眼壓分別為(14.25±2.09)mmHg、(12.70±1.89)mmHg。術(shù)后2 d，實(shí)驗(yàn)眼眼壓顯著上升(P<0.01)，烙閉后1～ 4周，實(shí)驗(yàn)眼眼壓維持較高狀態(tài)(P<0.01)。大鼠雙眼眼壓變化如圖3所示。

圖3 大鼠雙眼眼壓

2.2 閃光視網(wǎng)膜電圖測量結(jié)果

由Diagnosis Espion E3測量得到正常、造模后2周、4周大鼠雙眼的F-ERG各參數(shù)值，每個(gè)時(shí)間段各6只，所有被測大鼠均能得到典型的ERG波形，記錄的各反應(yīng)參數(shù)值如表1所示。

表1 F-ERG結(jié)果(n=6)

F-ERG各波形參數(shù)分析如下：

(1) 暗適應(yīng)視桿反應(yīng)Rod-ERG：造模后2周、4周大鼠與正常大鼠相比，b波潛時(shí)無顯著變化(P>0.05)。高眼壓作用2周后大鼠的b波幅值與正常大鼠、高眼壓作用4周相比均無顯著變化，高眼壓作用4周時(shí)b波幅值與正常大鼠相比顯著下降(P<0.01)，說明視桿細(xì)胞功能下降。

(2) 暗適應(yīng)最大混合反應(yīng)Max-ERG：高眼壓作用前后a、b波潛時(shí)均無明顯改變。高眼壓作用4周時(shí)，與正常大鼠相比，a、b波幅值均顯著下降(P<0.01)，但與高眼壓作用2周相比無明顯差別。反映了在慢性高眼壓的作用下，視網(wǎng)膜光感受器層功能受損。

(3) 振蕩電位OP：高眼壓作用前后OP平均幅值與OP2潛時(shí)均無顯著變化。高眼壓作用4周時(shí)，OP2幅值與高眼壓作用2周時(shí)對比，顯著下降(P<0.05)，但與正常組相比無明顯變化(P>0.05)。

(4) 明適應(yīng)視錐反應(yīng)Cone-ERG：高眼壓作用前后a、b波潛時(shí)和a波幅值無明顯變化。高眼壓作用4周后，b波幅值與正常大鼠相比顯著下降(P<0.05)，這表明視錐細(xì)胞功能在慢性高眼壓作用下降低。

2.3 閃光視覺誘發(fā)電位測量結(jié)果

由羅蘭視覺電生理儀測量得到F-VEP各參數(shù)值，白光刺激頻率為1.6 Hz。每只眼測量3次，取其平均值作為最終結(jié)果。記錄的各參數(shù)值如表2所示。

表2 F-VEP結(jié)果(n=6)

造模2周時(shí)，P1潛時(shí)與正常大鼠相比顯著降低(P<0.01)，N2潛時(shí)顯著升高(P<0.01)，且顯著差異持續(xù)到建模后4周，但高眼壓作用2周、4周間P1潛時(shí)與N2潛時(shí)無顯著差別；高眼壓作用4周時(shí)，N1-P1幅值與造模后2周相比顯著性降低(P<0.01)，但與正常大鼠相比無顯著差異；造模前后P2潛時(shí)、N2-P2幅值無顯著變化。

2.4 孔隙率結(jié)果

經(jīng)過GFAP熒光染色后的篩板部位組織切片圖像如圖4所示，綠色熒光處為篩板組織，其中孔隙處為視神經(jīng)軸突穿過區(qū)域；局部放大圖像如圖5所示，可以看到在持續(xù)高眼壓作用下，篩板膠原組織的放射狀形態(tài)被破壞，出現(xiàn)雜亂的膠原纖維和異常的組織間隙。

圖4 GFAP染色后篩板組織圖像

圖5 GFAP染色后篩板組織局部圖像

將圖像導(dǎo)入ImageJ后，將其改為灰度圖像，選取篩板組織邊緣(圖6A)，獲取整體篩板組織面積；分割出篩板從而計(jì)算篩孔面積(圖6B)，由孔隙率公式計(jì)算獲得篩板孔隙率。

圖6 篩板組織圖像分割

造模前后篩板組織部位孔隙率情況如圖7所示，高眼壓作用2周，篩板組織的孔隙率顯著下降(P<0.01)。高眼壓持續(xù)作用4周后，鼠眼篩板孔隙率較正常大鼠相比無顯著性差異。

圖7 篩板孔隙率變化情況(n=6)

3 討論與結(jié)論

本研究中通過建立動(dòng)物模型研究慢性高眼壓作用下鼠眼篩板部位的損傷情況，造模方法采取課題組中已成熟使用的烙閉上鞏膜靜脈結(jié)合球結(jié)膜下注射氟尿嘧啶法[17]，為維持實(shí)驗(yàn)大鼠高眼壓狀態(tài)，定期對其進(jìn)行眼壓測量，并對眼壓低于25 mmHg的大鼠再次烙閉，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠實(shí)驗(yàn)眼眼壓在烙閉后2 d顯著上升且能維持高眼壓狀態(tài)到4周。

通過F-ERG和F-VEP的測量，本研究得到慢性高眼壓作用下視網(wǎng)膜功能的損傷情況。結(jié)果顯示，在慢性高眼壓作用2周后，F(xiàn)-VEP的潛時(shí)顯著增長，這與ElGohary等[7]觀察到的F-VEP變化結(jié)果一致。Yu等[18]、Chen等[19]同樣發(fā)現(xiàn)慢性高眼壓2周后，VEP的N1、P1潛時(shí)增長，平均幅值下降。慢性高眼壓作用4周后，F(xiàn)-ERG的各反應(yīng)幅值顯著下降，這與同一課題組的郭學(xué)謙等[20]所得到的幅值下降結(jié)果相似，且與Wu等[6]、Hannon等[21]得到的慢性高眼壓作用下視網(wǎng)膜損傷結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)中僅通過測量F-ERG和F-VEP來評估視網(wǎng)膜的功能性改變情況，目前有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-ERG的b波后會(huì)產(chǎn)生一負(fù)相波，即明視負(fù)波反應(yīng)(photopic negative response，PhNR)，反映外層視網(wǎng)膜功能，該指標(biāo)在早期青光眼患者中就可發(fā)生顯著變化，對于早期青光眼的發(fā)現(xiàn)有重要意義[22]。在下一步工作中，可以增設(shè)對PhNR指標(biāo)參數(shù)的觀察，獲得其在慢性高眼壓作用下的變化規(guī)律。

研究結(jié)果顯示，造模2周后，篩板組織孔隙率顯著降低；造模4周后，篩板組織孔隙率與對照組相比無明顯變化。視覺電生理結(jié)果顯示,在造模2周后，視網(wǎng)膜功能已產(chǎn)生改變。此前其他研究者[23-24]發(fā)現(xiàn)在慢性高眼壓模型的視覺功能學(xué)結(jié)果發(fā)生改變時(shí)，并未觀察到明顯的視網(wǎng)膜形態(tài)的變化，這可能是形態(tài)學(xué)測量的精度不夠所導(dǎo)致的。此外，Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，眼壓升高2周后，ERG的a、b波幅值下降，而視網(wǎng)膜形態(tài)在高眼壓作用4周后才出現(xiàn)顯著變化。但Eastlake等[3]通過ERG測試與掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在高眼壓作用2周后視網(wǎng)膜功能受損，同時(shí)觀察到視神經(jīng)的形態(tài)發(fā)生改變，與本文所觀察到的結(jié)果相似。同樣，Tan 等[26-27]通過ERG結(jié)合光學(xué)相干斷層掃描的在體實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)，大鼠眼壓升高后ERG的a、b波幅值顯著下降，同時(shí)視神經(jīng)乳頭的形態(tài)發(fā)生變化，但由于目前在體測試的圖像精度較低，難以獲得篩板微觀結(jié)構(gòu)的變化情況。

本文研究存在一定的局限性。由于本實(shí)驗(yàn)中慢性高眼壓最長僅維持到4周，并未觀察到完整的視網(wǎng)膜功能損傷、恢復(fù)情況。且在視覺電生理得到的結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)眼與對照眼無法體現(xiàn)出顯著性差異，這可能與視覺誘發(fā)電位幅度較低、極易受腦電波干擾等原因有關(guān)，在測量F-VEP的過程中，僅通過遮蓋非測量眼來排除對側(cè)眼的干擾，可能會(huì)由于大鼠的麻醉深度淺或自身呼吸起伏而在測量過程中發(fā)生活動(dòng)，導(dǎo)致遮蓋效果下降。另外，本研究所使用的顯微鏡精度較低，并且圖像處理分割方法較為粗糙，得到的形態(tài)學(xué)參數(shù)較少，難以得到準(zhǔn)確的早期篩板微結(jié)構(gòu)改變情況。在下一步工作中，擬采用分辨率更高的圖像采集設(shè)備，如電鏡或具有高分辨率模塊的激光共聚焦顯微鏡，優(yōu)化圖像處理方法，增加慢性高眼壓觀察的時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)一步研究慢性高眼壓作用下，視網(wǎng)膜功能學(xué)的改變與篩板微觀結(jié)構(gòu)改變之間的關(guān)系，為青光眼致病機(jī)制的研究及早期診斷提供依據(jù)。