李英，王興，李永寧，劉鵬，劉松柏，潘耀振

(貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院 外科學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

如何有效防治肝癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是改善肝癌患者預(yù)后、提高生存率的關(guān)鍵[1]。缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、放化療耐藥中發(fā)揮重要作用[2-5]。缺氧標(biāo)志物在肝癌中可作為獨(dú)立預(yù)后因素，其表達(dá)預(yù)示著肝癌患者的不良預(yù)后[6]。缺氧參與惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的一個重要機(jī)制就是對腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的調(diào)節(jié)作用[7-8]。EMT是由調(diào)節(jié)因子經(jīng)過各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致上皮細(xì)胞特性消失，而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞特性的細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程。研究證實(shí)，EMT的發(fā)生可促進(jìn)肝癌的侵襲及轉(zhuǎn)移[9-10]。小窩蛋白-1(caveolin-1, CAV1)是細(xì)胞膜小窩(caveolae)的主要支架蛋白，參與了細(xì)胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[11-12]，其異常表達(dá)在多種類型的腫瘤中被研究報道，特別是在晚期癌癥轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)明顯上調(diào)[13]。CAV1的過度表達(dá)與腫瘤侵襲性臨床行為和不良預(yù)后密切相關(guān)，在肝癌中已有少數(shù)研究報道[14-15]。然而，CAV1在缺氧條件下的作用機(jī)制尚不清楚，本研究旨在分析CAV1表達(dá)與缺氧微環(huán)境的關(guān)系，探討其對肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

正常肝細(xì)胞系LO2及肝癌細(xì)胞系HepG2、HCC-9810、MHCC-97H和Hep3B購自上海生科院細(xì)胞資源中心，DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清購自Gibco公司，青霉素-鏈霉素雙抗購自Hyclone公司，CAV1、Vimentin、E-cadherin及N-cadherin抗體購自武漢三鷹公司，β-actin抗體購自CST公司，羊抗鼠及羊抗兔二抗購自博士德生物公司，siRNA及轉(zhuǎn)染試劑盒購自銳博生物科技公司，Protein A+G Agarose beads購自碧云天公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧模型構(gòu)建 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的MHCC-97H與Hep3B細(xì)胞接種于96孔板中(4 000個/孔)，待細(xì)胞貼壁后，更換為含50、100、150、200、250 μmol/L氯化鈷(CoCl2)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對照組不予CoCl2干預(yù)，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力。選取100 μmol/L CoCl2分別處理細(xì)胞0、12、24、48、72 h后, CCK-8法檢測不同時間下細(xì)胞活力。酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm，細(xì)胞活力(%)=(處理組OD450值/對照組OD450值)×100%。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染 siRNA由銳博生物公司(廣州、中國)構(gòu)建合成。取生長狀態(tài)良好的MHCC-97H和Hep3B細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)70%時，按照說明書采用轉(zhuǎn)染試劑盒將干擾序列(si-CAV1)及干擾對照序列(si-NC)轉(zhuǎn)染MHCC-97H和Hep3B細(xì)胞，12 h后更換培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qPCR 采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，以cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以 SYBR?Premix Ex TaqTM進(jìn)行熒光定量PCR分析。每組設(shè)置5個復(fù)孔，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用Bio-Rad CFX Manager 軟件進(jìn)行處理。結(jié)果取平均值進(jìn)行計算，管家基因GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。引物序列：CAV1 正向引物為5′-GCGACCCTAAACACCTCAAC-3′，反向引物為5′-ATGCCGTCAAAACTGTGTGTC-3′。

1.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡 采用RIPA裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，行10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，300 mA濕轉(zhuǎn)120 min將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液室溫封閉2 h后分別將目的條帶放入對應(yīng)的一抗溶液中4 ℃孵育過夜；次日洗滌條帶后放入羊抗鼠(1∶2 000)或羊抗兔(1∶2 000)二抗中，室溫孵育1 h。采用ECL法對條帶進(jìn)行顯影，以β-actin作為內(nèi)參比較目的蛋白CAV1表達(dá)。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞計數(shù)按5×105(個/孔)均勻的接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞融合度達(dá)到90 %時，用已消毒的直尺置于孔徑上，固定直尺兩端勿挪動，用200 μL槍頭沿著直尺劃垂直線，用PBS清洗2遍后加入2 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，立即于倒置顯微鏡下觀察并拍照，待培養(yǎng)48 h后再觀察拍照。

1.2.6Transwell細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞消化、無血清培養(yǎng)基重懸計數(shù)，按2×104(個/孔)接種于未包被或基質(zhì)膠包被的Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室內(nèi)，補(bǔ)充無血清培養(yǎng)基至總體積200 μL。下室加入700 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽去除濾膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定30 min，1%結(jié)晶紫染色30 min，清洗掉多余的結(jié)晶紫染料后烘干，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7免疫共沉淀 細(xì)胞中加入500 μL NP40裂解液(蛋白酶抑制劑10 μL、磷酸酶抑制劑10 μL及PMSF 5 μL)提取總蛋白，加入20 μL Protein A+G Agarose beads于4 ℃搖床孵育2 h，對蛋白提取物進(jìn)行預(yù)純化。將純化后的提取物分為3份，分別加入純化IgG(IgG組)、CAV1抗體(IP組)、留50 μL不加任何抗體作為對照組(Input組)，于4 ℃搖床孵育過夜。IgG組及CAV1組孵育后的提取物中各加入40 μL Protein A+G Agarose beads，收集沉淀加入蛋白上樣緩沖液100 ℃變性5 min，采用SDS-PAGE蛋白凝膠電泳進(jìn)行檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞系中CAV1的表達(dá)

CAV1 mRNA及蛋白的表達(dá)在HepG2、HCC-9810、MHCC-97H、Hep3B等肝癌細(xì)胞系中較人正常肝細(xì)胞LO2中的表達(dá)量高(P<0.05)，并且在MHCC-97H和Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)最明顯。見圖1。故選取MHCC-97H及Hep3B細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)缺氧模型的構(gòu)建。

注：與LO2比較，(1)P<0.01，(2)P<0.001。

2.2 缺氧對肝癌細(xì)胞中CAV1表達(dá)的影響

以0、50、100、150、200、250 μmol/L CoCl2誘導(dǎo)MHCC-97H及Hep3B細(xì)胞缺氧24 h，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0～100 μmol/L CoCl2時，肝癌細(xì)胞的生長無明顯影響；當(dāng)濃度高于150 μmol/L后，MHCC-97H及Hep3B 細(xì)胞的存活率均有不同程度的下降。選取100 μmol/L CoCl2分別處理細(xì)胞0、12、24、48、72 h，結(jié)果顯示，24 h時，細(xì)胞的增殖活性最大(P<0.05，見圖2)，故以100 μmol/L CoCl2作用24 h作為細(xì)胞缺氧模型的最佳濃度和時間，與對照組相比(0 h)，缺氧環(huán)境明顯促進(jìn)了CAV1蛋白表達(dá)。見圖3。

注：與0 μmol/L或0 h比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖3 缺氧對肝癌細(xì)胞中CAV1表達(dá)的影響

2.3 缺氧對肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，與對照組比較(0 h)，MHCC-97H及Hep3B細(xì)胞在缺氧環(huán)境下細(xì)胞的相對遷移率明顯增加(P<0.05)。見圖4。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，與對照組相比(0 h)，缺氧明顯促進(jìn)了細(xì)胞遷移和侵襲(P<0.05)。見圖5。

注：與0 h比較，(1)P<0.01。

注：與0 h比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01。

2.4 缺氧對肝癌細(xì)胞中EMT相關(guān)指標(biāo)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比(0 h)，缺氧環(huán)境下EMT相關(guān)指標(biāo)Vimentin、N-cadherin蛋白明顯增加，E-cadherin的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖6。

圖6 缺氧對MHCC-97H及Hep3B細(xì)胞中EMT相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響

2.5 CAV1對肝癌MHCC-97H及Hep3B細(xì)胞遷移、侵襲的調(diào)控作用

采用siRNA干擾CAV1的表達(dá)后，進(jìn)一步驗(yàn)證在缺氧環(huán)境中CAV1對肝癌細(xì)胞株MHCC-97H及Hep3B轉(zhuǎn)移能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，與對照組相比(si-NC)，干擾CAV1的表達(dá)后細(xì)胞的相對遷移率明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。Transwell細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，與對照組相比(si-NC)，si-CAV1組細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖8。

注：與si-NC相比，(1)P<0.001,(2)P<0.01。

注：與si-NC比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01。

2.6 CAV1對肝癌細(xì)胞中EMT相關(guān)指標(biāo)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，缺氧環(huán)境下與si-NC組比較，下調(diào)CAV1表達(dá)后MHCC-97H及Hep3B細(xì)胞中Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低，E-cadherin表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見圖9。

圖9 下調(diào)CAV1對肝癌細(xì)胞株MHCC-97H及Hep3B中EMT相關(guān)指標(biāo)的影響

2.7 CAV1可通過招募Vimentin促進(jìn)肝癌的進(jìn)展

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示(圖10)，在MHCC-97H及Hep3B細(xì)胞中，CAV1能與Vimentin在蛋白水平存在直接或間接結(jié)合的可能性。

圖10 CAV1與EMT互作關(guān)系的驗(yàn)證

3 討論

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移作為肝癌惡性表型的特征之一，提示了肝癌患者的不良預(yù)后。腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境的相互作用與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。實(shí)體腫瘤由于生長過程中腫瘤細(xì)胞的快速增殖、局部微血管形成相對滯后，使局部腫瘤組織的血供不足導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞處于相對缺血缺氧的環(huán)境[17]。研究表明，在缺氧微環(huán)境的作用下，腫瘤細(xì)胞的粘附能力降低，可主動從原發(fā)灶脫離侵入間質(zhì)、血管或淋巴系統(tǒng)，然后定植在遠(yuǎn)處組織中形成轉(zhuǎn)移灶[18]。而該過程受多種調(diào)控因子、基因和信號通路的調(diào)控，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。在肺癌、結(jié)直腸癌及胃癌等多種實(shí)體瘤中，研究發(fā)現(xiàn)CAV1能促進(jìn)腫瘤侵襲性、藥物耐受性、抗凋亡等特性[19]。本研究結(jié)果提示CAV1在肝癌中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲的作用。首先，qPCR及Western blot結(jié)果顯示CAV1在多株人肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)，提示其一定程度上發(fā)揮著促癌作用。缺氧微環(huán)境已被證明可以選擇侵襲性較強(qiáng)的癌細(xì)胞在缺氧條件下適應(yīng)和生存。因此，了解與肝癌細(xì)胞侵襲性相關(guān)的缺氧基因是非常重要的。通過構(gòu)建細(xì)胞缺氧模型發(fā)現(xiàn)，在缺氧應(yīng)激條件下CAV1表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，功能上表現(xiàn)為促進(jìn)MHCC-97H及Hep3B細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。通過小干擾RNA技術(shù)下調(diào)CAV1的表達(dá)后，明顯抑制了缺氧環(huán)境下細(xì)胞的遷移及侵襲。上述結(jié)果表明缺氧微環(huán)境中CAV1對肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力具有重要的調(diào)控作用。

近年來EMT被認(rèn)為是實(shí)體腫瘤轉(zhuǎn)移的初始環(huán)節(jié)，被廣泛關(guān)注和研究[20]。EMT的典型特征是上皮細(xì)胞標(biāo)志物下調(diào)，如E-cadherin、緊密連接蛋白-1(ZO-1)，同時伴隨間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)的升高，如Vimentin、N-cadherin；且有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的缺氧微環(huán)境可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，通過改變能量代謝途徑、促進(jìn)血管形成、改變基因表型等方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。本研究首先觀察到缺氧條件下肝癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)減少，Vimentin和N-cadherin表達(dá)增加。進(jìn)一步分析CAV1促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲的分子機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)干擾CAV1表達(dá)后明顯抑制了Vimentin、N-cadherin的表達(dá)，而促進(jìn)了E-cadherin的表達(dá)。上述結(jié)果表明，CAV1在缺氧微環(huán)境中能調(diào)控肝癌細(xì)胞的EMT過程。最重要的是，本研究通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CAV1與Vimentin在蛋白水平存在直接或間接結(jié)合的可能。

綜上所述，一定程度的缺氧能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力，其機(jī)制可能與CAV1的表達(dá)水平增加、激活EMT途徑促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的侵襲性有關(guān)。因此，CAV1可能作為分子靶點(diǎn)之一在肝癌缺氧微環(huán)境調(diào)控中發(fā)揮重要作用，并為下一步探索CAV1是否可作為預(yù)后標(biāo)志物在臨床腫瘤診斷和治療中發(fā)揮價值提供理論基礎(chǔ)。