李曉敏，唐毓婧，賈軼靜，李長金，李 杰，郭子芳

（中國石化 北京化工研究院，北京 100013）

一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)是生物制藥領(lǐng)域生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體、重組藥物蛋白等生物產(chǎn)品的重要設(shè)備，主要是由美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的塑料材料（聚乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、乙烯乙烯醇等）制成的一種即裝即用、不可重復(fù)利用的培養(yǎng)器［1］。20 世紀(jì)開始應(yīng)用［2-3］。1963 年，一種由聚丙烯和聚四氟乙烯制成的一次性搖晃四面體袋成功應(yīng)用在枯草芽孢桿菌等細(xì)胞的培養(yǎng)上［4］。隨后一次性中空纖維膜生物反應(yīng)器［5-7］、細(xì)胞工廠［8-10］及兩室透析膜生物反應(yīng)器［11-12］在動物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域占據(jù)了主要地位。在此階段，也有少量研究描述了波浪混合對微生物和細(xì)胞在袋體中培養(yǎng)的適用性［13-14］。20 世紀(jì)末，Wave Biotech 公司成功開發(fā)出波浪混合式一次性生物反應(yīng)器，并推出了第一臺用于商業(yè)化生產(chǎn)的WAVE Bioreactor 20 反應(yīng)器，標(biāo)志著一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)的大規(guī)模應(yīng)用［15-16］。該系統(tǒng)應(yīng)用廣泛，市場前景良好。

一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)專用膜是一次性生物反應(yīng)器的主要部分，專用膜是一種聚合物單層或多層薄膜，在使用過程中通常一面直接與培養(yǎng)液體接觸，另一面與外界接觸，具有良好的氣體阻隔功能，可為細(xì)胞生長提供環(huán)境保障［2］。以目前應(yīng)用較多、典型的5 層結(jié)構(gòu)為例，專有膜主要分為外層、內(nèi)層、中間阻隔層及兩層中間黏結(jié)層。外層通常由強(qiáng)度高、韌性好、耐穿刺、耐折疊的材料制成，保障內(nèi)部細(xì)胞或微生物的培養(yǎng)。內(nèi)層為液體接觸層，直接和細(xì)胞、微生物、培養(yǎng)基等物料接觸，需要具備較低的可提取物或浸出物，滿足細(xì)胞的正常生長和代謝，為細(xì)胞培養(yǎng)營造適宜的環(huán)境。阻隔層在中間，提供氣體阻隔性能，為細(xì)胞生長提供環(huán)境保障。黏結(jié)層的作用是將上述三層結(jié)構(gòu)黏結(jié)在一起，保障膜體結(jié)構(gòu)完整且反應(yīng)液體不泄露。

本文對一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)專用復(fù)合膜的發(fā)展歷程、組成結(jié)構(gòu)、使用原料及制造工藝進(jìn)行介紹，綜述了目前主要專用膜產(chǎn)品及相關(guān)評價指標(biāo)，并對一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)專用復(fù)合膜的未來發(fā)展進(jìn)行了展望。

1 專用膜原料

一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)專用膜所用原料均為熱塑性聚合物材料，具有共同的性質(zhì)，可通過加熱使其變?yōu)轲こ硪后w，便于后期加工成膜。單層專用膜的主聚合物通常只有一種，并輔以相應(yīng)的添加劑，多層專用膜各層功能不同，對聚合物的要求也不同，因此需根據(jù)不同層的性能需求選擇合適的聚合物。聚合物的性質(zhì)主要和分子量及其分布、共聚單體種類和含量有關(guān)，并決定著聚合物最終的行為方式。

1.1 內(nèi)層

專用膜內(nèi)層為液體接觸層，與培養(yǎng)液體直接接觸，材料主要具備以下功能：1）較好的柔韌性、抗撕裂性、耐穿刺性，保證在使用過程中的可靠性。2）低可提取物/浸出物，能滿足細(xì)胞的正常生長和代謝，為細(xì)胞生長營造適宜的環(huán)境，有較好的生物相容性，適于細(xì)胞培養(yǎng)。3）熱封性：液體接觸層需具備足夠的熱封強(qiáng)度，能為生物反應(yīng)器袋體加工提供熱合焊接功能，避免在使用時出現(xiàn)液體滲漏［2］。可用作接觸層的材料類型有線型低密度聚乙烯（LLDPE）、超低密度聚乙烯（ULDPE）、低密度聚乙烯（LDPE）共聚物或混合物、乙烯-醋酸乙烯共聚物（EVA）等。LLDPE 以良好的機(jī)械性能聞名，如撕裂強(qiáng)度、抗穿刺性、拉伸性、強(qiáng)度和韌性等，且在柔韌性、密封能力和韌性之間提供了非常好的平衡，這些特性使它成為膜內(nèi)層材料的良好候選材料之一。ULDPE 既具有 LLDPE 的高強(qiáng)度，又具有較高的熱封強(qiáng)度。EVA（醋酸乙烯酯含量為4%～18%（w））與 LDPE 非常相似，具有高支化度，可形成硬度低、韌性高、熔體溫度低、柔韌性高和透明度高的低結(jié)晶材料，可作為內(nèi)層接觸材料使用。

1.2 阻隔層

阻隔層用原料通常為乙烯乙烯醇共聚物（EVOH）。使用EVOH 的主要原因是EVOH 可以提供氣體阻隔性［17］。EVOH 材料中乙烯的含量（24%～48%（x））越低，阻隔性能越高。且EVOH 對濕度敏感，吸收水分會降低阻隔性能，因此EVOH 應(yīng)作為中間層嵌入提供防潮功能的兩層中。另外，聚酰胺（PA）也稱尼龍，具有較高的柔韌性和略遜于EVOH 的氣體阻隔性能，由于EVOH 耐水性和耐彎折性較差，因此國內(nèi)也有一些研究者提出EVOH 和尼龍的兩層或三層復(fù)合結(jié)構(gòu)作為阻隔層使用［18-19］。聚偏二氯乙烯具有非常好的水蒸氣阻隔性能，也有望替代 EVOH用作阻隔層。

1.3 外層

專用膜外層用原料通常為聚乙烯系列、EVA、PA、聚酯等聚合物材料，與內(nèi)層較為相似。外層材料具有的主要性能是焊接操作的熱穩(wěn)定性和良好的機(jī)械性能（高強(qiáng)度、柔韌性、抗穿刺等）。因為一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)的容積決定了生產(chǎn)效率，大型反應(yīng)器需要配備大容積工藝袋，專用膜材料需要具備足夠的強(qiáng)度，焊接結(jié)構(gòu)需要足夠的可靠性，需要經(jīng)受較大的使用壓力及工藝袋在制作、折疊包裝、運輸、展開安裝和正常使用過程中可能產(chǎn)生的各種彎折和可能的損傷。聚乙烯系列和EVA 的性質(zhì)能夠符合外層的需求。PA 能夠用于專用膜的主要原因是穩(wěn)定性和優(yōu)異的機(jī)械性能，如拉伸強(qiáng)度、抗穿刺性。另外，聚酯類，聚對苯二甲酸乙二醇酯由于優(yōu)異的耐熱性和機(jī)械性能，也常用于專用膜外層。

1.4 黏結(jié)層

黏結(jié)層的主要特性是將阻隔層連接到內(nèi)外層，因此需采用具有黏結(jié)作用的聚合物原料，通?？捎米黟そY(jié)層的材料類型為酸酐改性聚烯烴或酸改性聚烯烴，如馬來酸酐接枝的乙烯/丁烯（己烯、辛烯）共聚物。

2 膜制造過程

從原料到多層復(fù)合膜材料需要一定的制造工藝來實現(xiàn)，通常為薄膜擠出工藝［20-21］。在多層聚合物原料復(fù)合過程中，除原料外，各層添加物和膜的厚度也需要重點關(guān)注。在制造過程中添加一種或多種添加劑，主要是為了使薄膜更好地復(fù)合在一起，或者不易氧化、膠黏等。同時，總體膜的厚度及各層的厚度也有一定的要求，需滿足各層膜和整體的性能指標(biāo)。

2.1 專用膜生產(chǎn)工藝

在專用膜的工業(yè)化生產(chǎn)中，吹塑、流延、擠出層壓等薄膜擠出工藝是最常用的工藝技術(shù)［2］?；具^程是將經(jīng)選料得到的各層原料組分分別加入到多層共擠吹膜機(jī)（流延機(jī)等）對應(yīng)的進(jìn)料通道中，在特定機(jī)頭溫度條件下，經(jīng)熔融、吹塑或流延共擠出、擠出再涂布等，通過調(diào)整相應(yīng)工藝參數(shù)得到特定厚度的多層共擠出一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)專用膜。多層共擠出吹塑是多層聚合物復(fù)合膜材料的一種成型方法，它可以將兩種以上的聚合物，使用兩臺以上的擠出機(jī)，分別熔融后經(jīng)過各自獨立的流道，進(jìn)入多層口模共同擠出具有多層結(jié)構(gòu)的“膜管”，并成型為多層結(jié)構(gòu)的聚合物復(fù)合膜材料。通過流延方法制備的聚合物薄膜，是先經(jīng)過擠出機(jī)把原料塑化熔融，再通過T 形結(jié)構(gòu)成型模具擠出，聚合物熔體呈片狀流延至平穩(wěn)旋轉(zhuǎn)的冷卻輥筒表面上，膜片在冷卻輥筒上經(jīng)冷卻降溫定型，再經(jīng)牽引、切邊后收卷。擠出涂布是先擠出兩層或多層膜，然后在表面涂布一層聚合物。應(yīng)根據(jù)多層膜結(jié)構(gòu)設(shè)計、原料等選擇合適的工藝進(jìn)行膜的制備。值得注意的是，完整的吹膜、流延膜或涂布過程一般都在潔凈室中進(jìn)行，以保證不受外部污染。

另外，在膜制造過程中，各層結(jié)構(gòu)中通常需添加一種或多種添加劑。如添加抗氧化劑三（2，4-二叔丁基苯基）亞磷酸酯（抗氧劑168）、3-（3，5-二叔丁基-4-羥苯基）丙酸十八烷酯（抗氧劑1076）、四［β-（3，5-二叔丁基-4-羥基苯基）丙酸］季戊四醇酯（抗氧劑1010）、丁基羥基甲苯等。又如在外層添加防黏結(jié)的二氧化硅、硅酸鎂、碳酸鈣、硬脂酸鈣、硅氧烷等。但一般內(nèi)層需與細(xì)胞介質(zhì)接觸，接觸層則不應(yīng)包含滑爽劑或鄰苯二甲酸酯為增塑劑，因為這些添加劑可能包括能夠遷移至內(nèi)層表面的小分子物質(zhì)，進(jìn)而污染細(xì)胞。

2.2 專用膜厚度

一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)專用膜的總厚度和每一層的厚度，都需要認(rèn)真選定。每層的厚度選擇決定著專用膜的強(qiáng)度、韌性、氣體阻隔性、穩(wěn)定性等。專用膜總厚度一般在200 ～500 μm，目前市場上的專用膜產(chǎn)品通常為350 μm 左右。其中，作為與細(xì)胞接觸的液體接觸層和最外層的防護(hù)層相對較厚，以保證膜材的強(qiáng)度、韌性、熱合強(qiáng)度，通常外層厚度在50 ～150 μm，內(nèi)層厚度在150 ～300 μm；阻隔層厚度達(dá)到相應(yīng)的氣體透過率要求即可，厚度適中，通常在15 ～50 μm。黏合層需提供黏合作用，通常厚度為5 ～50 μm。

3 專用膜產(chǎn)品及主要性能指標(biāo)

3.1 國內(nèi)外專用膜產(chǎn)品

專用膜材料一般是直接制成一次性生物反應(yīng)袋、攪拌袋、儲液袋等出售，單獨出售膜產(chǎn)品的較少。目前，膜產(chǎn)品主要由國外幾家公司生產(chǎn)并制成相應(yīng)的下游產(chǎn)品出售。主要有德國雷諾麗特公司、賽多利斯公司、美國賽默飛世爾科技公司、密理博公司、通用公司及頗爾公司。目前，膜產(chǎn)品多為5 層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層使用聚乙烯系列產(chǎn)品居多，尤其是ULDPE，阻隔層幾乎全部采用EVOH，外層的選擇比較多樣，聚乙烯系列、聚酯系列都是常見的選擇，見表1。

表1 國外主要一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)專用膜產(chǎn)品及組成結(jié)構(gòu)Table 1 Main foreign film products and structures for disposable bioprocessing systems

國內(nèi)能夠進(jìn)行膜制品及袋體生產(chǎn)的公司較少，且原料和膜材料主要依賴進(jìn)口。2022 年初，上海樂純生物技術(shù)有限公司推出了LeKrius 生物工藝薄膜（ULDPE/tie/EVOH/tie/LDPE），并實現(xiàn)了量產(chǎn)，有望緩解一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)原材料緊張、成本高昂等問題。浙江金儀盛世生物工程有限公司、上海東富龍科技股份有限公司、楚天科技股份有限公司等也對膜材料，配液袋、儲液袋等袋體，一次性生物反應(yīng)器等開展了相關(guān)工作［18-19，22-23］。

3.2 專用膜性能評價

多層結(jié)構(gòu)專用膜的性能評價主要包括四個方面：機(jī)械性能、物理性能、穩(wěn)定性及生物安全性。由于專用膜的特殊使用環(huán)境，需要膜材料具備優(yōu)異的強(qiáng)度、柔韌性、耐刮擦、耐穿刺、熱封性等機(jī)械性能。同時，在長時間細(xì)胞培養(yǎng)和運輸過程中，需嚴(yán)格控制膜材內(nèi)外部的氣體交換、監(jiān)測膜內(nèi)液體情況，因此，膜的氣體阻隔性和透明性也是必須考察的重要因素。另外，膜的穩(wěn)定性和生物安全性是工業(yè)化應(yīng)用的必要前提。只有綜合考慮這些性能，才使膜更具有實用性。

3.2.1 機(jī)械性能

機(jī)械性能（強(qiáng)度和韌性、熱封性、耐穿刺性、抗疲勞性等）是專用膜重要的技術(shù)指標(biāo)，是膜材料能夠用于一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)的重要前提。專用膜強(qiáng)度和韌性是最先考察的一個要素，通常通過拉伸強(qiáng)度及伸長率、斷裂強(qiáng)度和伸長率、彈性模量等測試來判斷，同時，膜材料制備為袋體時，需進(jìn)行熱封，因此一定的熱合強(qiáng)度也是材料的必備性能。為使袋體內(nèi)部液體不易泄漏，材料必須是耐穿刺的。并且制成的袋體可能用于攪拌系統(tǒng)，長時間的攪拌對材料的性能要求較高，除了強(qiáng)度和韌性外，抗疲勞性也是材料應(yīng)用的前提。

3.2.2 物理性能

一次性生物反應(yīng)袋、儲液袋等需嚴(yán)格控制袋體內(nèi)部和外部的氣體交換，尤其是氧氣、水蒸氣和二氧化碳，因此專用膜需具備良好的氣體阻隔性能。專用膜的氧氣透過量一般必須小于9.9 mL/（m2·d·MPa）。同理，一般二氧化碳和水蒸氣的透過量也需處于較低水平，才被認(rèn)為具有良好的阻隔性能。此外，透明性也是專用膜的一個重要考察指標(biāo)。膜材需具有良好的透明性（透光率大于等于75%），才有利于操作人員觀察袋體內(nèi)部情況，以便對反應(yīng)進(jìn)程、液體存儲情況進(jìn)行監(jiān)測。

3.2.3 穩(wěn)定性

專用膜存在與袋體內(nèi)部溶液相互作用的潛在風(fēng)險，因此膜自身穩(wěn)定性是質(zhì)量保障的前提。穩(wěn)定性主要包括熱穩(wěn)定性、耐酸堿能力，凍存/解凍穩(wěn)定性以及輻照穩(wěn)定性。以輻照穩(wěn)定性為例，γ 射線輻照可能增加聚合物內(nèi)部的交聯(lián)或添加劑的降解［24］，而專用膜在使用前均需通過γ 射線輻照進(jìn)行無菌處理。因此考察輻照后專用膜是否發(fā)生變化是判斷材料輻照穩(wěn)定性的重要方式。

從專用膜的制備過程可知，專用膜并非純化合物。除了基礎(chǔ)聚合物，中間可能還需加入抗氧化劑、抗黏結(jié)劑等改善聚合物的加工性能或增強(qiáng)最終的使用性能。因此，專用膜上還可能存在一些不良?xì)埩粑?，比如未反?yīng)的單體、過程中使用的溶劑、聚合催化劑、表面活性劑或聚合物降解產(chǎn)物，可能對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，影響材料的生物相容性。據(jù)報道膜材料中常見的溶出物抗氧化劑分解產(chǎn)物雙（2，4-二叔丁基苯基）磷酸酯僅百萬分之幾的含量就會對細(xì)胞生長產(chǎn)生有害影響［25-28］。對膜供應(yīng)商而言，可提取物和可浸出物的測定是工藝驗證的重要部分，是必須提供的產(chǎn)品參數(shù)。目前，除《美國藥典》中有制藥包裝/運輸體系相關(guān)可提取物測試方法外，也有部分針對一次性系統(tǒng)中可提取物和溶出物測試方法的研究［29-32］。

3.2.4 生物安全性

專用膜主要用于抗體、重組蛋白等生產(chǎn)過程，產(chǎn)品與人民的生命健康息息相關(guān)，因此必須保障專用膜的生物安全性。專用膜的生物安全性主要分為體外生物安全性和體內(nèi)生物安全性，體外生物安全性驗證最常用的是體外細(xì)胞毒性實驗，測試方法參考《美國藥典》中的方法。另外，溶血實驗和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法也常用來判斷專用膜與血液的相互作用以及細(xì)菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定。體內(nèi)的生物安全性主要是參考塑料的體內(nèi)生物反應(yīng)性，通過全身注射實驗、皮下注射實驗以及植入實驗檢測動物對專有膜的生物反應(yīng)性，測試方法參考《美國藥典》中的方法。一般國外制造商生產(chǎn)的專用膜產(chǎn)品均為最為嚴(yán)格的Ⅳ級，因此這類專用膜產(chǎn)品被認(rèn)為具備良好的生物相容性。當(dāng)然，也可采用標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.5―2017［33］，GB/T 16886.6―2015［34］，GB/T 16886.10―2017［35］，GB/T 16886.11―2011［36］對 一次性生物反應(yīng)專用膜、反應(yīng)袋或儲液袋等制品的生物安全性進(jìn)行相關(guān)評價。

4 結(jié)語

隨著一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)規(guī)模的擴(kuò)大，袋體容量也在擴(kuò)大，商業(yè)化應(yīng)用最大規(guī)模一般為2 000 L，如何平衡袋體容量規(guī)模和專用膜性能之間的關(guān)系，使其能夠更好地用于一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)，是后續(xù)主要的研發(fā)方向。專用膜溶出物和析出物帶來的問題不可忽視，對聚合物也有一定的要求，尋求安全性和穩(wěn)定性更高的聚合物進(jìn)行專用膜復(fù)合是后續(xù)需要解決的重要問題。一次性生物反應(yīng)系統(tǒng)除了用于抗體和重組蛋白的生產(chǎn)外，也逐步擴(kuò)展到微生物發(fā)酵、藻類培養(yǎng)、食品和化妝品生產(chǎn)等，需設(shè)計更符合實際應(yīng)用場景需求的專用膜結(jié)構(gòu)。