張煥玲

(西北農(nóng)林科技大學林學院，陜西 楊凌 712100)

金葉復葉槭(Acernegundo‘Aurea’)屬槭樹科槭樹屬落葉喬木，是復葉槭的一個栽培變種。金葉復葉槭小枝光滑，奇數(shù)羽狀復葉對生，春季色澤金黃，觀賞性極高[1-2]。其生長快，耐干旱、極耐寒冷、耐輕度鹽堿，我國于20世紀初從歐洲引進，目前在華北、東北、西北及華東地區(qū)均有栽培[3]。因其扦插生根困難，生產(chǎn)中主要采用嫁接繁殖[1]，但在嫁接繁殖中不親和現(xiàn)象較為普遍，后期樹勢衰退嚴重。利用組織培養(yǎng)技術不僅可以快速建立其快繁體系，還能促進品種改良和分子育種研究的開展。

1 材料與方法

1.1 材料

以金葉復葉槭3年生休眠枝溫室水培嫩枝為外植體。休眠枝采自楊凌大石景觀苗木基地從遼寧引進的金葉復葉槭5年生大苗，于1月中旬采集后水培，水培時枝條上端套1塑料袋，每3 d換水1次，同時修剪枝條下切口。

1.2 方法

1.2.1 初代培養(yǎng)及基本培養(yǎng)基篩選

待休眠枝萌發(fā)嫩枝長至15 cm左右長時，將其剪成帶1個腋芽的莖段，按照體積分數(shù)75%酒精浸潤 50 s、無菌水沖洗3次、質(zhì)量分數(shù)0.1%氯化汞消毒8 min、無菌水沖洗5次的程序消毒，消毒后修剪莖段兩端約2 mm后接種在不含任何附加物的不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)50 d，觀察統(tǒng)計接種外植體的腋芽萌發(fā)率及長度，以篩選適合的基本培養(yǎng)基。選用3種基本培養(yǎng)基，即富集元素平衡培養(yǎng)基MS、高硝酸鉀含量培養(yǎng)基B5和低鹽培養(yǎng)基WPM。

1.2.2 莖段增殖培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)中獲得的無菌莖段接種在含不同濃度生長素和分裂素的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以篩選適合的增殖培養(yǎng)基。

生長素和分裂素篩選采用逐步篩選的單因素試驗設計，先將修剪好的帶1個腋芽的無菌莖段接種在附加0.5 mg/L 6-BA、不同質(zhì)量濃度NAA(0.02、0.04、0.06、0.08 mg/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以篩選有利于莖段增殖的NAA濃度。再將材料接種在含上述篩選出的NAA、不同質(zhì)量濃度6-BA(0.3、0.5、0.7、0.9 mg/L) 的培養(yǎng)基中，以篩選有利于莖段增殖的6-BA濃度。最后將材料接種在含上述篩選出的NAA、6-BA、不同質(zhì)量濃度的TDZ(0.00、0.01、0.05、0.10 mg/L)的培養(yǎng)基中，篩選有利于莖段增殖的TDZ濃度。培養(yǎng)45 d后，統(tǒng)計每個外植體的增殖芽數(shù)、長度，觀察記錄芽的長勢。

1.2.3 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)中獲得的2～3 cm的段分別接種于含不同質(zhì)量濃度IBA及不同質(zhì)量濃度NAA(0.00、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/L)的1/2 MS基本培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計初生根時間、50 d時的生根率及生根苗生長情況，以篩選生根培養(yǎng)基。

1.2.4 煉苗移栽

當生根苗根長至3～6 cm時，將瓶蓋半開，在培養(yǎng)室煉苗3 d后進行移栽。移栽時先用鑷子輕輕夾出幼苗，在水中輕柔沖洗根部培養(yǎng)基，移栽至裝有商品化育苗細基質(zhì)的培養(yǎng)容器中，置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)至恢復生長，培養(yǎng)箱相對濕度設置為85%，以30%(接近室內(nèi)濕度)為對照。

1.2.5 培養(yǎng)條件與重復數(shù)

所有實驗培養(yǎng)條件為于(25±2) ℃、16 h/d光照、2 000 lx光照度條件。每個實驗處理接種25瓶，重復3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

對實驗結果中增殖芽數(shù)、平均根數(shù)數(shù)據(jù)經(jīng)平方根轉換，百分率經(jīng)反正弦轉換后，用SPSS 20.0進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基篩選結果

基本培養(yǎng)基是建立一個新植物組培體系時首要研究的問題。用于復葉槭組培的基本培養(yǎng)基報道不一致，故選取3種代表不同類型的培養(yǎng)基進行實驗。結果表明，金葉復葉槭水培嫩枝在不添加任何附加物的MS、B5、WPM 3種培養(yǎng)基中均能成功誘導腋芽萌發(fā)。外植體接種3周后，腋芽開始萌動，露出綠點，5周后開始伸長。但在MS和WPM培養(yǎng)基中的萌發(fā)率要顯著高于B5培養(yǎng)基(P<0.05)10余個百分點(表1)。MS和WPM培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于無機鹽濃度差異，B5與MS、WPM培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于其含有高濃度的硝態(tài)氮，這說明金葉復葉槭莖段腋芽誘導的關鍵影響因素可能是N元素的供應形態(tài)，而非無機鹽的濃度。

表1 不同培養(yǎng)基中的初代培養(yǎng)比較

盡管MS和WPM在腋芽誘導方面差異不顯著，但對萌發(fā)新芽的伸長生長影響較大。在MS培養(yǎng)基中新芽生長快，30 d后平均長度超過2 cm(表1、圖1A)。

A.MS培養(yǎng)基中的初代培養(yǎng)primary culture in MS medium；B.最佳增殖培養(yǎng)基中的增殖培養(yǎng)proliferative culture in optimum medium;C.0.05 mg/L IBA誘導生根root inducing with 0.05 mg/L IBA;D.再生組培苗regeneration plant。圖1 金葉復葉槭不同組培階段生長情況Fig.1 The growth situation in different cultural stages of A. negundo ‘Aurea’

而在WPM和B5培養(yǎng)基中新芽生長緩慢，平均長度在1.5 cm以下(表1)，這說明金葉復葉槭離體材料的伸長生長需要含較高濃度無機鹽的培養(yǎng)基。

綜上，從腋芽萌發(fā)率和新芽伸長生長綜合考慮，最終選擇MS作為金葉復葉槭組培的最佳基本培養(yǎng)基。

2.2 生長調(diào)節(jié)劑濃度對金葉復葉槭增殖培養(yǎng)的影響

2.2.1 NAA

以MS為基本培養(yǎng)基，固定細胞分裂素6-BA濃度(0.5 mg/L)，添加不同質(zhì)量濃度的生長素NAA，研究了NAA對金葉復葉槭增殖培養(yǎng)的影響(表2)。

表2 NAA濃度對金葉復葉槭增殖培養(yǎng)的影響

從表2可看出，NAA質(zhì)量濃度在0.02～0.08 mg/L范圍內(nèi)，隨著NAA濃度的增加，金葉復葉槭每個外植體增殖芽數(shù)和芽平均長度均呈現(xiàn)升高趨勢。0.02和0.04 mg/L，以及0.06和0.08 mg/L NAA中增殖芽數(shù)間無顯著差異(P>0.05)，但0.06和0.08 mg/L NAA中的增殖芽數(shù)顯著高于0.02和0.04 mg/L(P<0.05)。盡管0.06和0.08 mg/L NAA在增殖芽長度方面差異不顯著(P>0.05)，但二者均顯著高于0.02和0.04 mg/L NAA中的芽長(P<0.05)，芽長比前者增加了5～6倍，比后者增加了2倍左右。這些結果表明，在金葉復葉槭增殖培養(yǎng)中，與0.5 mg/L 6-BA搭配使用的NAA濃度至少要達到0.05 mg/L以上，二者濃度比在10∶1左右為宜。

另外，從增殖芽長勢情況來看，在低濃度和高濃度NAA中增殖的芽生長都不正常，0.02和0.04 mg/L NAA中增殖的芽表現(xiàn)出“細弱”的典型特征，0.08 mg/L NAA中的則表現(xiàn)出“細長”的特征，說明NAA濃度過高或過低都會削弱增殖芽的長勢。

2.2.2 6-BA

以MS為基本培養(yǎng)基，附加0.06 mg/L NAA，添加不同濃度的6-BA，研究了6-BA對金葉復葉槭增殖培養(yǎng)的影響。

細胞分裂素是植物組織培養(yǎng)增殖培養(yǎng)階段必須添加的植物生長調(diào)節(jié)劑，實驗結果(表3)表明，在0.3～0.9 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，外植體增殖芽數(shù)和芽長度均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。增殖芽數(shù)最高的是含0.7 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基，芽長度最長的是含0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基，當6-BA質(zhì)量濃度達0.9 mg/L時，增殖芽數(shù)有所下降。當6-BA質(zhì)量濃度超過0.7 mg/L時，外植體基部開始出現(xiàn)愈傷組織，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，芽長度開始下降。盡管0.5和0.7 mg/L 6-BA中增殖芽數(shù)無顯著差異(P>0.05)，但0.5 mg/L中的芽長度顯著高于0.7 mg/L(P<0.05)，故選擇0.5 mg/L 6-BA為增殖培養(yǎng)的最佳濃度。

表3 6-BA濃度對金葉復葉槭增殖培養(yǎng)的影響

2.2.3 TDZ

TDZ是人工合成的具有細胞分裂素活性的苯基脲衍生物，是被廣泛用于植物組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生的高效生物調(diào)節(jié)劑，具有生長素和細胞分裂素雙重作用。為進一步提高金葉復葉槭增殖系數(shù)，在篩選6-BA(0.5 mg/L)和NAA(0.06 mg/L)的基礎上,通過添加不同質(zhì)量濃度的TDZ探究其是否有利于莖段增殖。

表4 TDZ濃度對金葉復葉槭增殖培養(yǎng)的影響

結果(表4)表明，添加TDZ能顯著提高金葉復葉槭的增殖系數(shù)(P<0.05)，隨著TDZ濃度的增加，增殖芽數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢。不添加TDZ時的增殖芽數(shù)平均只有4.1個，添加TDZ后最高可達6.6個，當TDZ質(zhì)量濃度超過0.05 mg/L時，增殖芽數(shù)不再增加。低濃度的TDZ(0.01 mg/L)對芽伸長生長影響不顯著(P>0.05)，但高濃度的TDZ(>0.05 mg/L)會抑制芽的生長，芽長度顯著降低(P<0.05)。0.05 mg/L TDZ中增殖的芽平均長度比0.01 mg/L中短1 cm，且芽纖細，當TDZ質(zhì)量濃度達0.10 mg/L時，增殖芽開始出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

綜上，金葉復葉槭莖段增殖培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L TDZ+0.06 mg/L NAA，該培養(yǎng)基中每個外植體可增殖5.8個新芽，芽長勢良好(圖1B)。

2.3 NAA、IBA濃度對金葉復葉槭生根的影響

NAA和IBA是植物組織培養(yǎng)中生根培養(yǎng)常用的兩種生長素，實驗在1/2 MS培養(yǎng)基中通過分別添加不同濃度的NAA和IBA，研究了2種生長素對金葉復葉槭組培苗生根的影響。

由表5分析可得，培養(yǎng)基中添加IBA或NAA均可促進組培苗生根，無論是生根時間、生根數(shù)量，還是生根率，都比不添加任何生長素要好，但IBA生根效果要明顯好于NAA。不添加任何生長素時最早生根需要25 d，生根率只有23.1%，平均根數(shù)2.8條，添加IBA后生根時間最多可提前12 d，生根率達100%，平均根數(shù)最多達9.1條(圖1C)；添加NAA后對生根天數(shù)影響不大，但生根率可最高至78.3%，平均根數(shù)也顯著增加，最多5.7條。研究發(fā)現(xiàn)，隨著生長素濃度的增加，愈傷組織生根增多，當IBA質(zhì)量濃度為0.07 mg/L、NAA質(zhì)量濃度為0.09 mg/L時，新生根與莖基部有愈傷組織出現(xiàn)，愈傷組織生根會影響后期的移栽成活率，不利移栽。故最終選取1/2 MS+0.05 mg/L IBA為金葉復葉槭組培生根培養(yǎng)基,在該培養(yǎng)基中生長的組培苗長勢良好(圖1D)。

表5 不同NAA與IBA濃度生根效果比較

2.4 試管苗的煉苗移栽

金葉復葉槭試管苗葉片較大，蒸騰失水快，煉苗3 d的試管苗移栽至培養(yǎng)基質(zhì)中，如不能保證足夠的空氣濕度，30 min 內(nèi)就可出現(xiàn)葉片失水萎蔫現(xiàn)象(圖2A)，1 d內(nèi)葉片即可干枯，移栽成活率不到10%。相反，置于85%相對濕度下的移栽苗葉片失水較輕，輕度萎蔫3 d內(nèi)即可恢復正常(圖2B)，10 d即可恢復生長，移栽成活率高達95%。因此，保溫是金葉復葉槭組培苗移栽成活的關鍵。

A.30%相對濕度30% relative humidity；B.85%相對濕度85% relative humidity;C.IBA誘導的組培苗根系roots of tissue culture plantlets induced by IBA。圖2 金葉復葉槭組培苗煉苗移栽Fig.2 Acclimatization and transplants of A. negundo ‘Aurea’ tissue culture plantlets

移栽使用的基質(zhì)是普通的商品化育苗細基質(zhì)，在相對濕度85%的條件下并未發(fā)現(xiàn)移栽苗生長不良現(xiàn)象，說明金葉復葉槭組培苗移栽可能對基質(zhì)要求不嚴，也可能是因為IBA誘導的試管苗根系與莖段連接處愈傷組織少，主、側根均較粗壯(圖2C)，易于移栽成活。

3 討 論

1) 本研究以3年生休眠枝水培嫩枝為試材，建立了遼寧種源的金葉復葉槭組織培養(yǎng)體系，系統(tǒng)篩選了基本培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，移栽成活率高達95%，為該觀賞樹種良種快繁提供了新途徑。研究結果顯示，營養(yǎng)元素富集的MS培養(yǎng)基適合作為金葉復葉槭莖段培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，其誘導腋芽萌發(fā)性能要比B5和WPM培養(yǎng)基好。細胞分裂素與生長素的聯(lián)合使用對增殖培養(yǎng)有利，低濃度的TDZ有助于提高不定芽增殖系數(shù)，0.5 mg/L 6-BA結合0.01 mg/L TDZ和0.06 mg/L NAA，可使每個外植體平均增殖5.8個新芽。生長素IBA和NAA均可有效促進組培苗生根，但IBA效果明顯優(yōu)于NAA，在1/2 MS附加0.05 mg/L IBA的生根培養(yǎng)基中生根率可達100%，較不添加生長素提升近75%。影響金葉復葉槭組培苗移栽的主要因素是空氣相對濕度，85%的相對濕度可保證95%的移栽成活率。

2) 本研究所用外植體為室內(nèi)水培休眠枝萌發(fā)的新枝，與生長季大田采集的外植體相比，有污染率小、消毒時間短、消毒劑對外植體傷害小的優(yōu)點，這對初代培養(yǎng)十分有利。金葉復葉槭休眠枝休眠狀態(tài)較難打破，水培枝條萌發(fā)需要較高溫度和較長時間，但長時間下高溫水培對枝條營養(yǎng)消耗和蒸騰失水影響很大，因此需要選擇健壯的枝條并在相對濕潤的環(huán)境下進行水培。

基本培養(yǎng)基是建立一個新植物組培體系時首要研究的問題，選擇不當，會直接影響組培效果。目前植物組織培養(yǎng)領域常用的基本培養(yǎng)基達14種之多，根據(jù)成分可將其聚為4大類[14]，本研究選取了3大類當中的3種典型培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基的效果優(yōu)于WPM和B5培養(yǎng)基，這與王艷輝等[2]的研究結果類似，但與李艷敏等[3]的研究結果不一致。李艷菊等[4]和馬秋月等[5]在元寶楓組培中也發(fā)現(xiàn)同種培養(yǎng)基有不同的培養(yǎng)效果，這可能與基因型、外植體類型及狀態(tài)有關，因為同一樹種的不同基因型、不同外植體及同一外植體的不同狀態(tài)都會要求不同的組培系統(tǒng)[15]。此外，是否可進一步通過微調(diào)MS培養(yǎng)基中各種成分的量，找到一種更優(yōu)的改良MS培養(yǎng)基，或者其他10余種培養(yǎng)基是否比MS更好，值得進一步研究。

細胞分裂素和生長素聯(lián)合使用是增殖培養(yǎng)的有效方法，從前人經(jīng)驗和經(jīng)濟角度考慮，多數(shù)研究都采用6-BA與NAA或IBA聯(lián)合使用，均能起到一定的增殖效果，但增殖系數(shù)普遍不高[2,8,10,12]。研究發(fā)現(xiàn)很少量的TDZ即可產(chǎn)生明顯的增殖效果[4，16]，本研究也證實0.01 mg/L的TDZ就可使每個外植體多增殖近2個新芽，但用量控制不當容易引起愈傷組織生根及玻璃化苗的產(chǎn)生。因此，尋找新的使用方便且高效的細胞分裂素類物質(zhì)十分有必要。

金葉復葉槭試管苗生根相對容易，單獨使用IBA即可100%生根，關鍵是如何調(diào)整濃度控制愈傷組織生根現(xiàn)象的發(fā)生。此外，本研究只對組培苗以半開瓶蓋的方式進行了3 d的短時間培養(yǎng)室煉苗，保濕是按此方式煉苗后移栽成活的關鍵，是否可以通過全開蓋、長時間、室溫煉苗來提高組培苗對干旱的耐性應該是今后研究的重點。