劉詩(shī)詩(shī),歐陽(yáng)玉娟,盧先州

劉詩(shī)詩(shī),歐陽(yáng)玉娟,盧先州,南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院肝膽外科 湖南省衡陽(yáng)市 421200

0 引言

胰腺癌是世界上最致命的消化道腫瘤之一,它是2021年全球第七大常見(jiàn)惡性腫瘤,也是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因.胰腺癌最常見(jiàn)的類(lèi)型是胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC).由于早期診斷困難、早期轉(zhuǎn)移、以及對(duì)化療反應(yīng)不敏感,胰腺癌患者的五年存活率僅為3%.手術(shù)是徹底治愈胰腺癌的唯一辦法,然而由于早期臨床癥狀不典型,大多數(shù)胰腺癌患者確診時(shí)已經(jīng)進(jìn)入了晚期,錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)時(shí)機(jī).晚期胰腺癌患者可通過(guò)化療提高生存率,包括吉西他濱(gemcitabin,GEM)、鉑類(lèi)藥物、5-氟尿嘧啶以及PARP抑制劑等靶向治療藥物.然而,對(duì)化療產(chǎn)生多藥耐藥(multiple drug resistance,MDR)是臨床腫瘤學(xué)的主要障礙,可能導(dǎo)致預(yù)后不良.胰腺癌的耐藥機(jī)制很復(fù)雜,包括細(xì)胞內(nèi)藥物攝取減少、藥物外排增加、藥物代謝加速、對(duì)藥物誘導(dǎo)的凋亡的抵抗、DNA損傷修復(fù)、影響藥物靶點(diǎn)的突變、癌癥干細(xì)胞的激活以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)改變藥物轉(zhuǎn)運(yùn).因此,進(jìn)一步了解耐藥的潛在分子機(jī)制對(duì)于更有效的胰腺癌治療是十分必要的.

外泌體是由多種細(xì)胞釋放的內(nèi)體多囊泡體形成的雙層納米級(jí)膜泡,與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和化療耐藥有關(guān).外泌體可以攜帶各種生物成分,包括:蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)等,可經(jīng)鄰近細(xì)胞攝取需傳遞的“信息”,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞之間的物質(zhì)交換,并誘導(dǎo)其表型變化.越來(lái)越多的證據(jù)表明,外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞通訊是一種新發(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)制.通過(guò)直接輸出藥物,誘導(dǎo)藥物失活,并傳遞功能蛋白和ncRNAs,對(duì)PDAC耐藥起著重要作用.

非編碼RNA(ncRNAs)是一種不能被編碼成蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.根據(jù)長(zhǎng)度、形狀和功能,ncRNAs可細(xì)分為以下幾種類(lèi)型:tiny/short ncRNAs,大于200個(gè)核苷酸的long ncRNA (lncRNAs)和環(huán)狀RNA(circRNAs),小的ncRNA,如microRNAs(miRNAs)、小核仁RNA(snoRNAs)和小核RNAs(snRNAs).NcRNAs已被證明是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子,而不僅僅只是基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的“副產(chǎn)品”.大量研究表明,NcRNAs參與許多生物學(xué)功能,如細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞凋亡等,并且在胰腺不同的發(fā)育階段和腫瘤等病理?xiàng)l件下表達(dá)存在差異,與胰腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、放化療耐藥有關(guān).NcRNAs也可以作為分子信號(hào),利用外泌體在不同的細(xì)胞和組織之間傳遞.在這些異常表達(dá)的ncRNAs中,各種miRNAs和lncRNAs已被發(fā)現(xiàn)在PDAC化療耐藥中發(fā)揮重要作用.

本文主要綜述了外泌體的生物學(xué),外泌體ncRNAs調(diào)控胰腺癌耐藥的機(jī)制,從而為外泌體ncRNAs作為未來(lái)可能的胰腺癌生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)的作用提供了新的思路.

1 外泌體:起源、生物學(xué)功能

外泌體是在1981年由Trams等人在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離得到被雙層膜包圍的小囊泡.1987年,Johnstone將這些細(xì)胞外小泡命名為Exosomes.外泌體主要在胞外刺激、微生物攻擊或者其他應(yīng)激條件等的誘導(dǎo)下生成.外泌體是由晚期的核內(nèi)體發(fā)育而來(lái)的,核內(nèi)體是由質(zhì)膜內(nèi)陷產(chǎn)生的.與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合后,在高爾基體中加工,產(chǎn)生多泡小體(multivesicular bodies,MVB).然后,成熟的MVB與質(zhì)膜結(jié)合,以外體的形式將其內(nèi)容釋放到細(xì)胞外空間.由于外泌體的結(jié)構(gòu)很小,通常采用超速離心法進(jìn)行分離,從血液或細(xì)胞培養(yǎng)液中提取外泌體.簡(jiǎn)而言之,血漿或血清被稀釋(1:1),在2000轉(zhuǎn)的4 ℃下離心30 min,收集的沉淀物用PBS洗滌,在11萬(wàn)轉(zhuǎn)的4 ℃下離心70 min,得到的沉淀物含有外泌體.雖然有不同的方法來(lái)分離外泌體,包括免疫分離、沉淀和密度梯度離心法,但到目前為止,還沒(méi)有分離外泌體的金標(biāo)準(zhǔn).因此,分離方法應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)的要求和問(wèn)題而定.

外泌體(Exosome)由多種細(xì)胞類(lèi)型釋放,包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞,并發(fā)現(xiàn)在各種體液中富集,包括血液、唾液、母乳、尿液和腦脊液.最初外泌體被認(rèn)為是清除細(xì)胞中降解的或不需要的細(xì)胞成分的“垃圾桶”,隨著對(duì)外泌體研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)這些囊泡是有功能的,外泌體可以介導(dǎo)大量生理或病理?xiàng)l件下的細(xì)胞間通訊,將DNA、RNA(編碼和非編碼)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等活性成分從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,也可以通過(guò)配體-受體相互作用激活受體細(xì)胞的下游信號(hào)通路,同時(shí)外泌體的雙層膜可以保護(hù)這些成分免受蛋白酶、核酸酶和其他環(huán)境影響,從而參與抗原提呈、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、腫瘤的免疫反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲.越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),與健康人相比,腫瘤患者血液循環(huán)中的外泌體數(shù)量增加了,這表明癌癥與外泌體分泌增加有關(guān).據(jù)報(bào)道,癌癥中的外泌體被關(guān)鍵地釋放到癌癥微環(huán)境和循環(huán)系統(tǒng)中,這些證據(jù)表明包括ncRNAs在內(nèi)的外泌體成分被認(rèn)為是一種很有前途的篩查工具,它們可以用來(lái)增強(qiáng)早期胰腺癌檢測(cè)的響應(yīng)性和可靠性.同時(shí),腫瘤來(lái)源的外泌體可能與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、腫瘤微環(huán)境和化療耐藥有關(guān).然而,外泌體在腫瘤中的確切作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究.

2 外泌體中的非編碼RNA

非編碼RNA約占人類(lèi)基因組的98%,是一類(lèi)不能編碼蛋白質(zhì)的RNA,可以與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用,在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá),并調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程.廣泛的研究表明,NcRNAs可調(diào)節(jié)各種分子過(guò)程和人類(lèi)疾病.越來(lái)越多的研究表明:外泌體中富含ncRNAs,包括microRNA(MiRNAs)、長(zhǎng)非編碼RNA(LncRNAs)、環(huán)狀RNA(CircRNAs)等,外泌體作為細(xì)胞溝通的媒介,可以將ncRNAs選擇性地包裝、分泌和在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移,影響腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)和耐藥性等腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵過(guò)程.隨著對(duì)外泌體中的ncRNAs的發(fā)現(xiàn)和進(jìn)一步研究,出現(xiàn)了許多新的功能和應(yīng)用,從細(xì)胞間通訊工具到有前途的疾病生物標(biāo)志物,可能還存在新的治療應(yīng)用.本文主要對(duì)外泌體miRNAs、lncRNAs和CircRNAs在胰腺癌的化療耐藥中的潛在機(jī)制進(jìn)行綜述.

2.1 MicroRNA(微小RNA) MiRNAs是由外泌體傳遞的重要貨物,通常由大約21-25個(gè)核苷酸組成的小ncRNA,通過(guò)與靶mRNA的3‘非翻譯區(qū)(UTR)互補(bǔ)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá),從而降低或抑制靶基因的穩(wěn)定性.大多數(shù)成熟的miRNA序列位于非編碼RNA的內(nèi)含子或外顯子以及Pre-mRNA的內(nèi)含子中.MiRNA的生物發(fā)生始于將miRNA基因轉(zhuǎn)錄成大的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA),其中含有一個(gè)或幾個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu),每個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)由大約70個(gè)核苷酸組成.然后被包括RNase-Ⅲ型酶Drosha和RNA結(jié)合蛋白Dgcr8的微處理器復(fù)合體切割成一個(gè)約85個(gè)核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu),稱(chēng)為前體miRNA(pre-miRNA).通過(guò)Exportin 5和Ran-GTP復(fù)合物將pre-miRNA輸出到細(xì)胞質(zhì)后,它們?cè)诃h(huán)附近被Disher切割成小的雙鏈RNA(DsRNAs).這些miRNA雙鏈?zhǔn)遣环€(wěn)定的,很快就會(huì)被切割成單鏈成熟的miRNA.成熟的miRNA被裝載到Argonaute蛋白(AGO)上,形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC),然后與靶mRNA結(jié)合,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默.大量研究表明,在許多癌癥中,包括胰腺癌,miRNA表達(dá)異常在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用.此外,miRNAs被選擇性地包裹在參與腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間通訊的外泌體,并在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用.

2.2 長(zhǎng)鏈非編碼RNA 長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNAs)是另一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本,沒(méi)有或具有有限的蛋白質(zhì)編碼能力.與mRNAs一樣,它們也是由RNA聚合酶II(RNA Pol II)從獨(dú)立啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄而來(lái).LncRNAs既存在于細(xì)胞核中,也存在于細(xì)胞質(zhì)中,并根據(jù)其亞細(xì)胞定位而發(fā)揮不同的功能.在細(xì)胞核內(nèi),LncRNAs可能參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和mRNA的剪接.而在細(xì)胞質(zhì)中,它們可以影響mRNA的穩(wěn)定性并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能.越來(lái)越多的研究表明,包括胰腺癌在內(nèi)的許多癌癥中都觀察到了LncRNAs表達(dá)的失調(diào),并通過(guò)其作為腫瘤抑制因子或癌基因的雙重作用與癌癥的分期和分級(jí)密切相關(guān).有趣的是,LncRNA也可以選擇性地包裹在外泌體內(nèi),從而保護(hù)LncRNA免受降解,并有助于腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞間通訊.外泌體LncRNA可參與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展,如增殖、侵襲、血管生成和耐藥,可能成為有吸引力的治療靶點(diǎn).

2.3 環(huán)狀RNA 環(huán)狀RNA(circular RNA,CircRNA)是一種新的非編碼RNA分子亞型,它在5‘端和聚(A)尾部之間的3’端形成具有共價(jià)鍵的環(huán)狀結(jié)構(gòu).主要是由外顯子的pre-mRNA通過(guò)反向剪接產(chǎn)生的.CircRNA是一種長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本,它們高度穩(wěn)定,進(jìn)化保守,在特定組織中廣泛分布.CircRNA最初被認(rèn)為是RNA拼接的副產(chǎn)品.隨著高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)和CircRNA特異的生物信息學(xué)的廣泛應(yīng)用,已經(jīng)在人類(lèi)和其他真核生物中鑒定出了數(shù)以千計(jì)的CircRNA,并在最近幾年逐漸揭示了CircRNA的特征和行為.雖然CircRNA不編碼已知的蛋白質(zhì),但它們廣泛參與人類(lèi)生物過(guò)程的調(diào)節(jié).許多研究證實(shí),CircRNA在包括胰腺癌在內(nèi)的腫瘤中高度表達(dá),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用.目前對(duì)于外泌體circRNA的研究仍處于初級(jí)階段,但少數(shù)研究表明,CircRNA富含在外泌體中,CircRNA通過(guò)外泌體開(kāi)始循環(huán)并到達(dá)受體細(xì)胞,從而實(shí)現(xiàn)其各種生物學(xué)功能.與線(xiàn)性RNA不同,具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的CircRNA不易被核酸外切酶消化,更穩(wěn)定,半衰期更長(zhǎng),因此它們可以被認(rèn)為是大量癌癥診斷和預(yù)后的有前途的生物標(biāo)志物.

3 外泌體ncRNAs與胰腺癌耐藥

越來(lái)越多的證據(jù)表明,外泌體ncRNAs在促進(jìn)胰腺癌化療耐藥中發(fā)揮了重要的作用,找出其中涉及的機(jī)制有助于抑制危及生命的胰腺癌.GEM是胰腺癌化療中使用最廣泛的藥物,GEM是一種DNA核苷類(lèi)似物,它不可逆轉(zhuǎn)地抑制核苷酸還原酶的活性,阻止DNA復(fù)制和修復(fù)所需的雙氧核糖核苷酸的合成,可以導(dǎo)致DNA損傷,最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡.盡管如此,大量臨床試驗(yàn)表明GEM對(duì)胰腺癌患者的療效較低.腫瘤細(xì)胞在首次接觸GEM后表現(xiàn)出抗藥性.因此,了解GEM耐藥的潛在分子機(jī)制對(duì)于克服GEM耐藥和開(kāi)發(fā)胰腺癌新的治療策略具有重要意義.

外泌體MiRNAs在諸如PDAC等不同惡性腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.幾乎所有提到的miRNA都能夠在耐藥細(xì)胞及反應(yīng)性細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移,以攜帶耐藥特性,反之亦然.例如:癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)是PDAC腫瘤的主要組成部分,對(duì)GEM具有本質(zhì)耐藥性,而GEM是PDAC的化療治療標(biāo)準(zhǔn).然而,GEM治療的胰腺癌(pancreatic cancer,PC)細(xì)胞將外泌體傳遞的miR-155轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,通過(guò)下調(diào)GEM代謝基因(DCK)導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞耐藥.同時(shí),也有研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中miR-155表達(dá)的增加具有抗凋亡作用,并導(dǎo)致細(xì)胞釋放外泌體.外泌體隨后將與化療耐藥相關(guān)的物質(zhì),包括miR-155,傳遞給其他癌細(xì)胞,受體細(xì)胞隨后產(chǎn)生化療耐藥并顯示出外泌體合成的增加.此外,有研究發(fā)現(xiàn),miR-365可以通過(guò)上調(diào)癌細(xì)胞中三磷酸核苷酸庫(kù)和誘導(dǎo)胞苷脫氨酶抑制GEM的激活,后者使GEM失活,巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以通過(guò)轉(zhuǎn)移miR-365誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥性.更有研究發(fā)現(xiàn),來(lái)自GEM耐藥胰腺癌干細(xì)胞的外泌體通過(guò)傳遞miR-210介導(dǎo)耐藥性狀向GEM敏感胰腺癌細(xì)胞的水平轉(zhuǎn)移,并抑制GEM誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯,拮抗GEM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的管形成和細(xì)胞遷移.此外,研究發(fā)現(xiàn),miR-106b通過(guò)癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)來(lái)源的外泌體傳播,并通過(guò)直接靶向TP53INP1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥性.因此,CAFs來(lái)源的外泌體miR-106b在導(dǎo)致胰腺癌GEM耐藥性中發(fā)揮了重要作用,從而為胰腺癌細(xì)胞對(duì)GEM敏感提供了一個(gè)新的靶點(diǎn).綜上所述,外泌體MiRNAs是一種潛在的非侵入性生物標(biāo)志物和新的抗癌治療靶點(diǎn).外泌體MiRNAs作為抗化療耐藥性靶點(diǎn)的價(jià)值值得進(jìn)一步研究.

同時(shí),大量研究表明外泌體LncRNA在胰腺癌發(fā)展過(guò)程及化療耐藥起著關(guān)鍵作用.例如:外泌體可以介導(dǎo)LncRNA SNHG11通過(guò)海綿覆蓋miR-324-3p調(diào)控VEGFA的表達(dá),促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和血管生成.也有研究表明,外泌體LncRNA Sox2ot,作為一種競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA(ceRNA),可以競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miR-200家族上調(diào)Sox2,從而誘導(dǎo)EMT和干細(xì)胞樣特征,促進(jìn)PDAC的侵襲和轉(zhuǎn)移.此外,有研究表明,在缺氧條件下,缺氧誘導(dǎo)的胰腺星形細(xì)胞(pancreatic stellate cells,PSCs)分泌的外泌體將lncRNA UCA1傳遞到胰腺癌細(xì)胞中,lncRNA UCA1通過(guò)招募EZH2調(diào)控SOCS3蛋白的甲基化,降低SOCS3的表達(dá),促進(jìn)胰腺癌的GEM耐藥性.因此,外泌體介導(dǎo)的LncRNA可以在胰腺癌發(fā)生發(fā)展及化療耐藥中發(fā)揮重要作用.

并且,有研究發(fā)現(xiàn),外泌體cirRNA在胰腺癌發(fā)展過(guò)程中及化療耐藥中起著重要作用.例如:研究發(fā)現(xiàn)circ-PDE8A可以通過(guò)miR-338/MACC1/MET/AKT 或 ERK通路促進(jìn)胰腺癌侵襲能力,并且circ-PDE8A可以通過(guò)腫瘤分泌的外泌體釋放到血液循環(huán)中.因此,外泌體circ-PDE8A可能是PDAC診斷或進(jìn)展的有用標(biāo)志物.同時(shí),也有研究發(fā)現(xiàn),來(lái)自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)的外泌體circ-0030167通過(guò)海綿吸收miR-338-5p和靶向Wif1/Wnt8/β-catenin軸,從而抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖和干細(xì)胞性.同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)外泌體circZNF91可以作為一種載體,介導(dǎo)低氧和常氧腫瘤細(xì)胞之間的信號(hào)傳輸,可以競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miR-23b-3p并上調(diào)去乙?；窼irtuin1(SIRT1)導(dǎo)致受體胰腺癌細(xì)胞的糖酵解和對(duì)GEM化療耐藥性,并可能作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn).

4 結(jié)論

綜上所述,外泌體ncRNAs在胰腺癌化療耐藥中的作用已逐漸被揭示.外泌體作為天然載體,轉(zhuǎn)移參與耐藥的ncRNAs和蛋白質(zhì).靶向外泌體ncRNAs,結(jié)合傳統(tǒng)化療或靶向治療,可能是治療晚期胰腺癌耐藥性的一個(gè)有希望的選擇.本文綜述了外泌體ncRNAs影響胰腺癌化療耐藥的多種機(jī)制,包括:通過(guò)調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路、影響EMT、細(xì)胞凋亡、自噬、細(xì)胞周期失調(diào)、靶向ABC藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體以及相互調(diào)節(jié)來(lái)發(fā)揮作用.例如,一些環(huán)狀RNA可以充當(dāng)miRNA海綿.外泌體ncRNAs能夠在不同細(xì)胞之間傳遞,使它們對(duì)化療藥物敏感或耐藥.本文還討論了外泌體ncRNAs作為生物標(biāo)志物的潛在治療價(jià)值.然而外泌體ncRNAs在化療耐藥中的潛在作用目前尚不清楚.迄今為止,將有希望的細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床試驗(yàn)仍然是最困難的挑戰(zhàn).因此,了解外泌體ncRNAs調(diào)節(jié)胰腺癌耐藥的各種機(jī)制將有助于改善胰腺癌治療.因此,在這個(gè)領(lǐng)域進(jìn)行全面的臨床研究是有必要的.