吳德俊 徐安軍 余 波

（1上海市浦東醫(yī)院-復旦大學附屬浦東醫(yī)院胃腸外科，2血管外科 上海 201399；3上海市血管病變調(diào)控與重塑重點實驗室 上海 201399；4復旦大學附屬華山醫(yī)院血管外科 上海 200040）

結(jié)腸癌是嚴重威脅人類生命健康的疾病。根據(jù)2020年數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)約有110萬人被診斷為結(jié)腸癌，是第四大常見腫瘤，全年約57萬人因其死亡［1］。中晚期結(jié)腸癌的治療方式包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療在內(nèi)的綜合治療。但是，因早期結(jié)腸腫瘤狀不明顯，發(fā)現(xiàn)困難，我國大部分結(jié)腸癌患者初診時已經(jīng)處于中晚期。外科手術(shù)和放化療等治療方式盡管能在一定程度上消滅腫瘤、遏制進展，但是腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍然很高，是結(jié)腸癌治療的難點［2］。因此，闡明結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，篩選出與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的指標用于指導臨床治療和預測疾病預后，對結(jié)腸癌診治意義重大。

CST6基因位于染色體11q13［3］，其所編碼的蛋白是半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatin 6（CST6）（又名cystatin M/E）［4］，屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族（Cystatins）成員。研究表明表明CST6編碼的蛋白cystatin M/E在多種腫瘤進展中具有不同的功能效應［5］。在黑色素瘤、宮頸癌、腦癌、前列腺癌、胃癌和腎癌中產(chǎn)生抑癌作用，因此被認為是具有預后意義的生物標志物。同時，在口腔癌［6］、胰腺癌［7］、甲狀腺癌［8］和肝癌［9］中，發(fā)現(xiàn)CST6具有腫瘤促進作用。但是CST6在結(jié)腸癌中的表達及其與結(jié)腸癌患者的預后關(guān)系尚不清楚。

本研究利用腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Altas，TCGA），分析CST6在正常結(jié)腸上皮和結(jié)腸癌中的表達差異，并探討其表達高低與結(jié)腸預后的關(guān)系。同時，采用基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），探究CST6在腸癌中可能影響的信號通路及相關(guān)分子，并進一步在臨床結(jié)腸癌樣本中通過免疫組化方法進行驗證。旨在探索CST6在結(jié)腸癌中的作用及作為結(jié)腸癌預后的新型標記物的可能性。

資料和方法

公共數(shù)據(jù)獲取與差異分析可開放獲取的結(jié)腸癌患者數(shù)據(jù)從TCGA中下載，包括41個正常樣本473個腫瘤樣本的轉(zhuǎn)錄譜及臨床數(shù)據(jù)。TCGA數(shù)據(jù)庫是由美國國家腫瘤研究所（National Cancer Institute，NCI）和國家人類基因組研究所（National Human Genome Research Institute，NHGRI）合作建立的腫瘤研究項目，通過收集整理腫瘤相關(guān)的各種組學數(shù)據(jù)，提供了一個大型的免費的腫瘤研究參考數(shù)據(jù)庫。在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載FPKM格式轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)并使用perl語言整理成表達矩陣。使用參考基因組文件GRCh38.gtf進行探針注釋。使用limma進行數(shù)據(jù)標準化?；颊吲R床數(shù)據(jù)通過TCGA-GDC下載xml格式數(shù)據(jù)后使用perl語言整理，包括患者的預后信息、年齡、臨床分期等。KM曲線生存分析使用R語言的Survival包進行。

基因集富集分析GSEA是由Broad Institute研究所提出的一種富集方法。其不需要指定明確的差異基因閾值，根據(jù)實際數(shù)據(jù)的整體趨勢，在表達譜的整體層次上對不同分組的生物學通路進行富集?；贖allmark癌通路基因集合，對高CST6和低CST6樣本的表達譜進行了GSEA通路富集。

組織樣本回顧性收集復旦大學附屬浦東醫(yī)院2021年1—12月的結(jié)腸癌組織手術(shù)標本45例，患者術(shù)前均未接受過化療或放療。組織標本均為我院病理科提供的石蠟標本，且均由病理科醫(yī)師做出診斷。研究獲得復旦大學附屬浦東醫(yī)院倫理委員會批準（倫理批號：2020WZ-018）。所有患者均在術(shù)前簽署知情同意書，同意將個人的臨床、病理資料和手術(shù)標本用于科學研究。

免疫組織化學染色將組織芯片置于二甲苯中脫蠟，并經(jīng)無水乙醇、85%和75%乙醇梯度水化。組織切片放入檸檬酸抗原修復緩沖液（pH=6.0）中煮沸，進行抗原修復。之后放入3%雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再以3% BSA行血清封閉。CST6一抗（美國Proteintech公司，17076-1-AP，濃度1∶100）、PDGFR一 抗（美 國Abcam公 司 ，ab32570，濃度1∶400）及E-Cadhein一抗（美國CST公司，3195，濃度1∶400）4℃孵育過夜。再滴加適量辣根過氧化物酶標二抗聚合物，室溫孵育50 min。后DAB顯色、蘇木精復染、脫水封片。利用自動掃描顯微鏡和圖像采集分析系統(tǒng)拍攝免疫組化染色照片。讀片由病理科醫(yī)師獨立完成，讀片前后均不告知患者的任何信息，讀片標準為：（1）目的蛋白染色陽性定義為≥5%腫瘤細胞的胞質(zhì)內(nèi)可見棕褐色染色；（2）染色強度評分計0～3分，0分為陰性，1分為弱陽性，2分為中度陽性，3分為強陽性；（3）染色范圍評分計0～4分，0分為＜5%，1分為5%～24%，2分為25%～49%，3分為50%～74%，4分為75%～100%。最后綜合表達評分（composite expression score，CES）為染色強度評分×染色范圍評分。

統(tǒng)計學分析所有的統(tǒng)計分析均在R語言、SPSS 19.0和GraphPad Prism 8中完成。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用Student’st檢驗比較差異。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用Wilcoxon秩和檢驗。兩連續(xù)性變量相關(guān)性使用Pearson檢驗計算相關(guān)系數(shù)。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

CST6在結(jié)腸癌中的表達首先在結(jié)腸癌患者癌組織和正常結(jié)腸上皮組織中探究CST的表達情況。選取TCGA數(shù)據(jù)庫中包括41個正常和473個腫瘤樣本的轉(zhuǎn)錄譜及臨床數(shù)據(jù)進行研究，我們發(fā)現(xiàn)CST6在結(jié)腸癌組織中的表達顯著高于正常結(jié)腸上皮組織（圖1A）。進一步對比CST6在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌和無轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌的表達情況，選取的數(shù)據(jù)集包含了61例明確存在轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌和330例明確無轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者的表達數(shù)據(jù)，結(jié)果表明CST6在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中的表達顯著高于無轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織，提示結(jié)腸癌中CST6可能作為一種癌基因影響著結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展（圖1B）。

圖1 CST6在TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)腸癌樣本中的表達Fig 1 The expression of CST6 in colon cancer samples of TCGA

CST6表達與結(jié)腸癌預后的關(guān)系為進一步明確CST6在結(jié)腸癌中的作用，我們對CST6不同表達的結(jié)腸癌患者進行了生存分析，包括總生存（overall survival，OS）、疾 病 特 異 性 生 存（disease specific survival，DSS）以 及 無 進 展 生 存（progress free survival，PFS）。結(jié)果表明，相比較于CST6低表達水平的患者，CST6高表達的患者具有更差的DSS（HR=1.63；95%CI：1.02～2.70；P=0.043；最 高229例，最低228例）。然而，結(jié)腸癌組織中CST6的高表達并未能顯著影響OS及PFS（P＞0.05，圖2A～C）。上述結(jié)果表明，CST6能夠影響結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移過程。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫樣本中CST6表達高低與結(jié)腸癌患者OS、DSS和PFS的關(guān)系Fig 2 The association of CST6 expression with the survival of patients with colon cancer in TCGA samples

CST6相關(guān)信號通路分析為探究CST6在結(jié)腸癌中的作用機制，我們進而對CST6不同表達的結(jié)腸癌患者進行了基于Hallmark基因集的GSEA分析，結(jié)果表明，CST6影響的通路主要富集在結(jié)腸癌血管生成和上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化信號通路（圖3）。這兩個通路在促進結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要作用。分子相關(guān)性結(jié)果表明CST6和調(diào)控血管生成的關(guān)鍵分子血小板衍生生長因子受體（plateletderived growth factor receptor，PDGFR）存在顯著正相關(guān)（圖4A），而與VEFGR無顯著相關(guān)性（圖4B），提示CST6可能參與調(diào)控PDGFR的表達，進而影響血管生成過程促進結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。對于上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化信號通路，我們發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中CST6與上皮標志物E-Cadherin無顯著相關(guān)性（圖4C），但與間質(zhì)標志物N-Cadherin及Vimentin表達呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)（圖4D、E），提示CST6可能參與調(diào)NCadherin及Vimentin的表達，進而影響上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化信號促進結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。

圖3 GSEA分析CST6低表達和CST6高表達的結(jié)腸癌組織間基因富集差異Fig 3 GSEA between cancers with high CST6 expression and cancers with low CST6 expression

圖4 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)腸癌中CST6與血管生成分子及上皮-間質(zhì)標志物表達的相關(guān)性Fig 4 Database analysis of the correlation between CST6 and the expression of angiogenesis-related factors and epithelial-mesenchymal transition markers in colon cancer

CST6相關(guān)信號分子驗證為進一步在人腸癌組織中驗證CST6的表達，及其與PDGFR和NCadherin表達的相關(guān)性，我們?nèi)?5例本院結(jié)腸癌患者臨床樣本進行免疫組化檢測及定量分析。結(jié)果表明，CST6在結(jié)腸癌組織中表達顯著升高，高于配對癌旁組織（P＜0.05，圖5A、B），與圖1中的TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)論一致。結(jié)腸癌組織中CST6、PDGFR、N-Cadherin均呈現(xiàn)較高表達（圖5A）；采用Spearman相關(guān)性分析顯示，CST6表達與PDGFR表達呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性（r=0.604 1，P＜0.001，圖5C），同時CST6表達與N-Cadherin表達也呈正相關(guān)（r=0.629 8，P＜0.001，圖5D），進一步證實了上述數(shù)據(jù)庫生信分析的結(jié)論。

圖5 臨床腸癌組織樣本中驗證CST6的表達及其與和PDGFR和N-Cadherin表達的相關(guān)性Fig 5 The validation of CST6 expression and its correlation with PDGFR and N-Cadherin level in clinical colon cancer tissue samples

討 論

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合GSEA分析發(fā)現(xiàn)CST6在結(jié)腸癌組織中的表達明顯高于正常結(jié)腸上皮；與CST6低表達的結(jié)腸癌患者相比，CST6高表達的結(jié)腸癌患者預后較差，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移；CST6在結(jié)腸癌組織中的高表達與血管生成及EMT信號通路顯著相關(guān)；CST6和血管生成相關(guān)信號分子PDGFR及間質(zhì)標志物N-Cadherin的表達呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性，可能通過PDGFR調(diào)控腫瘤的血管生成及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進而影響腸癌侵襲轉(zhuǎn)移。

CST6基因首先是從轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞中分離出來的，人類的完整序列CST6基因最早由Zeuween等［10］鑒定出來。CST6可能參與多種分子機制，對不同類型的腫瘤有不同的作用機制。對乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)浸潤性導管癌中CST6表達的cystatin M/E蛋白水平表達降低或缺失明顯，正常乳腺上皮細胞中主要定位于細胞質(zhì)的cystatin M/E，在浸潤性導管癌組織中幾乎無陽性著色；并且cystatin M/E可顯著抑制乳腺癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力［11］。CST6在嗜骨乳腺癌細胞和腫瘤樣本中下調(diào)。功能分析證實CST6在腫瘤侵襲和乳腺骨轉(zhuǎn)移中具有抑制作用［12］。CST6在非小細胞肺癌中表達降低，而高表達CST6可以抑制非小細胞肺癌細胞在體外培養(yǎng)中的生長［13］。在原發(fā)性宮頸腫瘤中存在CST6失活導致的cystatin M/E表達缺失，提示CST6是一種宮頸癌抑制因子［14］?？赡芘cNF-κB信號通路調(diào)控及其核表達有關(guān)［15］。腦惡性膠質(zhì)瘤中啟動子甲基化完全阻礙了膠質(zhì)瘤起始細胞CST6的表達，而cystatin M/E的異常高表達降低了起始細胞CST6的能動性和侵襲性［16］。前列腺癌中，啟動子組蛋白修飾導致CST6下調(diào)，參與了前列腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移期的進展［17］。對胃癌及其相鄰非腫瘤組織中CST6甲基化狀態(tài)的分析顯示，由于啟動子高甲基化，胃癌中CST6表達缺失。此外，CST6高甲基化患者的生存時間明顯短于啟動子低甲基化患者［18］。

除了其傳統(tǒng)的抑瘤作用外，CST6也可能起到抑瘤作用腫瘤促進效應。在三陰性乳腺癌中，CST6表達升高，且與高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險和低無病生存率相關(guān)，提示其可能是腫瘤促進分子［19］。對來自口咽鱗狀細胞癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的細胞株的分析表明，CST6在轉(zhuǎn)移灶中的表達比原發(fā)灶高40倍。CST6的上調(diào)可能通過阻斷固有的組織蛋白酶B的活性，從TNF-α誘導的凋亡中拯救腫瘤細胞而促進轉(zhuǎn)移［20］。在胰腺導管腺癌中，CST6可能通過抑制細胞內(nèi)促凋亡的組織蛋白酶B參與胰腺癌的增殖和生存，并可能是胰腺腫瘤的啟動子［21］。甲狀腺乳頭狀癌中，CST6可能位于BRAF/MEK細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路的下游［22］。此外，CST6也與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。生存分析顯示，CST6可以作為乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌患者的預后標志物，CST6的高表達與患者的低生存率相關(guān)［23］。

我們的研究證實了CST6在結(jié)腸癌組織中呈高表達，高表達CST6的結(jié)腸癌患者預后差，提示其可能在結(jié)腸癌中發(fā)揮促癌基因的作用，并可能成為預測結(jié)腸癌患者預后的潛在分子標記物。在上述研究基礎(chǔ)上，我們還探索了與CST6表達相關(guān)的潛在信號通路。發(fā)現(xiàn)CST6高表達的結(jié)腸癌患者中，EMT和血管生成通路被顯著激活；結(jié)腸癌組織中CST6和PDGFR及N-Cadherin表達呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性。

既往文獻已經(jīng)證實，結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與EMT和腫瘤血管生成密切相關(guān)。Yi等［24］綜合多組學分析發(fā)現(xiàn)，RUNX2通過與EMT相關(guān)的啟動子和/或潛在的增強子結(jié)合可以促進結(jié)腸癌的EMT效應，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移、干細胞化和治療抗性。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中，WNT2在腫瘤相關(guān)成纖維細胞中選擇性升高，并通過調(diào)控促血管生成功能相關(guān)蛋白的升高，促進血管生成信號，從而促進腫瘤的進展［25］。Xu等［26］研究了CST6在多種腫瘤類型中的表達模式，發(fā)現(xiàn)CST6表達與上皮細胞浸潤參與EMT和增殖呈正相關(guān)。這與我們的研究結(jié)果相符。但是，探究結(jié)腸癌中CST6與血管生成的相關(guān)性，卻未見報道。

PDGFR是PDGFs／PDGFRs信號轉(zhuǎn)導 途 徑 中的重要成員，為一種單鏈跨膜糖蛋白，屬于III型酪氨酸蛋白激酶家族，分布于人體組織，如平滑肌細胞SMC、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞核軟骨細胞等。研究表明，在結(jié)腸癌發(fā)展中，PDGFs／PDGFRs能促進腫瘤血管生成，促進腫瘤的進展［27］。我們發(fā) 現(xiàn) ，結(jié) 腸 癌組織中CST6與PDGFR呈現(xiàn)正相關(guān)，但是，CST6是否可以通過影響PDGFs／PDGFRs通路調(diào)控結(jié)腸癌的惡性進展，有待分子生物學實驗進一步證實，這是本研究不足之處。此外，對于CST6在結(jié)腸癌預后中的作用，本研究目前僅通過TCGA數(shù)據(jù)庫的樣本進行研究，未進一步在本院臨床樣本中進行生存分析的研究及驗證，也是今后需要完善的內(nèi)容。

本研究證實CST6是預測結(jié)腸癌預后的一個潛在分子標記物。未來可在細胞水平和動物實驗中進一步探索CST6的結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的功能和潛在分子機制。

作者貢獻聲明吳德俊 數(shù)據(jù)采集，論文撰寫和修訂。徐安軍 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。余波 論文構(gòu)思和修訂論文。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。