圖拉妮薩·喀迪爾 羅杰 廖師師 孟慶濤

武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北武漢 430060

小腸缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是由小腸扭轉(zhuǎn)、絞窄型腸梗阻、急性腸系膜缺血、小腸移植、潛在失血性休克、嚴(yán)重創(chuàng)傷、敗血癥等引起的外科急癥。IRI 時(shí)可引起一系列病理生理變化，如自由基生成增多、膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）打開(kāi)、線粒體分裂、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞等，這些病理生理過(guò)程導(dǎo)致腸黏膜屏障受損致使細(xì)菌和內(nèi)毒素從消化道入血，刺激中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)和氧化因子，形成炎癥風(fēng)暴，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），甚至引起多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），最終死亡。缺氧時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）作為轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）、糖酵解酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和其他靶基因的表達(dá)以恢復(fù)血液循環(huán)，促進(jìn)血管生成和血管重構(gòu)，減輕炎性反應(yīng)，調(diào)控能量代謝以改善組織氧合和細(xì)胞在低氧環(huán)境中的生存，從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞存活、對(duì)抗炎癥、抑制凋亡的保護(hù)作用。HIF-1α 對(duì)保護(hù)腸道免受IRI 至關(guān)重要。因此，調(diào)控HIF-1α 及其下游靶基因的表達(dá)有助于減輕缺血性損傷。本文針對(duì)HIF-1α 在IRI 中的作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 缺氧誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)錄因子家族

1.1 HIF 結(jié)構(gòu)

HIF 是堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）蛋白轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員，由氧敏感的α-亞基（HIF-α）和組成性表達(dá)的β-亞基（HIF-β）組成。缺氧調(diào)節(jié)的亞基HIF-α 在哺乳動(dòng)物中存在三種亞型（HIF-1α，HIF-2α 和HIF-3α）。組成性表達(dá)的β 亞基（HIF-1β，HIF-2β 和HIF-3β）不受氧含量的影響。HIF-1α 幾乎存在于所有的細(xì)胞內(nèi)，其表達(dá)受到氧狀態(tài)的調(diào)控，而HIF-1β 基本上是持續(xù)表達(dá)，HIF-1α 與HIF-1β 結(jié)合形成二聚體后發(fā)揮生物學(xué)功能。

1.2 HIF 表達(dá)調(diào)控及功能

HIF 的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄受2-氧戊二酸依賴的雙加氧酶家族調(diào)控，該家族包括脯氨酸羥化酶（proline hydroxylase domain，PHD）和天冬酰胺羥化酶即缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子（factor inhibiting HIF，F(xiàn)IH）。在正常氧濃度條件下，PHD 利用氧、2-氧戊二酸、鐵（Fe）和抗壞血酸作為輔助因子，在脯氨酸殘基上羥基化HIF-1α，羥基化的HIF-1α 被腫瘤抑制因子復(fù)合物蛋白酶體降解。

除了受PHD 的負(fù)調(diào)節(jié)外，HIF 的激活還受FIH調(diào)控。與PHD 類似，F(xiàn)IH 也能感知氧濃度的變化，促使C-TAD 處的HIF-1 天冬酰胺803 殘基羥基化，并阻止其與轉(zhuǎn)錄輔助激活因子cbp/p300 結(jié)合，降低HIF 的轉(zhuǎn)錄活性。

在缺氧條件下，氧氣在線粒體氧化磷酸化過(guò)程中被消耗，使PHD 活性降低，F(xiàn)IH 的催化活性也受到抑制，促使HIF-α 在胞質(zhì)中積累，并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，與HIF-1β 二聚。HIF-α 與HIF-1β 在細(xì)胞核二聚化后形成復(fù)合體，該復(fù)合體與cbp/p300 共激活因子相互作用，與啟動(dòng)子區(qū)域中缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，并激活基因轉(zhuǎn)錄。受HIF 調(diào)控的缺氧細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制適應(yīng)缺氧，對(duì)抗應(yīng)激。

作為缺氧適應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，HIF 以組織特異性的方式調(diào)節(jié)500 多個(gè)具有多種生物學(xué)功能的人類基因，如VEGF、EPO、內(nèi)皮素、熱激蛋白90、一氧化氮合酶、凋亡/細(xì)胞周期阻滯等基因。缺氧條件下，HIF 優(yōu)先誘導(dǎo)糖酵解酶和丙酮酸脫氫酶表達(dá)，從而減輕缺氧給組織帶來(lái)的損傷，促進(jìn)血管生成，組織修復(fù)再生，其與活性氧（reactive oxygen species，ROS）之間有密切而復(fù)雜的聯(lián)系，除此之外HIF 與免疫、炎癥、代謝性疾病、缺血性疾病也有緊密聯(lián)系。

2 小腸缺血再灌注損傷與缺氧誘導(dǎo)因子

2.1 HIF 在小腸IRI 中的抗氧化作用

IRI 發(fā)生在器官的血液供應(yīng)中斷（缺血），然后重新建立血供（再灌注）時(shí)，導(dǎo)致線粒體ROS 的“暴發(fā)”。在缺血期間，能量代謝從脂肪酸氧化轉(zhuǎn)換到糖酵解，使組織維持細(xì)胞活力的時(shí)間延長(zhǎng)。再灌注過(guò)程中，線粒體不僅產(chǎn)生高水平的ROS，影響DNA 氧化并誘導(dǎo)促凋亡途徑，且打開(kāi)MPTP，進(jìn)一步促進(jìn)ROS 生成，形成惡性循環(huán)，稱為ROS 誘導(dǎo)ROS 釋放（ROS-induced ROS release，RIRR）?？赏ㄟ^(guò)恢復(fù)pH 和鈣超載來(lái)維持MPTP 的狀態(tài)，但其會(huì)增加溶質(zhì)的滲透性，導(dǎo)致線粒體膜電位的崩潰和破壞。RIRR的破壞作用協(xié)同增加缺血后的氧化應(yīng)激。

腸道是食物消化和吸收的主要場(chǎng)所，其主要依賴基底外側(cè)的Na/K-ATP 酶的驅(qū)動(dòng)作用，因此腸上皮具有較高的能量需求，對(duì)血流減少也很敏感。當(dāng)發(fā)生腸缺血時(shí)，首先影響絨毛尖端和結(jié)腸表面的上皮細(xì)胞。隨著缺血持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，小腸絨毛尖端腸腔的細(xì)胞和結(jié)腸隱窩表面上皮最先失去與基底膜的連接，并逐漸喪失向隱窩基底延伸的細(xì)胞。長(zhǎng)時(shí)間的缺血，促使錨定在一起的緊密連接破裂，導(dǎo)致上皮細(xì)胞從基底膜中分離出來(lái)，進(jìn)入腸腔。腸道缺血性損傷后，再灌注誘導(dǎo)氧氣流入，從而導(dǎo)致ROS過(guò)度產(chǎn)生。IRI 通過(guò)激活腸上皮細(xì)胞、多形核中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)ROS 產(chǎn)生，使炎癥進(jìn)一步惡化。由此可見(jiàn)腸IRI 過(guò)程中多種反應(yīng)均可引起ROS 的產(chǎn)生，選擇性地減弱與疾病相關(guān)的ROS 形成已成為IRI 治療的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

2019年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Gregg L.Semenza詳細(xì)描述了HIF 在缺氧條件下維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的機(jī)制。HIF-1 通過(guò)調(diào)節(jié)乙酰輔酶A 合成抑制ROS 的產(chǎn)生，缺氧條件下，HIF 通過(guò)激活丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1)和乳酸脫氫酶A（lactic acid dehydrogenase A，LDHA），將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，阻止丙酮酸向乙酰輔酶A 的轉(zhuǎn)化。HIF-1 還可通過(guò)降低脂肪酸氧化，從而減少乙酰輔酶A 的合成。

HIF 通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體蛋白和自噬來(lái)抑制ROS 的產(chǎn)生。缺氧條件下HIF-1 誘導(dǎo)Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相關(guān)蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B19kD interacting protein 3，BNIP3）和編碼微RNA（microRNA，miR）的基因表達(dá)，BNIP3 與Beclin-1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Bcl-2，釋放Beclin-1 誘導(dǎo)線粒體自噬。作為代謝適應(yīng)性反應(yīng)，線粒體自噬促進(jìn)細(xì)胞在長(zhǎng)期缺氧條件下的存活，從而減少線粒體ROS 的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。

HIF 通過(guò)調(diào)節(jié)缺氧細(xì)胞的抗氧化防御抑制ROS的產(chǎn)生。在缺氧條件下，HIF 增加葡萄糖到絲氨酸的轉(zhuǎn)化和線粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的產(chǎn)生，將谷胱甘肽從氧化形式轉(zhuǎn)化為還原形式以防止電子傳遞鏈產(chǎn)生的ROS 增加。

由于ROS 的生成在IRI 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，抗氧化已成為缺血性疾病治療的首要目標(biāo)。ROS作為IRI 的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，值得深入研究。

2.2 HIF 與炎癥

缺血再灌注時(shí)中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被激活，并聚集到缺血缺氧的組織部位釋放多種介質(zhì)[腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1），血管緊張素Ⅱ，血小板活化因子和白三烯-4]促進(jìn)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附，黏附的白細(xì)胞遷移到組織中破壞微血管屏障，導(dǎo)致細(xì)胞水腫，甚至凋亡。白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是缺血再灌注引起組織損傷和功能障礙的早期跡象，可導(dǎo)致微血管并發(fā)癥和組織損傷。

在炎癥的刺激下，HIF 通路被激活并通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗炎作用。研究表明，核因子κB（nuclear factor Kappa B，NF-κB）是在缺氧條件下HIF-1α 表達(dá)的直接調(diào)節(jié)劑。長(zhǎng)時(shí)間缺血產(chǎn)生的ROS 激活NF-κB 通路，導(dǎo)致HIF-1α 基因啟動(dòng)子和HIF-1α mRNA 增加。NF-κB 也可以直接上調(diào)HIF-1β，促進(jìn)HIF-1α 與HIF-1β 二聚發(fā)揮生物學(xué)功能。

缺氧和炎癥導(dǎo)致NF-κB 和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ 活性增加，該蛋白與HIF-1α 啟動(dòng)子結(jié)合并調(diào)節(jié)HIF-1α 信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性細(xì)胞因子分泌。炎性細(xì)胞因子還可通過(guò)P38 絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK）和磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）磷酸化上調(diào)HIF-1α。此外，炎性細(xì)胞因子TNF-α誘導(dǎo)VHL-HIF-1α 相互作用，并通過(guò)NF-κB 依賴性途徑增加HIF-1α 積累。反之，HIF-1α 通過(guò)觸發(fā)NF-κB 相關(guān)的細(xì)胞炎癥和抑制細(xì)胞凋亡來(lái)增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞存活。

HIF 也可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2 家族基因，與p53 相互作用，靶向線粒體酶抑制炎癥以減少細(xì)胞死亡。因此，炎癥和缺氧之間的相互作用在感染、無(wú)菌炎癥、缺血性損傷中具有重要意義。

2.3 HIF 與能量代謝

缺氧和三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物會(huì)抑制PHD 活性，從而穩(wěn)定HIF 蛋白活性，促使蛋白與共激活因子發(fā)生相互作用，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄。HIF 通過(guò)參與糖酵解、脂肪酸氧化、線粒體和過(guò)氧化物酶體代謝在能量代謝中發(fā)揮重要作用。

在低氧條件下，細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)參與能量代謝基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)缺氧應(yīng)激。低氧時(shí)，HIF 復(fù)合物與DNA 結(jié)合以啟動(dòng)HIF 靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物減少氧化磷酸化，促進(jìn)糖酵解從而影響線粒體代謝。低氧也可以通過(guò)調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物（如α-酮戊二酸和琥珀酸）的濃度直接影響線粒體代謝。除了在三羧酸循環(huán)中的作用外，琥珀酸還作為α-酮戊二酸依賴性PHD 羥基化反應(yīng)的副產(chǎn)物調(diào)節(jié)PHD 活性和HIF 穩(wěn)定性。

在缺氧期間，由于電子傳遞鏈中斷，氧化還原狀態(tài)受到干擾，也會(huì)產(chǎn)生ROS，HIF-1α 通過(guò)限制三羧酸循環(huán)和上調(diào)線粒體蛋白PDK1 和BNIP3 以減輕ROS 對(duì)細(xì)胞的毒性。

2.4 HIF 與miR 之間的關(guān)系

miR 是非蛋白質(zhì)編碼RNA 分子，通過(guò)與信使RNA 的3′UTR 結(jié)合以控制信使RNA 的穩(wěn)定性和翻譯，從而降低蛋白質(zhì)水平。缺氧相關(guān)miR 在細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激中具有關(guān)鍵作用。HIF 結(jié)合位點(diǎn)位于缺氧相關(guān)miR 啟動(dòng)子區(qū)域，通過(guò)調(diào)節(jié)缺氧反應(yīng)基因和缺氧相關(guān)miR 調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

缺血再灌注誘導(dǎo)腸道m(xù)iR 表達(dá)水平發(fā)生改變，提示miR 在IRI 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。miR 表達(dá)變化與潛在IRI 中的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、自噬、炎癥和上皮屏障功能障礙密切相關(guān)。一方面，在IRI 后一些miR 上調(diào)。如miR-146 上調(diào)可減少各細(xì)胞系中Toll 樣受體4（Toll-like receptor，TLR4）、白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK），顯著降低上皮細(xì)胞凋亡和組織損傷。當(dāng)腸上皮細(xì)胞缺氧時(shí)，TLR4 和IRAK 表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致固有免疫反應(yīng)激活，NF-κB 活性增強(qiáng)，促進(jìn)炎癥因子釋放及細(xì)胞凋亡，而miR-146 可以降低TLR4 水平并減少I(mǎi)RAK 積累，減少細(xì)胞凋亡和組織損傷，減輕免疫反應(yīng)，從而保護(hù)腸上皮細(xì)胞免于凋亡。IRI 時(shí)miR-21、miR-351、miR-381、miR-6682、miR-34a 等多種miR 上調(diào)超過(guò)2 倍。這些上調(diào)的miR通過(guò)多種途徑影響氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和引起炎癥。另一方面，多種miR 在IRI 后下調(diào)。如miR-29b-3p表達(dá)水平在體內(nèi)和體外IRI 后均降低，促進(jìn)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（tumor necrosis factor receptorassociated factor 3，TRAF3）表達(dá)，激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α 活化激酶1 磷酸化，從而增加NF-κB、IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平以促進(jìn)炎癥，同時(shí)BAX 表達(dá)上調(diào)，Bcl-2 表達(dá)下調(diào)觸發(fā)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步促進(jìn)腸損傷。miR 的研究為開(kāi)發(fā)預(yù)防和治療IRI 的創(chuàng)新藥物提供一種新思路。

3 小腸IRI中缺氧誘導(dǎo)因子的治療靶點(diǎn)及作用

鑒于HIF 的多效性，考慮利用HIF 治療IRI 是非常有前途的一種方法。目前，HIF 激活劑主要用于正常氧濃度下穩(wěn)定HIF 表達(dá)。

HIF-1 抑制劑分為直接抑制劑和間接抑制劑。直接抑制劑更具特異性，可直接影響HIF-1α/HIF-1β二聚化、HIF-1α/DNA 結(jié)合、HIF-1α-p300 相互作用或與其他重要蛋白質(zhì)的相互作用。但直接抑制劑一般為肽類，不能口服使用，且代謝不太穩(wěn)定，故而不適用于臨床。間接抑制劑通過(guò)與其他靶點(diǎn)的直接相互作用影響HIF-1α 翻譯、穩(wěn)定和降解。目前使用的大多數(shù)小分子HIF-1α 抑制劑是間接抑制劑。

3.1 HIF 在缺血預(yù)處理中的應(yīng)用

缺血預(yù)處理是指在組織長(zhǎng)時(shí)間缺血前對(duì)其進(jìn)行短暫、重復(fù)的缺血和再灌注，是一種內(nèi)源性的對(duì)器官隨后出現(xiàn)持續(xù)性缺血損傷的保護(hù)措施。HIF-1α 通過(guò)誘導(dǎo)CD73 表達(dá)、增加腺苷和腺苷A2b 受體水平，可模擬缺血預(yù)處理的作用。目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的化合物中，大多數(shù)是通過(guò)小分子脯氨酸羥化酶抑制劑（prolyl hydroxylase inhibitor，PHI）抑制二甲基乙二?；拾彼幔╠imethyloxalylglycine，DMOG）依賴的羥化酶家族活性來(lái)調(diào)節(jié)HIF 的誘導(dǎo)和積累，即在缺血前給予DMOG 類似物激活HIF 通路，增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞促血管新生能力，并防止隨后缺血發(fā)作造成的組織損傷。

3.2 HIF 在缺血后處理中的應(yīng)用

多項(xiàng)研究表明HIF 在缺血后處理中也有一定作用。在臨床實(shí)際中，各種缺血性疾病難以預(yù)測(cè)，患者多在缺血發(fā)作期間來(lái)院就診，因此，與缺血預(yù)處理相比，缺血后處理更具有臨床價(jià)值。在缺血后給予DMOG 類似物可保護(hù)組織免受缺血損傷，其機(jī)制與減少ROS 形成、抑制caspase-3 活性、激活EPO和VEGF，從而增加毛細(xì)血管密度，減輕缺血性損傷有關(guān)，可改善患者預(yù)后。有趣的是，一種臨床上常用的吸入麻醉劑七氟醚，可通過(guò)增加HIF1-α 和減少caspase-3，而起到缺血后處理的作用。

3.3 HIF-1α 與腸IRI 的其他研究

隨著對(duì)IRI 相關(guān)機(jī)制和HIF-1α 及其下游基因的不斷研究，除以上提到DMOG 類似物外，還有其他PHI 被廣泛用作PHD 抑制劑和HIF 激活劑，如鐵離子螯合劑去鐵胺可激活離體細(xì)胞和體內(nèi)的HIF；醋酸酯對(duì)PHD-2 的高親和力可應(yīng)用于急性缺血性模型。PHI GSK360A 可穩(wěn)定HIF-1，增加HIF-1 靶基因PDK1和己糖激酶Ⅱ表達(dá)，并將細(xì)胞代謝重新編程為有氧糖酵解，從而減少I(mǎi)RI 期間ROS 生成和MPTP 開(kāi)放。然而，大多數(shù)PHI 可抑制2-氧戊二酸依賴的雙加氧酶，但對(duì)HIF、PHD 卻是非選擇性的。因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)HIF、PHD 的特異性PHI 有待進(jìn)一步研究。

此外，在預(yù)處理治療中，低水平的氧化劑可能有一定保護(hù)作用，但高水平的ROS 則被認(rèn)為是有害的，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。雖然ROS 在IRI 中起重要作用，但抗氧化療法不能預(yù)防相關(guān)疾病。因此，在不改變生理性ROS 的條件下，開(kāi)發(fā)選擇性地減弱與疾病相關(guān)ROS形成的抗氧化劑可對(duì)ROS介導(dǎo)的組織損傷和炎癥有所幫助。

4 總結(jié)與展望

細(xì)胞在缺血缺氧情況下的適應(yīng)性反應(yīng)的潛在機(jī)制十分復(fù)雜，HIF 作為氧敏感轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮重要作用。HIF 在IRI 時(shí)與炎癥、氧化應(yīng)激、能量代謝、細(xì)胞凋亡、上皮細(xì)胞屏障功能障礙、轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在相關(guān)性，缺氧靶向低氧信號(hào)通路在小腸IRI 中具有治療潛力，為HIF 治療IRI 提供了新的機(jī)會(huì)。針對(duì)HIF靶向治療缺血性疾病已有一定的進(jìn)展，深入研究其在疾病病理生理學(xué)及其與缺氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系，對(duì)缺血相關(guān)疾病的預(yù)防和治療具有重大意義。