李 展，張愛瓊，羅師紅

(畢節(jié)市動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 畢節(jié) 551700)

0 引言

布魯氏菌病是由布魯氏桿菌引起的人畜共患慢性傳染病。多種動物對本病均有易感性，其中以牛、羊最為常見。其臨床特點(diǎn)是引起動物不孕、流產(chǎn)、睪丸炎及關(guān)節(jié)炎等癥狀。懷孕母牛常見為產(chǎn)死胎、弱胎或常于妊娠6～8個月發(fā)生流產(chǎn)、出現(xiàn)胎衣滯留及子宮內(nèi)膜炎等癥狀；公牛主要表現(xiàn)為睪丸和副睪炎等。 人一般通過接觸患病動物的羊水、胎衣或受污染的動物產(chǎn)品而感染，主要傳播途徑為皮膚黏膜、消化道和呼吸道等。全球每年發(fā)病人數(shù)超過50萬[1]，臨床癥狀主要以出現(xiàn)乏力、波浪熱、出汗、關(guān)節(jié)疼痛及睪丸炎等，也可因布魯氏桿菌損害到相應(yīng)的臟器，而出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀。該病嚴(yán)重影響著養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展及從業(yè)人員的身心健康。

布病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括分子生物學(xué)方法、血清學(xué)方法及細(xì)菌培養(yǎng)等。分子生物學(xué)的方法因?yàn)樾枰獙I(yè)儀器，試劑成本比較高，不適合在養(yǎng)殖場推廣；細(xì)菌培養(yǎng)法比較復(fù)雜，且檢出率也不高，不適合早期快速診斷。因此，布病臨床上的診斷方法以血清學(xué)為主。布魯氏桿菌侵入機(jī)體后不斷刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，因此檢測血清抗體對診斷病情具有重要意義[2]。

目前有多種血清學(xué)檢測方法，主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)(Rose Bengal Plate Test，RBT) 、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Competitive Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，cELISA) 、試管凝集試驗(yàn)(Serun Agglutination Test，SAT) 、 膠體金(GICA) 、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)等。就129份牛血清樣本，采用 RBT、SAT以及cELISA 3種實(shí)驗(yàn)方法對血清樣本進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，旨在討論不同的檢測方法在實(shí)際工作中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

牛血清樣本來源于XX牛場，該牛購自于Y省，購入后未免疫布病疫苗。

1.2 試劑

檢測所用的虎紅平板凝集抗原、試管凝集抗原和陽性血清試劑盒購置于哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司，布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒由武漢科前生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)，試劑批號均在有效期范圍內(nèi)。

1.3 方法

1.3.1 RBT試驗(yàn)

在生物安全柜內(nèi)，在干燥潔凈的布病檢測紙板上用移液器加30 μL 的待檢血清，然后取等同量30 μL 的虎紅平板抗原充分混勻，4 min內(nèi)觀察結(jié)果。并以陽性作為對照，出現(xiàn)+以上反應(yīng)者判為陽性。判定標(biāo)準(zhǔn)如下。

++++：出現(xiàn)大的凝集片或顆粒，液體完全透明。

+++：有明顯的凝集顆粒，液體幾乎完全透明。

++：有較明顯的凝集顆粒，液體稍透明。

+：稍能見到凝集，液體混濁。

—：無凝集，液體均勻混濁。

1.3.2 SAT試驗(yàn)

為每一份待檢血清各準(zhǔn)備4只試管，第1管加入960 μL的生理鹽水，第2到第4管各加500 μL的生理鹽水，在第1管中加入40 μL的待檢血清，充分混勻吸取500 μL加入第2管，并充分混勻。如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去500 μL混勻液。稀釋完畢，從第1到第4管的血清稀釋度分別為1:25、1:50、 1:100、1:200，按操作說明將稀釋好的抗原液500 μL分別加入已稀釋好的各管血清中，血清稀釋度則依次變?yōu)?:50、1:100、 1:200、1:400，按照實(shí)驗(yàn)操作說明依次配比好陽性對照、陰性對照、抗原對照及比濁管。將加樣好的試管置于(37℃±1℃)溫箱中孵育18～24 h，檢查結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：凝集反應(yīng)程度根據(jù)參照比濁管來判讀，分別記為“++++”“+++”“++”“+”“—”，按以下說明判定。

++++：菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮。

+++：菌體幾乎完全凝集，上層液體75%清亮。

++：菌體凝集顯著，上層液體50%清亮。

+：有凝集物沉淀，液體25%清亮。

—：無凝集物，液體均勻混濁。

實(shí)驗(yàn)成立條件及結(jié)果：當(dāng)陽性對照血清出現(xiàn)完全凝集(++++)，陰性對照血清無凝集(—)，抗原對照無自凝(—)現(xiàn)象時，實(shí)驗(yàn)成立。對結(jié)果做如下判定，1:100血清稀釋度出現(xiàn)“++”及以上凝集現(xiàn)象時，判為陽性。1:50血清稀釋度出現(xiàn)“++”及以上凝集現(xiàn)象時，判為可疑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可疑的經(jīng)30 d后，重檢，如果仍為可疑，判為陽性。

1.3.3 cELISA試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

成立條件：各對照的測定值在如下的范圍內(nèi)時，試驗(yàn)有效。

無血清空白對照OD450nm0.75～2.0，陽性對照抑制率(PI)80%～100%，陰性對照抑制率(PI)-15%～15%。

判定標(biāo)準(zhǔn)： 計(jì)算樣品抑制率。抑制率(PI)=(空白對照OD450 nm-檢測樣品OD450 nm)/空白對照OD450 nm×100%，抑制率(PI)≥30%判為陽性，抑制率(PI)≤30%判為陰性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用3種檢測方法對129份牛血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示。

1)采用cElisa實(shí)驗(yàn)方法檢測出46份陽性樣品，其余83份為陰性。

2)采用RBT實(shí)驗(yàn)方法初篩檢測出20份陽性樣品，其中17份包含在用cElisa實(shí)驗(yàn)方法檢測出的46份陽性樣品中，3份未包含在用cElisa實(shí)驗(yàn)方法檢測出的46份陽性樣品中。其余109份為陰性。

3)對經(jīng)RBT實(shí)驗(yàn)方法初篩檢測出20份陽性樣品，經(jīng)第一次SAT實(shí)驗(yàn)方法檢測出陽性樣品7份，疑似樣品6份，共計(jì)13份。第二次對疑似的6份樣品1個月后采樣復(fù)檢為陰性，最終為陽性樣品7份。其余經(jīng)SAT實(shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)果為陰性的7份樣品中4份均包含在經(jīng)cElisa實(shí)驗(yàn)方法檢測出的46份陽性樣品中和經(jīng)RBT實(shí)驗(yàn)方法初篩檢測出20份陽性樣品中，其余3份為用虎紅平板初篩為陽性，但用cElisa試驗(yàn)方法和試管凝集方法均檢測結(jié)果為陰性。

4)RBT實(shí)驗(yàn)方法與cElisa實(shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)果陽性符合率為37%(17/46)；SAT實(shí)驗(yàn)方法與RBT實(shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)果陽性符合率為35%(7/20)；SAT實(shí)驗(yàn)方法與cElisa實(shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)果陽性符合率為16.3%(7/43)。

表1 牛布病3種檢測方法結(jié)果

3 分析與討論

該牛場牛只自從Y省購入后未免疫過布病疫苗，從檢測結(jié)果來看，該牛場的牛正在感染布魯氏菌或曾經(jīng)感染過布魯氏菌。通過對3種檢測方法的檢測結(jié)果對比，cELISA實(shí)驗(yàn)方法的陽性檢出率最高，RBT實(shí)驗(yàn)方法的陽性檢出率次之，SAT實(shí)驗(yàn)方法的陽性檢出率最低。虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)，該試劑為酸性環(huán)境，酸性環(huán)境可以抑制血清中的IgM類抗體活性，因此RBT主要是檢測血清中的IgG類抗體，但不排除存在未被抑制完的IgM類抗體[3]。

試管凝集試驗(yàn)(SAT)可以根據(jù)抗原、抗體是否發(fā)生凝集以及凝集程度來定量檢測布病的抗體滴度[3]，是目前我國規(guī)定的布病確診檢測方法及處置方法，主要是檢測血清中的IgM類抗體，根據(jù)感染的時間長短也可以檢測到少部分的IgG類抗體。競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)，該實(shí)驗(yàn)方法測定的抗體比較全面，主要檢測IgM類抗體和IgG類抗體。IgM類抗體為感染后最先產(chǎn)生的抗體類型，產(chǎn)生早、持續(xù)時間短；IgG類抗體的產(chǎn)生時間晚于IgM類抗體，且持續(xù)時間長。

3種實(shí)驗(yàn)方法檢測的優(yōu)缺點(diǎn)為：①虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)操作簡便、耗時短、結(jié)果判斷簡單，但有時會產(chǎn)生假陽性結(jié)果?？乖贵w反應(yīng)時間超過4 min會出現(xiàn)纖維素的凝集塊；樣品嚴(yán)重溶血；人為肉眼判斷，難免會出現(xiàn)偏差，3種原因均可導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果。②試管凝集試驗(yàn)( SAT) 特異度高，但是此實(shí)驗(yàn)耗時長，操作繁瑣，其對于感染初期的布病檢測具有重要意義，為我國規(guī)定的布病確診檢測方法及處置方法[4]。③競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA) ，該實(shí)驗(yàn)測定的抗體比較全面，IgG類抗體和IgM類抗體都在其檢測范圍內(nèi)，此實(shí)驗(yàn)的敏感性高，但成本代價(jià)大、操作繁瑣、特異性差。

實(shí)驗(yàn)中3種檢測方法檢出的陽性率不盡相同，主要原因如下：①3種實(shí)驗(yàn)方法所檢測的抗體類型不同。②RBT實(shí)驗(yàn)方法易受人為肉眼判斷、觀察結(jié)果時間及樣品溶血的影響而出現(xiàn)假陽性。③受實(shí)驗(yàn)本身的影響，做為布病初篩的RBT實(shí)驗(yàn)方法本身的檢測結(jié)果就要差于用于布病確診的SAT實(shí)驗(yàn)方法。④RBT初篩檢測出3份陽性樣品未包含在用cElisa實(shí)驗(yàn)方法檢測出的46份陽性樣品中以及用SAT方法檢測出的7份陽性樣品中，可能是受試劑本身、人為操作以及肉眼判斷的影響。⑤受試劑原因、人為因素、實(shí)驗(yàn)操作等某些客觀原因的影響。

4 結(jié)論

針對上述3種檢測方法在布病檢測中的結(jié)果比較及原因分析可知，虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)主要用于疑似有布病發(fā)生時的全覆蓋大規(guī)模的初篩；試管凝集試驗(yàn)(SAT)主要用于布病的確診及規(guī)范處置的依據(jù)； 競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)可以為布病的流行病學(xué)調(diào)查及養(yǎng)殖場布病的凈化提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。由于試劑原因、人為操作以及實(shí)驗(yàn)本身的局限性，在進(jìn)行布病流行病學(xué)調(diào)查、診斷、處置、防控等工作中應(yīng)綜合多種實(shí)驗(yàn)方法、重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作、認(rèn)真分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并根據(jù)《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18646-2018》《布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范》提出最佳的防控措施、防控建議和處置方法。