藍(lán)福勝，王曉英，劉曉玲

（1.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350001；2.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350001）

氟維司群是一種新型的雌激素受體拮抗劑，以乳腺癌細(xì)胞的雌激素受體為靶標(biāo)，下調(diào)其蛋白水平，治療對象為已接受雌激素受體拮抗治療或治療過程中復(fù)發(fā)的絕經(jīng)后乳腺癌患者。臨床研究表明患者對本品的耐受性良好，可明顯降低關(guān)節(jié)疾病不良反應(yīng)發(fā)生率[1-3]。氟維司群藥用原料為白色粉末，在水中幾乎不溶，為確保制劑質(zhì)量有必要對其中的微生物進(jìn)行控制。

《中華人民共和國藥典》（2020年版）非無菌藥用原料及輔料的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：需氧菌總數(shù)不得大于103cfu/g或cfu/mL；霉菌和酵母菌總數(shù)不得大于102cfu/g或cfu/mL[4]。當(dāng)采用傾注法進(jìn)行藥品中微生物計(jì)數(shù)時(shí)，由于部分藥用原料在水中的溶解度低，制成的供試品溶液含有大量的微小顆粒，接種至胰酪大豆胨培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基后，生長的細(xì)菌菌落與藥物顆粒不易區(qū)分，對菌落的鑒定和計(jì)數(shù)造成困難。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）是一種脂溶性光敏感復(fù)合物，溶于水后成無色溶液，但被還原后即呈紅色而不溶于水的三苯基甲腙（TPF），TPF較穩(wěn)定，不易在空氣中氧化。細(xì)菌在新陳代謝中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可使無色的TTC還原成紅色的TPF[5]，因此，TTC可作為細(xì)菌生長的指示劑。為準(zhǔn)確區(qū)分菌落與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡、油滴等，《藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》（2019年版）[6]規(guī)定：可在培養(yǎng)基中添加一定含量的TTC，用量應(yīng)以不抑制微生物生長為宜。

本文分別以含不同含量的6種TTC對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌生長的影響及對細(xì)菌的指示作用進(jìn)行試驗(yàn)，確定了藥用原料微生物計(jì)數(shù)時(shí)TTC在瓊脂培養(yǎng)基中的最適合濃度，并建立了科學(xué)、高效的氟維司群原料藥微生物計(jì)數(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

⑴ 菌種：金黃色葡萄球菌（StaphyLococcus aureus）[CMCC(B) 26003]（G+代表）、枯草芽孢桿菌（BaciLLus subtilis）[CMCC(B) 63501]（芽孢桿菌代表）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B) 10104]（G-代表）、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(F) 44102]（腸道菌代表）、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC (F)98001]（酵母菌代表）、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC (F) 98003]（霉菌代表），均購自北京三藥科技開發(fā)有限公司。

⑵ 培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（批號：200525）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）（批號：210116）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（批號：210929）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）（批號：190212）均購自北京三藥科技開發(fā)有限公司。

⑶ 試劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：210409，北京三藥科技開發(fā)有限公司）；氯化鈉（批號：20190802，國藥集團(tuán)）；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（批號：918F031，Solarbio；批號：C10164419，Macklin；批號：30187713，國藥集團(tuán)）；聚山梨酯80（批號：220304，西隴科學(xué)股份有限公司）。

⑷ 儀器：電子天平（型號：TX2202L）；高壓蒸汽滅菌器（型號：HVA-110）；低溫培養(yǎng)箱（型號：M IR-2 54-P C）；恒溫培養(yǎng)箱（型號：IL812C）；生物安全柜（型號：MSC1.8A2）；振蕩水浴槽（型號：SW23）。

⑸ 氟維司群：（藥用原料，批號：00004AA003-5，福建基諾厚普生物科技有限公司）。

1.2 方法

⑴ 菌懸液：按照2020年版《中華人民共和國藥典》1101菌液制備方法依次制備每1 mL不大于100 cfu和10000 cfu的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌菌懸液和黑曲霉菌孢子懸液。

⑵ 0.1%TTC溶液：精密稱定0.1 gTTC至100 mL蒸餾水，溶解，115 ℃高壓滅菌20 min，于4 ℃冰箱中避光保存。

⑶ 含不同含量TTC培養(yǎng)基：臨用時(shí)，在每100 mL溫度不超過45 ℃的TSA或SDA添加0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 mL的0.1%TTC溶液，搖勻，分別制成含0.0005%、0.0006%、0.0007%、0.0008%、0.0009%、0.001%TTC的TSA或SDA。

⑷ TTC適用性試驗(yàn)：參照劉曉玲《2,3,5-三苯基氯化四氮對菌落計(jì)數(shù)的影響研究》[7]，即取稀釋好的菌懸液1 mL接種至90 mm的無菌平皿中，分別注入15～20 mL含不同濃度TTC的瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，30～35 ℃倒置培養(yǎng)，作為試驗(yàn)組；注入15～20 mL不含TTC的瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，30～35℃倒置培養(yǎng)，作為對照組。培養(yǎng)48 h后觀察菌落顏色并點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。

⑸ 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)：按《中華人民共和國藥典》2020年版1106計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)要求，取1∶10供試液9.9 mL，分別加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉、白色念珠菌5個試驗(yàn)菌的菌懸液0.1 mL（≤10000 cfu/mL），漩渦振蕩使其與供試液充分混勻后，取1 mL置于直徑為90 mm的無菌平皿中。需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)注入15～20 mL溫度不超過45 ℃的TSA或含0.0005%TTC的TSA，霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)注入15～20 mL溫度不超過45 ℃的SDA或含0.0005%TTC的SDA，每一培養(yǎng)基各接種2皿。置規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)72 h后，觀察平皿上菌落生長情況并點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。

⑹ 供試液：取氟維司群10 g，加入含0.5%聚山梨酯80的pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，45 ℃水浴10 min，振搖混勻，作為1∶10供試液。

2 結(jié)果

2.1 TTC 對6種微生物生長的影響

除白色念珠菌外，其余5個試驗(yàn)菌在含0.0005%、0.0006%、0.0007%、0.0008%、0.0009%及0.001%TTC的TSA上生長良好且試驗(yàn)組和對照組的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果基本一致。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌及大腸埃希菌菌落均呈紅色。由表1可知，當(dāng)TSA中的TTC含量大于0.0007%時(shí)，白色念珠菌菌落計(jì)數(shù)回收率小于0.7且隨著TTC含量的升高回收率進(jìn)一步降低，而在SDA上試驗(yàn)含量TTC對白色念珠菌生長無影響，3個品牌TTC試驗(yàn)結(jié)果一致。

表1 TTC對白色念珠菌的影響

2.2 氟維司群微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

由表2和表3可知，在 TSA上，由于試驗(yàn)組金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌菌落較小且無色，故與供試品顆粒不易區(qū)分而無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。在含0.0005%TTC的TSA上，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及銅綠假單胞菌均呈紅色，與白色供試品顆粒區(qū)分明顯。5個試驗(yàn)菌回收率均在0.8以上，符合藥典要求（0.5～2.0）。

表2 氟維司群需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果（傾注法，n=3）

表3 氟維司群霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果（傾注法，n=3）

3 結(jié)論

氟維司群原料藥需氧菌總數(shù)取1∶10供試液1 mL按傾注法計(jì)數(shù)，由于TSA中含有大量白色、不溶性微小顆粒，細(xì)菌菌落易與供試品顆粒混淆，造成無法準(zhǔn)確進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。而在TSA中加入TTC至終濃度為0.0005%后，可使培養(yǎng)基深層生長的細(xì)菌菌落呈紅色且不會對試驗(yàn)菌的生長造成影響，便于試驗(yàn)人員對菌落進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。因此，相比不加TTC而將供試品進(jìn)一步稀釋至1∶100以上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，該方法耗時(shí)更少、更科學(xué)。

4 討論

TTC 可作為細(xì)菌菌落指示劑，它在藥品、食品及化妝品菌落總數(shù)計(jì)數(shù)中均有應(yīng)用，原則上TTC的含量要求不抑制或延緩微生物的生長且對細(xì)菌的指示性顯著。目前，在藥品微生物計(jì)數(shù)中，含TTC培養(yǎng)基對白色念珠菌生長是否造成影響，未見相關(guān)報(bào)道。筆者通過考察0.0005%、0.0006%、0.0007%、0.0008%、0.0009%、0.001%6種含量TTC對TSA中G+、G-、芽孢桿菌、腸道桿菌、酵母菌及霉菌的影響，結(jié)果顯示0.0005%～0.001%TTC對G+、G-、芽孢桿菌、腸道桿菌的顯色效果良好且無生長抑制作用，這與《藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》（2019年版）推薦的使用濃度一致。但當(dāng)培養(yǎng)基中TTC含量大于0.0007%時(shí)，TSA和SDA上白色念珠菌的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果具有較大差異，表現(xiàn)為TSA上TTC對白色念珠菌的生長抑制作用明顯且隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，而在SDA上添加相同含量的TTC后不會對白色念珠菌的生長造成影響。由于TSA為中性培養(yǎng)基（pH：7.3±0.2），SDA為酸性培養(yǎng)基（pH：SDA 5.6±0.2）且每1 L的SDA中含有40 g葡萄糖，TSA中無此成分，因此形成上述差異很可能與酸性環(huán)境和含有葡萄糖更有利于白色念珠菌的生長繁殖使其快速形成對TTC的耐受力有關(guān)。綜上，TTC作為細(xì)菌指示劑在不同菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基中的添加量并不一致，這一點(diǎn)在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）[8]菌落計(jì)數(shù)時(shí)對于TTC推薦用量為每100 mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中加入1 mL0.5%TTC相吻合，藥品微生物檢驗(yàn)人員應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基特性選擇合適含量的TTC。