劉樹軍，黃 勇，林 琨，楊建宇★

（1.南寧市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530001 ；2.廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院，廣西 南寧 530199）

呼吸道感染是兒童最常見的疾病之一，其具體臨床表現(xiàn)的差異較大，可為癥狀輕微的上呼吸道感染，也可發(fā)展成比較嚴重的下呼吸道感染，嚴重時可引起呼吸衰竭，甚至致人死亡[1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有200 萬的5 歲以下兒童因呼吸道感染而死亡[2]。絕大多數(shù)的呼吸道感染都是由呼吸道病毒（Respiratory virus）引起的[3]，臨床上常見的呼吸道病毒包括甲型流感病毒（Influenza A Virus，F(xiàn)luA）、乙型流感病毒（Influenza B Virus，F(xiàn)luB）、副流感病毒Ⅰ型（Parainfluenza virus Ⅰ，PIV Ⅰ）、副流感病毒Ⅱ型（Parainfluenza virus Ⅱ，PIV Ⅱ）、副流感病毒Ⅲ型（Parainfluenza virus Ⅲ，PIV Ⅲ）、呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）、腺病毒（Adenovirus，ADV）等[4]。漢黃芩素（Wogonin，即5，7-二羥基-8- 甲氧基黃銅）是唇形科植物黃芩的主要活性成分之一[5]。該物質(zhì)屬于黃酮類化合物，其分子式是C16H12O5。有研究表明，漢黃芩素具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性，但其是否可以用于呼吸道病毒感染的治療，仍需進一步探究[6-10]。本研究旨在通過網(wǎng)絡藥理學結(jié)合分子對接法對漢黃芩素抗呼吸道病毒感染的靶點和通路進行系統(tǒng)的生物信息學分析，推測其潛在的作用機制，進而為后續(xù)研究提供一定的科學依據(jù)和方向。

1 材料與方法

1.1 潛在靶點數(shù)據(jù)的收集

在Pubchem 網(wǎng)站以“wogonin”為關鍵詞下載漢黃芩素的3D 化合物結(jié)構，將其上傳至PharmMapper服務器，篩選出Z ＞0 的數(shù)據(jù)導入至Uniprot 數(shù)據(jù)庫，得到各個靶點的官方名稱（Gene Symbol），隨后利用gprofiler 網(wǎng)站將Gene Symbol 轉(zhuǎn)換為Gene ID，構建漢黃芩素相關靶點數(shù)據(jù)庫。以常見呼吸道病毒為關鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫進行搜索，剔除重復數(shù)據(jù)，建立呼吸道病毒感染靶點數(shù)據(jù)庫。利用在線韋恩圖Venny 2.1 軟件對上述兩個靶點數(shù)據(jù)庫進行交集比對，收集漢黃芩素抗呼吸道病毒感染的潛在靶點數(shù)據(jù)。

1.2 富集分析

將獲取的潛在靶點信息輸入到生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）中進行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析[11]，根據(jù)P≤0.05 對結(jié)果進行篩選分析，隨后利用R 4.0.4 軟件對其進行可視化處理。

1.3 “化合物—靶點—通路”網(wǎng)絡圖的構建

根據(jù)富集分析的結(jié)果，將潛在作用靶點上傳至STRING 在線軟件，獲取蛋白相互作用網(wǎng)絡信息。運用Cytoscape 3.7.1 軟件對結(jié)果進行可視化處理，再將化合物、通路和疾病信息導入軟件，以度值（degree）的大小反映節(jié)點的大小，以介數(shù)值（EdgeBetweenness）反映邊的粗細，利用軟件的Merge 功能構建“化合物—靶點—通路”網(wǎng)絡圖。利用插件CytoHubba 分析網(wǎng)絡度（Degree）值，將Degree 值較高的靶點作為潛在關鍵靶點用于分子對接。

1.4 分子對接

在PDB 數(shù)據(jù)庫下載潛在關鍵靶點的3D 結(jié)構，利用PyMOL 軟件對靶蛋白進行去水、去除配體等修飾處理，應用Discovery Studio 2016 軟件（簡稱DS）進行加氫、加電荷處理，賦予ChARMm 力場，將其定義為對接受體。隨后對經(jīng)過前期處理的靶蛋白與漢黃芩素采用LibDock 方法進行對接運算分析。

2 結(jié)果

2.1 潛在靶點數(shù)據(jù)庫的建立

利用PharmMapper 服務器將漢黃芩素與2241 個人源蛋白靶標進行反向?qū)?，對漢黃芩素進行靶點預測，篩選出Z ＞0 的74 個靶點，將其校正為Gene Symbol，并轉(zhuǎn)換成相應的Gene ID。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫共收集到與呼吸道病毒感染相關的靶點528個，對上述兩組靶點進行交集比對，得到17 個漢黃芩素與呼吸道病毒的共同靶點，見圖1 和表1。

圖1 漢黃芩素與呼吸道病毒的共同靶點Venn 圖

表1 潛在靶點數(shù)據(jù)庫

2.2 GO 富集分析和KEGG 通路注釋

根據(jù)顯著性程度，GO 富集分析和KEGG 通路注釋均以P≤0.05 表示具有統(tǒng)計學意義。經(jīng)GO 富集分析共得到75 個GO 條目，主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化、磷脂酰肌醇3- 激酶信號的正調(diào)控性、信號轉(zhuǎn)導等生物過程（Biological process，BP）；在細胞成分（Cellular components，CC）方面主要與核漿，細胞核、胞質(zhì)等有關；在分子功能（Molecular function，MF）方面主要涉及ATP 結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白激酶活性等。根據(jù)P值分別選取BP、CC、MF 排名前10 的條目，利用R 4.0.4 軟件進行可視化處理，結(jié)果見圖2。經(jīng)KEGG 通路注釋得到28 條主要信號通路，符合P≤0.05 的通路有23 條。主要涉及腫瘤通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路和催乳激素信號通路等，見圖3。

圖2 潛在靶點的GO 功能富集分析圖

圖3 KEGG 通路富集氣泡圖

2.3 網(wǎng)絡圖的構建及分析

利用Cytoscape 3.7.1 軟件構建“化合物—靶點—通路”網(wǎng)絡圖，見圖4。其中藍色節(jié)點代表化合物漢黃芩素，青綠色節(jié)點代表靶點，紫色節(jié)點代表通路，節(jié)點越大表明其度值越高，邊代表它們之間的相互作用。通過插件CytoHubba 進行網(wǎng)絡拓撲學分析發(fā)現(xiàn)，關鍵靶蛋白MAPK14 和MAPK8 在網(wǎng)絡中占據(jù)的比重較大，分別調(diào)控多條通路。

圖4 化合物-靶點-通路網(wǎng)絡圖

2.4 分子對接驗證

從PDB 數(shù)據(jù)庫下載MAPL14 和MAPK8 的三維結(jié)構，經(jīng)過前期處理修飾后，通過DS 軟件利用LibDOCK方法分別將MAPK14 和MAPK8 與漢黃芩素進行分子對接。為了更直觀地觀察MAPK14 和MAPK8 與漢黃芩素的相互作用及關鍵的氨基酸和基團，生成了配體-蛋白互作二維平面圖，見圖5。結(jié)果顯示，漢黃芩素與MAPK14 通過氫鍵、碳氫鍵、π-烷基鍵等相互作用，漢黃芩素與MAPK8 通過碳氫鍵、π-烷基鍵相互作用，這些相互作用為化合物的結(jié)合提供了較強的靜電力貢獻。

圖5 漢黃芩素與潛在關鍵靶蛋白互作二維平面圖

3 討論

呼吸道病毒是引起呼吸道感染的主要病原體。近年來，隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，人們對呼吸道病毒感染的研究不斷深入[12]。目前，中藥在治療呼吸道病毒感染的臨床實踐中顯現(xiàn)出了一定的效果，其研究前景廣闊。有研究表明，漢黃芩素具有較強的抗病毒活性，但其具體作用機制尚不清楚[6]。本研究通過網(wǎng)絡藥理學分析共篩選出17 個漢黃芩素抗呼吸道病毒感染潛在靶點，包括MAPK14、MAPK8、BRAF、PTPN11、MET 等，且各靶點間有一定的相關性。這說明，漢黃芩素可通過作用于多個靶點來起到抗呼吸道病毒感染的作用。此外，通過分子對接技術發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素可通過氫鍵結(jié)合在MAPK14 蛋白A 鏈的THR106、LEU104 上，通過π- 烷基鍵結(jié)合在MAPK14 蛋白A 鏈的Ile84、Leu75 上，通過碳氫鍵結(jié)合在MAPK8 蛋白A 鏈的Gly33 上，通過π- 烷基鍵結(jié)合在MAPK8 蛋白A 鏈的Val40、Val158 上。這表明，漢黃芩素可穩(wěn)定地結(jié)合MAPK14、MAPK8，提示漢黃芩素可能是通過靶向MAPK14 和MAPK8 來發(fā)揮抗呼吸道病毒的作用。絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）是p38MAPK 的重要成員之一，P38MAPK 家族是由 不 同 基 因 編 碼 的α(MAPK14)、β(MAPK11)、γ(MAPK12) 和δ(MAPK13) 亞型組成，所有亞型均具有較高的氨基酸同源性[13]。其中MAPK14 是最豐富、最具特征的異構體，可參與多種生理過程和疾病[14]。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK14 的磷酸化形式PMAPK14 是與索拉非尼耐藥相關的一種蛋白激酶，它與乙肝病毒X 蛋白的表達有關；通過敲除pMAPK14 可提高索拉非尼的治療效果，并可在乙型肝炎病毒（HBV）存在的情況下減輕對索拉非尼的耐藥性[15]。絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）又叫JNK1 或SAPK1，是MAPK 信號通路中的重要信號分子，涉及細胞增殖、分化、凋亡等各種機制[16]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道病毒71 型（EV71）感染未成熟樹突狀細胞（IDC）可激活JNK1/2 和p38MAPK 信號通路級聯(lián)，使其下游分子c-Jun 和c-Fos磷酸化，進而可促進促炎細胞因子的分泌[17]。筆者推測，漢黃芩素可通過阻斷MAPK14 和MAPK8 的活化來發(fā)揮抗呼吸道病毒的作用。本研究中通過KEGG 通路富集分析和GO 分析發(fā)現(xiàn)漢黃芩素抗呼吸道病毒感染的潛在靶點主要富集在腫瘤通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路等通路，主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化和信號轉(zhuǎn)導等生物過程。PI3K-Akt 信號通路與細胞的增殖、凋亡等細胞進程密切相關，一些病毒的入侵和復制可能與該條通路有關[17]；MAPK 信號通路具有調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和生長等功能，在細胞間和細胞內(nèi)的通信中發(fā)揮著重要的作用[18]。研究表明，病毒可以調(diào)節(jié)宿主細胞的信號網(wǎng)絡，包括PI3K/AKT/mTOR 和ERK/MAPK[19-20]。本研究中分析得出的關鍵靶點MAPK14和MAPK8 與細胞增殖有密切的關系。

綜上所述，本研究中應用網(wǎng)絡藥理學方法對漢黃芩素抗呼吸道病毒感染的潛在靶點和通路進行了分析，并結(jié)合分子對接初步驗證了漢黃芩素與潛在關鍵靶點之間的結(jié)合活性。這揭示了漢黃芩素可通過“多靶點—多通路”的機制來起到抗呼吸道病毒感染的作用，可為后續(xù)實驗設計和深入研究提供思路和參考。