曾 麗，蔡旭濱，閔思明，王小輝，陳凌峰，黃一帆*，馬玉芳*

(1.中西獸醫(yī)結(jié)合與動物保健福建省高等學校重點實驗室，福建 福州 350002；2.福建省獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室，福建 福州 350002)

仔豬斷奶技術引起環(huán)境及飼料等方面的改變，使得仔豬抗病力降低、腸道正常功能受損等，引起腹瀉甚至死亡[1-2]。飼用抗生素因其能有效提高斷奶仔豬生產(chǎn)性能、抗病能力等作用被大量應用于養(yǎng)豬生產(chǎn)中，但其濫用而造成的細菌耐藥性、機體抵抗力降低甚至影響人體健康的問題也十分突出。我國已于2020年7月1日停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料[3]。因此，尋找合適的抗生素替代物是行業(yè)內(nèi)關注的重點。而植物提取物因其有抗菌、殺菌、提高動物免疫力、提高動物生產(chǎn)性能等作用成為替抗熱點之一[4-5]。牛至油(oregano essential oil，OEO)是從植物牛至(OriganumvulgareL.)中提取的一種植物精油，已被我國農(nóng)業(yè)部批準作為一種藥物飼料添加劑可長期在飼料中添加[6-7]。OEO具有抗氧化、促生長、促進消化吸收、增強免疫力等作用，且綠色環(huán)保無污染，可作為飼用抗生素的一種替代物[7-8]。課題組前期研究表明，飼糧中添加OEO能提高血清和小腸組織中胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量，促進斷奶仔豬生長[9]。研究表明，IGF-Ⅰ對腸道的發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用，并在其發(fā)育過程中起重要作用[10]。但是，目前關于OEO對斷奶仔豬腸道健康影響的研究卻鮮見報道。本試驗在斷奶仔豬基礎飼糧中添加不同添加量的OEO，通過檢測試驗豬小腸形態(tài)、小腸組織細胞因子和分泌型免疫球蛋白(SIgA)含及和腸道緊密連接相關基因表達的變化，從腸道健康方面探討OEO對斷奶仔豬保健的作用機制，為其在斷奶仔豬方面的臨床應用提供數(shù)據(jù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑牛至油(半包被的10%牛至油預混劑，主要成分為香芹酚和百里香酚各占5%，包被材料為輕質(zhì)碳酸鈣)，購自福建中農(nóng)牧生物藥業(yè)有限公司[9]。

1.2 試驗動物與分組選取胎次相近、25日齡斷奶的“大白×長白”二元雜交仔豬120頭，按公母各半、體質(zhì)量相近的原則隨機分為4組，對照組(A組)飼喂基礎日糧，3個試驗組分別在基礎日糧中添加OEO 300(B組),500(C組),800(D組) mg/kg，每組3個重復。預試期為5 d，正試期為30 d。日糧配方參見文獻[9]飼養(yǎng)管理與免疫程序按照常規(guī)進行。

1.3 測定的指標及方法

1.3.1樣品采集 試驗結(jié)束當天，每個重復隨機挑選1頭仔豬剖殺，分別取十二指腸、空腸、回腸，取1份樣品進行4%多聚甲醛溶液固定，用于腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的測定。另取1份樣品裝入凍存管中，-80℃保存，用于腸道細胞因子(IL-2、IL-6、IFN-γ)和SIgA及仔豬腸道緊密連接相關基因表達的測定。

1.3.2小腸組織樣品處理 具體操作見參考文獻[11],運用ImageProPlus6.0軟件計算腸絨毛長度和隱窩深度，并計算絨毛長度與隱窩深度比值(V/C)。

1.3.3腸細胞因子和SIgA含量測定 ELISA測定腸道組織黏膜中IL-2、IL-6、IFN-γ的含量及不同腸段組織中SIgA含量，具體操作見試劑盒說明書，測試儀器為全自動酶標儀(STATFAX2100，Awareness Technology Inc.USA)。

1.3.4仔豬腸道緊密連接相關基因表達的測定 采用熒光定量PCR檢測仔豬十二指腸、空腸、回腸黏膜的閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、閉鎖蛋白(Occludin)和跨膜蛋白(Claudin)的mRNA相對表達量。具體操作及引物序列按照參考文獻[11]進行。相對表達量用2-△△Ct方法計算，△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)試驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。引物序列見表1。

表1 基因的擴增引物序列

2 結(jié)果

2.1 OEO對斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響試驗仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)見表2。由表2可知，各試驗組仔豬腸道絨毛長度均有一定程度提高,十二指腸和空腸中C組與A組差異顯著(P<0.05);各試驗組隱窩深度均有一定程度下降，十二指腸中C組與A組差異顯著(P<0.05)；各試驗組絨毛高度與隱窩深度的比值均有一定程度降低，空腸中B組與A組差異顯著(P<0.05)，C組與A組差異極顯著(P<0.01)，回腸中C組與A組差異顯著(P<0.05)。

表2 牛至油對斷奶仔豬小腸形態(tài)的影響 μm

2.2 OEO對斷奶仔豬腸道細胞因子和SIgA的影響由表3可知，各試驗組仔豬腸道IL-2、IL-6、IFN-γ及SIgA均有一定程度提高，除回腸IL-2和IL-6以及空腸IFN-γ在3個試驗組中與A組相比無顯著性差異(P>0.05)外，其余各組與A組相比有顯著性差異或極顯著性差異(P<0.05或P<0.01))。

表3 牛至油對斷奶仔豬腸道組織細胞因子和SIgA含量的影響

2.3 OEO對斷奶仔豬小腸緊密連接基因相對表達的影響

2.3.1OEO對斷奶仔豬十二指腸緊密連接基因相對表達的影響 從圖1可見，與A組相比，試驗仔豬十二指腸腸緊密連接基因表達量均有一定程度提高，其中除D組Occludin和Cladudin mRNA表達量顯著提高外(P<0.05)，其余各組與A組相比有極顯著性差異(P<0.01)。

與A組相比，** P<0.01，*P<0.05。下同

2.3.2OEO對斷奶仔豬空腸緊密連接基因相對表達量的影響 從圖2可見，與A組相比，試驗仔豬空腸緊密連接基因表達量均有一定程度提高，其中C組緊密連接蛋白ZO-1表達量有極顯著提高(P<0.01)，B、C組Occludin和Cladudin mRNA表達量有極顯著提高(P<0.01)，而D組有顯著提高(P<0.05)。

圖2 OEO對斷奶仔豬空腸緊密連接基因相對表達量的影響

2.3.3OEO對斷奶仔豬回腸緊密連接基因相對表達量的影響 從圖3可見，與A組相比，試驗仔豬回腸緊密連接基因表達量均有一定程度提高，其中緊密連接蛋白ZO-1表達量在C組極顯著提高(P<0.01)，而B、D組顯著提高(P<0.05)，Occludin mRNA表達量在B、C、D組極顯著提高(P<0.01)，Cladudin mRNA表達量在B、C、D組顯著提高(P<0.05)。

圖3 OEO對斷奶仔豬回腸緊密連接基因相對表達量的影響

3 討論

3.1 OEO對斷奶仔豬小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性是仔豬腸道吸收功能和機體生長發(fā)育的基礎，而絨毛高度、隱窩深度及V/C值是反映小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要指標[12]。研究表明，仔豬早期斷奶會引起小腸絨毛長度[13]、形狀[14]、隱窩深度[15]等指標變化。腸絨毛能擴大腸內(nèi)吸收營養(yǎng)物質(zhì)的面積，較高的V/C值更有利于吸收營養(yǎng)物質(zhì)，而腸絨毛萎縮、隱窩變深則會降低營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率[15-16]。日糧中添加百里香酚或香芹酚和百里香酚混合物可增強斷奶仔豬腸道屏障功能，減少斷奶應激，改善腸道健康[17-18]。MICHIELS等[19]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加香芹酚和百里酚可提高小腸遠端V/C值。宋轉(zhuǎn)等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加復合植物精油(含牛至油、百里香油等)能夠增加斷乳仔豬空腸和回腸的腸絨毛長度，提高V/C值，緩解腸道損傷。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加不同質(zhì)量濃度OEO可以不同程度地提高十二指腸、空腸和回腸的腸絨毛長度，降低隱窩深度，提高V/C值，且在飼糧中添加500 mg/kg OEO對提高小腸V/C值效果最好，這也與本課題組前期研究結(jié)果一致[9]：日糧中添加OEO后，斷奶仔豬平均日采食量、平均日增重提高，腹瀉率降低，且相關血清激素指標及小腸組織中的IGF-Ⅰ含量升高，說明OEO同上述植物提取物一樣能夠促進腸道發(fā)育，改善小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，增強小腸的吸收功能，促進斷奶仔豬生長。

3.2 OEO對斷奶仔豬腸道細胞因子、SIgA含量的影響腸黏膜免疫屏障能主要依靠腸道相關淋巴組織、SIgA和細胞因子等其他免疫活性物質(zhì)發(fā)揮其免疫功能。SIgA具有防止病原微生物在腸道附著、激活補體及溶解細菌等作用，而細胞因子對腸黏膜免疫屏障作用進行調(diào)節(jié)[13]。IL-2能夠激活和促進T細胞增殖分化，具有免疫激活、免疫耐受及雙向調(diào)節(jié)作用[19]。IL-6可促進T淋巴細胞表面表達IL-2受體，增強IL-2作用等功能，從而改善機體免疫功能[20]。因此，腸黏膜白介素能夠促進T、B淋巴細胞增殖分化，產(chǎn)生特異性抗體，提高SIgA腸道黏膜免疫功能[21]，而IFN-γ能夠通過促進IL-2生成，進而發(fā)揮其黏膜免疫的功能。OEO中的百里香酚和香芹酚可增強腸道屏障功能，減少病原微生物對腸道上皮細胞的損傷[22]。XUN等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬日糧中添加300或400 mg/kg姜黃素21 d后SIgA的含量增加；白藜蘆醇可通過提高IFN-γ水平和降低TNF-α水平進而調(diào)節(jié)仔豬的體液免疫應答[24]。本試驗結(jié)果表明，添加OEO能不同程度地提高斷奶仔豬腸道黏膜IL-2、IL-6以及IFN-γ和SIgA含量，這可能與OEO有效成分能激活效應T細胞產(chǎn)生細胞因子IL-2、IL-6等有關，這些細胞因子能促進B細胞增殖，進一步分化為漿細胞，從而促進SIgA的合成，加強腸道的免疫功能。

3.3 OEO對斷奶仔豬緊密連接基因相對表達量影響腸道黏膜屏障發(fā)揮正常功能主要依賴于腸上皮細胞間緊密連接的狀況，其中緊密連接蛋白Occludin、Claudins和ZO-1等是形成其結(jié)構(gòu)與組成的基礎[25-26]。ZO-1和Occludin的表達量與腸道屏障的正常功能密切相關，前者影響腸道屏障的通透性，后者則影響腸黏膜機械屏障的穩(wěn)定性，而Claudins的磷酸化程度則反映與腸上皮緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)，其磷酸化失調(diào)將導致胃腸屏障功能受損，黏膜通透性增強[25,27]。研究表明，仔豬斷奶后，腸上皮緊密連接蛋白表達量下降(包括Occludin、ZO-1 mRNA豐度以及ZO-1的表達量降低)，腸黏膜通透性增加[28],姜黃素可通過上調(diào) Occludin 和ZO-1 表達來改善緊密連接和腸黏膜屏障功能受損程度，促進腸上皮細胞間緊密連接，降低腸黏膜通透性，進而增強其機械屏障功能[29]。而本試驗結(jié)果顯示在飼糧中添加不同濃度OEO可以不同程度地提高回腸、空腸和十二指腸連接蛋白ZO-1、Claudin、Occludin表達，其中C組效果最好，表明OEO能通過提高緊密連接基因表達量，增強腸黏膜機械屏障功能，但其有效成分如何影響緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)、功能甚至基因表達的機制仍需進一步研究。