楊明茂，田 艷，高暢鴻，王 爽，麻芯茹，范文文，呂鑫泉，張冰冰，徐 闖，楊 威*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

圍產(chǎn)期是奶牛營(yíng)養(yǎng)代謝病的高發(fā)時(shí)期，也是奶牛飼養(yǎng)管理中最具挑戰(zhàn)性的時(shí)期之一。在產(chǎn)前21 d到產(chǎn)后21 d期間，奶牛先后經(jīng)歷妊娠-分娩-泌乳的生理變化，體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)需求顯著增加，然而由于干物質(zhì)攝入量不足，無(wú)法滿(mǎn)足自身營(yíng)養(yǎng)需求，導(dǎo)致奶牛機(jī)體內(nèi)能量代謝失衡，進(jìn)而引發(fā)能量負(fù)平衡(negative energy balance,NEB)[1]。NEB是圍產(chǎn)期奶牛普遍經(jīng)歷的亞健康狀態(tài)，這個(gè)時(shí)期奶牛會(huì)進(jìn)行體脂動(dòng)員來(lái)滿(mǎn)足泌乳前期所需的能量需求，然而嚴(yán)重的NEB所致過(guò)度的體脂動(dòng)員產(chǎn)生大量非酯化脂肪酸(NEFA)進(jìn)入肝臟，導(dǎo)致圍產(chǎn)期奶牛肝脂代謝及膽固醇代謝紊亂[2-3]。同時(shí)，圍產(chǎn)期奶牛因體內(nèi)代謝失衡，導(dǎo)致活性氧(ROS)的增加，進(jìn)而誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化，引發(fā)線(xiàn)粒體損傷和細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步損傷肝臟功能[4]，導(dǎo)致能量代謝失衡類(lèi)疾病(酮病和脂肪肝)的發(fā)生，對(duì)奶牛的泌乳量、繁殖性能、經(jīng)濟(jì)效益等多方面產(chǎn)生負(fù)面影響[5]。因此，研發(fā)有效的防控藥物對(duì)奶牛業(yè)健康持續(xù)發(fā)展尤為重要。

隨著禁抗令的實(shí)行，植物源性功能飼料添加劑的研發(fā)及應(yīng)用逐漸受到畜禽養(yǎng)殖業(yè)的重視。黃酮類(lèi)化合物及類(lèi)固醇化合物在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，與反芻動(dòng)物的能量代謝、內(nèi)分泌及預(yù)防肝損傷有著密切的關(guān)系，具有抗氧化、抗炎和保護(hù)肝臟損傷等藥理活性[6-7]。楊梅素和大豆異黃酮作為黃酮類(lèi)化合物，通過(guò)對(duì)生物膜有直接的保護(hù)作用，增強(qiáng)肝臟的抗損傷能力，有利于緩解泌乳初期的肝脂代謝紊亂，而且黃酮類(lèi)化合物副作用小、安全無(wú)污染且來(lái)源廣泛[8]，作為新型飼料添加劑具有巨大的市場(chǎng)潛力。植物甾醇是植物來(lái)源的天然類(lèi)固醇化合物，具有改善肝臟膽固醇代謝，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)等作用[9]。因此，本試驗(yàn)擬采用植物甾醇、大豆異黃酮和楊梅素為主要原料制備產(chǎn)后保健顆粒，通過(guò)測(cè)定奶牛產(chǎn)后能量代謝病的發(fā)病率、血液生化指標(biāo)、乳品質(zhì)、尿成分指標(biāo)和氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，旨在評(píng)價(jià)保健顆粒對(duì)緩解奶牛產(chǎn)后能量代謝失衡的影響特征，為規(guī)?；翀?chǎng)產(chǎn)后保健提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑棕櫚油購(gòu)自益海糧油工業(yè)有限公司;植物甾醇、大豆異黃酮、楊梅素、玉米油、大豆卵磷脂、膽堿、維生素E、硬脂酸鎂購(gòu)自浙江一諾生物科技有限公司;醫(yī)用胃溶型聚丙烯酸樹(shù)脂4號(hào)購(gòu)自西安天正藥用輔料有限公司。

1.2 保健顆粒的制備按比例取一定量的棕櫚油(70%)、玉米油(7%)、硬脂酸鎂(0.5%)和醫(yī)用胃溶型聚丙烯酸樹(shù)脂4號(hào)(0.5%)混合后在80℃下溶解，隨即將植物甾醇(5%)、大豆異黃酮(5%)、楊梅素(5%)、大豆卵磷脂(3%)、膽堿(2%)、維生素E(1%)稱(chēng)量混合后迅速放入，迅速攪拌混合1 min，將其倒出并快速預(yù)冷，制成直徑0.2～0.4 cm的顆粒。稱(chēng)取后于20 g/袋裝入食品級(jí)別的封口袋中，密封干燥環(huán)境下保存。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與分組本試驗(yàn)于黑龍江省某集約化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。采用隨機(jī)分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨機(jī)選取2～3胎次、體況相近的圍產(chǎn)期奶牛18頭，對(duì)照組和試驗(yàn)組各9頭，其中對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧的同時(shí)添加制備的保健顆粒(每頭牛40 g/d)并充分混勻，于奶牛分娩當(dāng)天連續(xù)飼喂7 d，采集每頭試驗(yàn)?zāi)膛５难?、乳汁和尿液樣品?/p>

1.4 樣本采集與檢測(cè)

1.4.1血液樣本 試驗(yàn)?zāi)膛Ｓ诋a(chǎn)前21，14，7 d及產(chǎn)后0，3，7，14，21 d尾根靜脈采集血樣15 mL，待血液樣本凝固分層后，4 000 r/min離心10 min，吸取上清至離心管中，每管500 μL分裝，-80℃凍存?zhèn)溆?。使用全自?dòng)血液生化分析儀(Beckman DXC800)檢測(cè)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷草/谷丙(AST/ALT)、總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白球比(A/G)、葡萄糖(GLU)、β-羥丁酸(BHBA)、非酯化脂肪酸(NEFA)、鈣(Ca)的含量。氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH)均按照生化試劑盒(北京索萊寶)說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2乳汁的采集與檢測(cè) 記錄試驗(yàn)?zāi)膛５娜债a(chǎn)奶量，采集乳汁時(shí)，用溫水擦洗乳房并消毒，人工擠乳棄去前2～3把乳汁，收集乳汁20 mL，加入防腐劑，-20℃凍存待檢。采用乳成分分析儀(CombiFoss 4000)檢測(cè)乳汁中乳脂率(milk fat)、乳蛋白率(milk protein)、乳糖率(lactose)、體細(xì)胞數(shù)(SCC)和非脂乳固體(SNF)指標(biāo)的含量。

1.4.3尿液的采集與檢測(cè) 于清晨榨乳前，采用陰道按摩法收集試驗(yàn)泌乳奶牛中段尿液20 mL，置于-20℃冰箱冷凍保存。使用尿液分析儀(桂林優(yōu)利特 URIT-500B)檢測(cè)白細(xì)胞(WBC)、酮體(KET)、葡萄糖(GLU)、尿比重(SG)、酸堿度(pH)、維生素C(Vc)、尿鈣(Ca)、肌酐(CR)的含量。

1.5 檢測(cè)結(jié)果判定依據(jù)當(dāng)奶牛血清BHBA濃度≥1.2 mmol/L時(shí)，認(rèn)定為酮癥。奶牛脂肪肝判定依據(jù)按照血清GLU、AST和NEFA的含量,采用公式Y(jié)=-0.510-0.003NEFA+2.840GLU-0.053 AST計(jì)算Y值，判定脂肪浸潤(rùn)程度，當(dāng)Y<1時(shí)，則奶牛判定為脂肪肝，反之則為健康奶牛[10]。

2 結(jié)果

2.1 保健顆粒對(duì)奶牛能量代謝病發(fā)病率的影響根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定，隨機(jī)選取的18頭奶牛中，對(duì)照組奶牛酮病的發(fā)病率為44%，脂肪肝的患病率為33%。飼喂產(chǎn)后保健顆粒組奶牛酮病和脂肪肝的發(fā)病率為11%。

表1 圍產(chǎn)期奶牛能量代謝病的發(fā)病率

2.2 保健顆粒對(duì)圍產(chǎn)期奶牛血液相關(guān)生化指標(biāo)的影響

2.2.1肝功能指標(biāo) 與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組AST和AST/ALT均在產(chǎn)后3，21 d顯著性降低(P<0.05)；GGT和LDH含量均在產(chǎn)后14，21 d顯著降低(P<0.05)；TBIL在產(chǎn)后7，14，21 d顯著低于對(duì)照組；GLO在產(chǎn)后7，14 d顯著降低；A/G在產(chǎn)后7，14 d顯著升高，產(chǎn)后21極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)組ALB水平在產(chǎn)后高于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖1)。

與對(duì)照組相比，*示差異顯著(P<0.05)；**示差異極顯著(P <0.01)。下同

2.2.2能量代謝相關(guān)指標(biāo) 試驗(yàn)組NEFA水平在產(chǎn)后3,21 d顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，在產(chǎn)后7,14 d極顯著降低(P<0.01)；BHBA水平在產(chǎn)后7,14,21d均顯著降低且趨勢(shì)平穩(wěn)(P<0.05)；試驗(yàn)組GLU在產(chǎn)后3 d顯著升高，在產(chǎn)后7,14 d極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)組Ca水平在產(chǎn)后均高于對(duì)照組，且其含量大于2.0 mmol/L(圖2)。

圖2 保健顆粒對(duì)奶牛能量代謝指標(biāo)NEFA、BHBA、GLU和Ca的影響

2.3 保健顆粒對(duì)奶牛乳汁成分的影響與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的日產(chǎn)奶量在產(chǎn)后0～9 d較低，而在產(chǎn)后10～21 d的產(chǎn)奶量均高于對(duì)照組，但試驗(yàn)期間產(chǎn)奶量差異不顯著；試驗(yàn)組乳脂率均低于對(duì)照組，產(chǎn)后21d顯著降低(P<0.05)；Lactose含量在產(chǎn)后21，32 d顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；其余指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(圖3)。

圖3 保健顆粒對(duì)產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)的影響

2.4 保健顆粒對(duì)圍產(chǎn)期奶牛尿成分的影響試驗(yàn)組KET水平在產(chǎn)后7，14，21 d均顯著降低(P<0.05)；試驗(yàn)組WBC、VC水平在產(chǎn)后3，7 d顯著降低且處于正常水平；pH水平在產(chǎn)后14 d顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；其他指標(biāo)SG、CR、Ca和GLU均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

圖4 保健顆粒對(duì)尿常規(guī)指標(biāo)的影響結(jié)果

2.5 保健顆粒對(duì)圍產(chǎn)期奶牛氧化應(yīng)激的影響試驗(yàn)組MDA在產(chǎn)后3，21 d顯著低于對(duì)照組，產(chǎn)后7，14 d發(fā)生極顯著降低(P<0.01)；試驗(yàn)組SOD水平在產(chǎn)后3，7，14，21 d均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)組GSH水平在產(chǎn)后均高于對(duì)照組，產(chǎn)后14 d具有顯著差異(P<0.05)(圖5)。

圖5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 保健顆粒的制備隨著我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，奶牛單產(chǎn)不斷推高，而由于飼養(yǎng)管理技術(shù)及營(yíng)養(yǎng)調(diào)控技術(shù)相對(duì)不足，使得圍產(chǎn)期奶牛營(yíng)養(yǎng)代謝病高發(fā)群發(fā)，已成為制約我國(guó)奶牛業(yè)高效發(fā)展的主要關(guān)鍵問(wèn)題。因此，篩選研發(fā)綠色高效的圍產(chǎn)期奶牛營(yíng)養(yǎng)調(diào)控產(chǎn)品對(duì)降低疾病發(fā)生，提高圍產(chǎn)期奶牛生產(chǎn)性能尤為重要。植物提取物因富含多種生物活性成分且具備天然綠色、無(wú)耐藥性、無(wú)藥物殘留等特點(diǎn)成為最具前景的畜禽飼料調(diào)節(jié)劑產(chǎn)品。大豆異黃酮是一種存在于豆科植物中的黃酮類(lèi)化合物，可降低肝損傷造成的過(guò)氧化脂質(zhì)，減緩肝細(xì)胞谷胱甘肽的消耗，進(jìn)而緩解脂質(zhì)代謝紊亂，明顯降低肝臟脂肪蓄積，減輕肝組織脂肪變性[11]。楊梅素作為一種天然黃酮類(lèi)化合物，具抗氧化、降低轉(zhuǎn)氨酶活力和炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝臟損傷等多種作用[12]。植物甾醇是一種類(lèi)固醇化合物，不但可作為肝功能改善劑，還可作為肝功能障礙的預(yù)防劑。在其他選取原料中，棕櫚油和玉米油作為過(guò)瘤胃保護(hù)劑，可增加反芻動(dòng)物的能量及蛋白質(zhì)含量，補(bǔ)充泌乳初期的營(yíng)養(yǎng)需求。大豆卵磷脂、維生素E和膽堿作為輔助功能成分，在代謝過(guò)程中可產(chǎn)生部分必須脂肪酸，為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)有助于對(duì)油脂和脂溶性維生素的消化吸收，也有利于緩解機(jī)體的亞健康狀態(tài)；硬脂酸鎂和醫(yī)用胃溶型聚丙烯酸樹(shù)脂4號(hào)有利于制粒，可在體內(nèi)起到潤(rùn)滑的作用，加快腸胃的蠕動(dòng)功能，提高奶牛的食欲。因此，本試驗(yàn)選取以植物甾醇、大豆異黃酮和楊梅素為主要原料制備產(chǎn)后保健顆粒，旨在評(píng)價(jià)對(duì)緩解奶牛產(chǎn)后能量代謝失衡的影響特征。

3.2 保健顆粒對(duì)奶牛血液生化指標(biāo)和發(fā)病率的影響以圍產(chǎn)期能量代謝失衡為病理學(xué)基礎(chǔ)的酮病、脂肪肝是奶牛重要的常見(jiàn)多發(fā)病，且多發(fā)于高產(chǎn)奶牛，肝臟作為高產(chǎn)奶牛在產(chǎn)后最易受到能量代謝失衡和生理應(yīng)激影響的器官，其受損情況可由血清中多種生化指標(biāo)AST、AST/ALT、GGT、LDH和TBIL反映。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，ALT和AST就會(huì)大量釋放到血清中，因此兩者比值A(chǔ)ST/ALT可直接反映肝臟損傷程度[13]。TBIL是反映肝臟排泄分泌和解毒功能有無(wú)損害的指標(biāo)，當(dāng)肝功能受損時(shí)，血清TBIL、GGT和LDH含量會(huì)有不同程度的升高。本試驗(yàn)中，與正常飼喂組相比，飼喂保健顆粒組血清AST、AST/ALT、GGT、LDH和TBIL等各項(xiàng)指標(biāo)含量均在產(chǎn)后顯著降低。另外，GLO、ALB和A/G也是肝功能檢查中的重要參考指標(biāo)，ALB由肝臟合成，一般情況下ALB越多，表明機(jī)體越健康，GLO主要由漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生，作為抗體蛋白在免疫過(guò)程發(fā)揮重要功能。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組飼喂3 d后，ALB和A/G水平高于對(duì)照組，GLO含量顯著降低，說(shuō)明本試驗(yàn)制備的保健顆?？删徑飧喂δ軗p傷，增強(qiáng)泌乳初期奶牛的免疫力和抵抗力。同時(shí)，有研究表明血清AST、NEFA和GLU 3項(xiàng)指標(biāo)可全面評(píng)價(jià)奶牛圍產(chǎn)后期脂肪肝的發(fā)病情況[14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組AST和NEFA水平在產(chǎn)后3～21 d均顯著低于對(duì)照組；而GLU水平在產(chǎn)后3～14 d顯著升高，表明飼喂保健顆?？筛纳聘喂δ軗p傷，為機(jī)體提供能量，降低了體脂的降解，增強(qiáng)了奶牛的免疫力，最終減少奶牛體內(nèi)酮體和脂類(lèi)物質(zhì)的蓄積，可有效的緩解能量代謝病的發(fā)生。

3.3 保健顆粒對(duì)奶牛產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)的影響產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)是一個(gè)比較直觀(guān)體現(xiàn)奶牛健康和代謝平衡的指標(biāo)。酮病和脂肪肝不僅會(huì)造成奶牛產(chǎn)奶量、乳品質(zhì)和繁殖率的降低，還會(huì)增加其他疾病的發(fā)病率。MCART等[15]報(bào)道，與健康奶牛相比，酮病奶牛日產(chǎn)奶量會(huì)減少1.4～1.9 kg/d，并顯著升高乳脂率，降低乳蛋白含量。在本試驗(yàn)中，飼喂保健顆粒組奶牛日產(chǎn)奶量在產(chǎn)后0～9 d略低于對(duì)照組，而在產(chǎn)后10～21 d的產(chǎn)奶量均有所升高；其乳成分中的乳脂率也低于對(duì)照組；試驗(yàn)組乳糖水平顯著升高，但乳蛋白含量差異不顯著。郝振榮等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛日糧中添加適量的大豆黃酮，可緩解奶牛酮病和脂類(lèi)代謝疾病，顯著提高日產(chǎn)奶量及乳蛋白的含量。朱河水等[17]也研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮在一定程度上不但能提高泌乳量，還能提高泌乳后期的產(chǎn)奶量。同時(shí)，植物甾醇可改善肝功能損傷，促進(jìn)產(chǎn)奶量的提高和體細(xì)胞減少[18]。這與本研究中飼喂產(chǎn)后保健顆粒可提高奶牛的日產(chǎn)奶量，增加乳糖含量，降低乳脂率，提高乳品質(zhì)的結(jié)果相符。

3.4 保健顆粒對(duì)奶牛尿液成分的影響尿液是研究疾病標(biāo)志物的理想來(lái)源，相比血液，它具有易獲取、無(wú)創(chuàng)傷的特點(diǎn)，檢測(cè)尿成分指標(biāo)可評(píng)估機(jī)體酸堿平衡和健康狀況。尿液pH值是衡量酸堿平衡的一項(xiàng)重要指標(biāo)，白云龍[19]發(fā)現(xiàn)，健康奶牛尿液pH值常處于7.7～8.7之間。尿液中WBC和VC可反映泌尿系統(tǒng)是否感染，本試驗(yàn)2組奶牛分娩0，3 d均檢測(cè)到了該指標(biāo)的升高，可能與分娩有關(guān)。奶牛酮病的主要癥狀是低血糖和高酮(乳酮、尿酮和血酮)，其中尿液KET也是診斷奶牛酮病的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)。在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組奶牛KET水平在產(chǎn)后7，14，21 d顯著低于對(duì)照組，pH值在產(chǎn)后14 d顯著升高。據(jù)此，綜合評(píng)價(jià)產(chǎn)后奶牛尿液KET和pH值有利于酮病的臨床快速診斷。

3.5 保健顆粒對(duì)奶牛氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響植物甾醇作為類(lèi)固醇化合物，不但可以降低血液中的膽固醇水平，還可用作動(dòng)植物的抗氧化劑。據(jù)報(bào)道適量的植物甾醇可有效提高奶牛的產(chǎn)奶量，顯著降低肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，并提高某些氧化酶活性，達(dá)到抗氧化效果，保護(hù)泌乳初期肝臟損傷[20]。楊麗[21]發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中添加30 mg/kg的植物甾醇，MDA水平降低11.58%，并不同程度地提高了SOD和GSH-Px的含量。黃酮類(lèi)化合物具有很強(qiáng)的抗氧化活性，如清除超氧陰離子和過(guò)氧自由基，同時(shí)能顯著提高SOD和GSH等抗氧化酶的活性。王新軍等[22]也發(fā)現(xiàn)，葛根總黃酮能提高肝臟抗氧化酶活性，促進(jìn)自由基的消除，具有抗氧化和保護(hù)肝損傷的作用。這與本研究結(jié)果相一致，飼喂保健顆粒后可顯著降低奶牛體內(nèi)MDA的含量，同時(shí)顯著提高了SOD和GSH等抗氧化酶的活性，在一定程度上緩解了奶牛泌乳初期氧化應(yīng)激所致的肝損傷。

綜上所述，奶牛產(chǎn)后飼喂以植物甾醇、大豆異黃酮和楊梅素為主要原料制備的產(chǎn)后保健顆粒可以顯著緩解肝損傷，提高抗氧化能力、免疫性能和泌乳性能，最終降低奶牛能量代謝病的發(fā)病率，為規(guī)?；翀?chǎng)奶牛產(chǎn)后保健措施提供了理論依據(jù)。