藺春恒，趙文亮，李珊珊，白士斌，張俊鵬，段 爽，鄭樹貴，張樹義

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有多向分化能力的成體干細(xì)胞，能夠分化為多種細(xì)胞類型，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等[1-3]。MSCs存在于多種組織中，如脂肪組織、臍帶、胎盤、骨骼肌、皮膚和骨髓等[4]。此外，MSCs還能產(chǎn)生具有參與免疫調(diào)節(jié)與再生能力的生長因子和細(xì)胞因子等。目前，在獸醫(yī)領(lǐng)域中已有許多研究表明可以從犬、貓、豬、馬和牛等動物中分離出不同類型的MSCs[4-9]。雖然MSCs可以從多種組織中分離出來，但由于其應(yīng)用廣泛，需求量大，仍需要對其進行體外的擴增培養(yǎng)，以獲得足夠的數(shù)量。MSCs的體外培養(yǎng)有多種分離方法和培養(yǎng)條件，不同的分離方法或培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)試劑、培養(yǎng)容器和培養(yǎng)環(huán)境等)對MSCs的異質(zhì)性均有重要影響[10]。

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)是MSCs擴增的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液成分[11]。FBS為人和動物MSCs的體外培養(yǎng)提供生長因子和許多其他營養(yǎng)物質(zhì)。但是，F(xiàn)BS也可能是外來病原體的來源，并且含有可能引起受體免疫反應(yīng)的血清蛋白[12]。為了克服在MSCs培養(yǎng)中加入FBS的一些缺陷，包括安全性、有效性、一致性和可重復(fù)性，使得使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs的命題很有吸引力[13]。

目前，已有關(guān)于無血清培養(yǎng)基能夠有效支持人、犬和馬的MSCs分離培養(yǎng)的報道[14-15]，但尚未見使用無血清培養(yǎng)兔MSCs相關(guān)研究的報道。兔作為獸醫(yī)領(lǐng)域中常用的一種動物模型，體型適中，脂肪數(shù)量充足[16]。因此，本試驗擬以兔為試驗對象，建立無血清分離培養(yǎng)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs)的完整體系。并采用PCR技術(shù)對兔AD-MSCs進行基因表達(dá)鑒定，觀察兔AD-MSCs在無血清培養(yǎng)基中的生長能力，以及成脂和成軟骨的分化能力，為無血清培養(yǎng)的MSCs在細(xì)胞臨床治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物新西蘭白兔系的健康雌性兔，取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院。動物處理符合機構(gòu)實驗室動物使用指南。

1.2 主要試劑MSCs無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基、MSCs無血清培養(yǎng)基添加劑、干細(xì)胞溫和消化酶和脂肪組織消化酶均購自友康生物公司；干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基試劑盒和干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基試劑盒購自Cyagen公司；RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 主要儀器SW-CJ-1F型超凈工作臺購自蘇凈安泰公司；371型CO2培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司；DKZ-2B型恒溫震蕩水槽購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AE2000型倒置顯微鏡購自Motic公司；ProFle型PCR儀購自Thermo Fisher公司；多功能微孔板酶標(biāo)儀購自Tecan公司。

1.4 原代AD-MSCs的分離培養(yǎng)使用丙泊酚麻醉新西蘭兔，在兔腹股溝處剝離脂肪組織，去除脂肪組織的血管和筋膜，反復(fù)清洗。將脂肪組織剪碎成糊樣狀，1 300 r/min離心5 min。加入與組織等體積的脂肪組織消化酶，37℃震蕩消化40～60 min。加入與脂肪組織消化酶等體積的無血清完全培養(yǎng)基(無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1%無血清培養(yǎng)基添加劑+1%雙抗)終止消化，使用80目的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，將過濾液 1 300 r/min離心5 min，去除上清液。將細(xì)胞沉淀用無血清完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)48 h后進行第1次換液，以后每隔3 d進行1次換液，直至細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%后進行傳代培養(yǎng)。

1.5 AD-MSCs的傳代當(dāng)原代細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時，棄掉原培養(yǎng)基，使用PBS緩沖液清洗細(xì)胞，加入1 mL的干細(xì)胞溫和消化酶進行消化，消化時間為2～5 min。添加2 mL的無血清完全培養(yǎng)基終止消化， 1 300 r/min離心5 min，棄掉上清液。按5 000/cm2接種于T25瓶中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.6 AD-MSCs的生長曲線及群體倍增時間制作分別選取P2代和P5代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以2×104/cm2接種于24孔板，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中。每天隨機選取3個孔進行細(xì)胞計數(shù)，每3 d換1次液，培養(yǎng)8 d。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。細(xì)胞群體倍增時間的計算公式為：PDT=t×[lg2/(lgNt- lgN0)]。其中，t為細(xì)胞培養(yǎng)的時間(單位：h)，Nt是培養(yǎng)t時間后細(xì)胞的數(shù)量，N0是初始接種的細(xì)胞數(shù)量。

1.7 PCR檢測MSCs表面標(biāo)志物基因的表達(dá)提取兔AD-MSCs總RNA，使用酶標(biāo)儀檢測RNA濃度。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并按照表1的引物序列，以cDNA為模板，95℃預(yù)變性2 min；95℃變性25 s，60℃退火30s，72℃延伸30 s，進行35個循環(huán)；72℃延伸5 min；將PCR擴增產(chǎn)物加到1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測CD44、CD45、CD105、CD90和CD73的表面標(biāo)志物基因。

表1 MSCs表面標(biāo)記基因引物序列

1.8 AD-MSCs的成脂誘導(dǎo)分化取P2代兔AD-MSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL并接種到六孔板中，將細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度100%。吸走上清液，加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)21 d后，用甲醛溶液將細(xì)胞固定，油紅O染料進行染色，在倒置顯微鏡下觀察成脂染色效果。

1.9 AD-MSCs的成軟骨誘導(dǎo)分化取P2代兔AD-MSCs，將1×106個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min，去上清，加入0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基的預(yù)混液重懸；重復(fù)上一步驟；將沉淀用0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基重懸，1 500 r/min離心5 min，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。每隔2 d換液，培養(yǎng)21 d后，對軟骨球進行福爾馬林固定和石蠟包埋切片，阿利辛藍(lán)染色，在顯微鏡下觀察成軟骨染色效果。

2 結(jié)果

2.1 兔AD-MSCs的形態(tài)觀察原代培養(yǎng)的細(xì)胞在顯微鏡下觀察可見到各種不規(guī)則形狀。此時的培養(yǎng)基內(nèi)有雜質(zhì)存在，隨著更換培養(yǎng)基或傳代可以逐漸去除。細(xì)胞培養(yǎng)到P3代在顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞呈長梭形或多邊形等，以紡錘形均勻的分布，聚集性生長(圖1)。

A.原代培養(yǎng)96 h(200×)；B.P3代(×200)

2.2 生長曲線及群體倍增時間測定由圖2可知，P3代的MSCs在第1 天時增殖不明顯，第2～5 天進入對數(shù)生長期，第5 天以后進入平臺期；P6代的MSCs在第3～5 天進入對數(shù)生長期。由圖3可知，根據(jù)P3、P6代的細(xì)胞生長曲線可得到兔AD-MSCs的群體倍增時間，分別為(18.38±0.23) h和(21.76±1.28) h。

圖2 兔AD-MSCs生長曲線

圖3 群體倍增時間

2.3 PCR檢測MSCs表面標(biāo)志物基因如圖4所示，兔AD-MSCs表達(dá)CD73、CD90和CD105基因，不表達(dá)其他造血細(xì)胞系的表面標(biāo)記(如CD34與CD45)，結(jié)果符合MSCs的國際鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 PCR驗證細(xì)胞表面標(biāo)記基因表達(dá)

2.4 兔AD-MSCs的成脂和成軟骨分化MSCs經(jīng)成脂分化誘導(dǎo)液21 d誘導(dǎo)后，大部分細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)楸馄降膱A形，細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)許多的脂滴，誘導(dǎo)后的細(xì)胞經(jīng)油紅O染色后，在顯微鏡下觀察，可見AD-MSCs胞質(zhì)中的脂滴被染成紅色(圖5A)。MSCs經(jīng)成軟骨分化誘導(dǎo)液21 d的立體誘導(dǎo)培養(yǎng)后，對軟骨球進行福爾馬林固定和石蠟包埋切片，阿利辛藍(lán)染色，在顯微鏡下觀察可見，軟骨組織中的內(nèi)酸性粘多糖被染成藍(lán)色(圖5B)。

A.油紅O染色(400×)；B.阿利辛藍(lán)染色(×400)

3 討論

MSCs的顯著特征是具有自我更新能力和分化為多種細(xì)胞類型的潛能[20]。MSCs可以通過產(chǎn)生和分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子及生長因子等，對許多不同類型的細(xì)胞發(fā)揮旁分泌作用。因此，可以應(yīng)用于臨床治療方面，特別是在自身免疫性疾病、宿主移植和器官移植等方面，是再生醫(yī)學(xué)和免疫治療領(lǐng)域的新方向[21-22]。雖然FBS作為MSCs體外擴增的一種培養(yǎng)液成分，為人和動物MSCs提供了許多營養(yǎng)物質(zhì)，但是有可能會帶來新的病原感染等問題[13]。因此，為了MSCs在臨床上使用的安全可靠，可以通過在無異種蛋白的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，來減少異種蛋白的免疫反應(yīng)和傳染性疾病的傳播，使用無血清完全培養(yǎng)基來替代含血清完全培養(yǎng)基，將為動物MSCs的治療應(yīng)用提供新的方向。

ZHAN等[23]的研究表明，比較同一代不同來源的5種MSCs，MSCs均呈現(xiàn)長梭形等形狀，聚集成漩渦狀；MSCs的增殖能力均隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸下降，其中AD-MSCs在體外具有較高的增殖活性。本試驗采用無血清培養(yǎng)的方式培養(yǎng)兔AD-MSCs，細(xì)胞呈長梭形或多邊形等不規(guī)則形狀，聚集性生長，鋪滿底面后呈現(xiàn)出漩渦狀；P3代的AD-MSCs具有較強的增值能力和較短的倍增時間，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞增殖能力有所下降。

目前，國際上MSCs的表面標(biāo)記物的鑒定標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)CD73、CD90和CD105等，不表達(dá)CD34、CD45、CD14和CD19等[24]。TIRPAKOVA等[25]結(jié)合流式細(xì)胞儀和PCR方法檢測兔AD-MSCs的標(biāo)記物在mRNA水平上的表達(dá)，結(jié)果顯示兔AD-MSCs表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，符合MSCs的國際鑒定標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)KOVAC等[17]的試驗，對兔羊水來源的MSCs表面標(biāo)志物的基因進行檢測，為了比較表面標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄譜和表面標(biāo)記蛋白的表達(dá)，采用RT-PCR方法對CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和CD166進行了檢測，根據(jù)RT-PCR的結(jié)果，觀察到兔的羊水來源的MSCs標(biāo)記物除了不表達(dá)造血細(xì)胞系的表面標(biāo)記CD45和CD34外，其余標(biāo)記物均有表達(dá)，滿足MSCs的檢測標(biāo)準(zhǔn)。本試驗通過PCR技術(shù)檢測兔AD-MSCs表面標(biāo)記物，結(jié)果表明AD-MSCs表達(dá)CD105、CD90和CD73，但不表達(dá)CD34和CD45。結(jié)合上述的試驗結(jié)果，本試驗采用無血清分離培養(yǎng)的兔AD-MSCs符合MSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

動物MSCs具有多向分化潛能，能夠在體外誘導(dǎo)下分化為多種細(xì)胞類型，如軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。VILLATORO等[26]在試驗中用犬的脂肪組織與骨髓組織分離培養(yǎng)MSCs，并分別在體外進行成脂和成軟骨誘導(dǎo)分化,結(jié)果表明成脂誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞，可觀察到大量的脂滴，脂滴可以被油紅O染料染成紅色；成軟骨誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞，經(jīng)阿利辛藍(lán)染色可以染成藍(lán)色。在本試驗中，對無血清分離培養(yǎng)的兔AD-MSCs分別進行成脂與成軟骨誘導(dǎo)分化，結(jié)果表明成脂誘導(dǎo)21 d后，成脂誘導(dǎo)分化液誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞，可以分化成扁平的圓形，出現(xiàn)大量的脂滴，脂滴可以被油紅O染料染成紅色，說明成功將AD-MSCs誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞；成軟骨誘導(dǎo)21 d后，成軟骨誘導(dǎo)分化液培養(yǎng)的細(xì)胞，誘導(dǎo)分化后細(xì)胞聚集成球狀，對軟骨球進行福爾馬林固定和石蠟包埋切片后可以被阿利辛藍(lán)染成藍(lán)色，說明成功將無血清分離培養(yǎng)的兔AD-MSCs誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞。結(jié)合成脂和成軟骨誘導(dǎo)分化的試驗結(jié)果證明，兔AD-MSCs具有向脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化的潛能。

本試驗結(jié)果表明，無血清分離培養(yǎng)兔AD-MSCs的生物學(xué)特性，與含血清分離培養(yǎng)MSCs的生物學(xué)特性相同，并且避免了血清帶來的安全隱患。無血清分離培養(yǎng)的兔AD-MSCs，具有較強的增殖能力以及成脂和成軟骨的分化能力，AD-MSCs的表面標(biāo)記物鑒定結(jié)果符合國際鑒定標(biāo)準(zhǔn)，能夠為獸醫(yī)臨床治療提供理想的細(xì)胞。