李雪華，崔金忠，焦鵬娜，章金剛,2*，劉興友*

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院 動(dòng)物疫病分子診斷河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所，北京 100850)

砷(arsenic,As)是一種普遍存在于地殼中的類金屬元素，可通過食物、水、呼吸等途徑進(jìn)入人體，對(duì)人類健康造成一定的危害。近年來，砷被證明是內(nèi)分泌干擾物，能夠模仿、阻斷或干擾體內(nèi)的激素，在胎兒、新生兒和成年期間暴露均可干擾生殖器官的發(fā)育并影響精液質(zhì)量和生殖激素的產(chǎn)生[1-2]；且可通過胎盤屏障，導(dǎo)致胎兒在母體內(nèi)暴露砷，從而對(duì)孕婦和胎兒造成不良影響[3-4]。本課題組前期的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕期砷暴露可導(dǎo)致子代雌性小鼠青春期啟動(dòng)時(shí)間提前[5]；另?yè)?jù)報(bào)道，孕期砷暴露可影響宮內(nèi)發(fā)育，導(dǎo)致自然流產(chǎn)、死產(chǎn)和新生兒體質(zhì)量下降[6-7]；雄性大鼠飲用水暴露中劑量(50 mg/L)和高劑量(100 mg /L) 的As2O3后，睪丸質(zhì)量降低，睪丸組織和睪丸內(nèi)生精細(xì)胞受損導(dǎo)致精子質(zhì)量下降、大鼠生育力低下[8]。但是，孕期砷暴露對(duì)子代雄性小鼠精子質(zhì)量影響的報(bào)道較少，故本試驗(yàn)以孕期砷暴露的ICR小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，分別檢測(cè)分析子代雄性小鼠不同發(fā)育階段的臟器系數(shù)、精子活率、精子畸形率、促卵泡生成素(follicle stimulating hormone,FSH)和促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)的變化情況，探討孕期砷暴露對(duì)子代雄性小鼠精子質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器FSH(JM-02838M2)和LH(JM-02865M2)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)購(gòu)于江蘇晶美生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(G1120)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；As2O3(分析純)購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥公司北京采購(gòu)供應(yīng)站；EnSpise酶標(biāo)儀購(gòu)自鉑金埃爾默企業(yè)管理有限公司；Primo Star顯微鏡購(gòu)自Carl Zeiss公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物8周齡的16只雌性和8只雄性ICR小鼠(合格證號(hào)11400700026274)購(gòu)于北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。將雌性ICR小鼠隨機(jī)分為2組(8只/組)：對(duì)照組(去離子水組,C組)和砷暴露組(15 mg/L As (Ⅲ)，As組)，飼養(yǎng)于溫度(21±2)℃、空氣濕度60%～70%及12 h黑暗/12 h光照(每天上午7:00開燈，下午19:00關(guān)燈)的環(huán)境。適應(yīng)1周后，各組小鼠每日20:00按雌性∶雄性=2∶1的比例合籠交配(為防止雄性小鼠暴露砷，交配期間20:00～6:00禁止飲水)，次日清晨6:00 檢查雌鼠的陰道栓，觀察到陰道栓的日期確定為孕期0 d，懷孕后的母鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中。

仔鼠出生當(dāng)天即為出生后0 d，試驗(yàn)組母鼠停止砷暴露，開始飲用去離子水。對(duì)仔鼠進(jìn)行稱重并辨別雌雄數(shù)目，于21日齡斷乳。對(duì)照組和試驗(yàn)組子代雄性小鼠分別在5,8,16周齡3個(gè)階段，隨機(jī)選取6只進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。整個(gè)試驗(yàn)期間小鼠均自由攝取標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料和飲水。

1.3 臟器系數(shù)測(cè)定小鼠禁食12 h后，稱體質(zhì)量，眼球取血放入無菌EP管中，頸椎脫臼處死，腹部消毒后，在冰浴上快速取肝臟、脾臟、腎臟、睪丸和附睪，稱重并計(jì)算臟器系數(shù)。

1.4 精子活率檢測(cè)取右側(cè)附睪尾部分，剪碎，置于37℃、1 mL生理鹽水中30 min，用膠頭滴管反復(fù)吹打，制成精子懸液。用微量移液槍吸取10 μL的精子懸液，緩慢移入紅細(xì)胞計(jì)數(shù)室內(nèi)，蓋上蓋玻片，放置于光學(xué)顯微鏡下，確定目標(biāo)視野，統(tǒng)計(jì)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)5個(gè)不同小方格內(nèi)活精子數(shù)與死精子數(shù)，根據(jù)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法公式計(jì)算精子活率[9]。

精子活率=(5個(gè)小方格活精子數(shù)/5×400)/[(5個(gè)小方格活精子數(shù)+5個(gè)小方格死精子數(shù))/5×400]×100%。

1.5 精子畸形率檢測(cè)微量移液槍吸取10 μL的精子懸液緩慢滴到載玻片上，自然晾干；甲醇固定5 min，然后自然干燥。按照HE染色試劑盒方法進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察畸形精子數(shù)(包括頭部、尾部和頸部畸形等)，每組隨機(jī)觀察不同視野的精子形態(tài)，按公式統(tǒng)計(jì)精子畸形率。精子畸形率=畸形精子數(shù)/檢查精子總數(shù)×100%

1.6 血清激素的測(cè)定小鼠眼球取血后，先于37℃水浴鍋中靜置1 h，然后放入4℃冰箱過夜，高速冷凍離心機(jī)4℃、3 000 r/min離心15 min，分離血清，并用ELISA試劑盒測(cè)定血清中FSH和LH水平。

2 結(jié)果

2.1 孕期砷暴露對(duì)母鼠產(chǎn)子數(shù)及雌雄比例的影響如表1所示，與對(duì)照組相比，母鼠孕期砷暴露對(duì)其產(chǎn)子數(shù)和子代的雌雄比例沒有顯著影響(P>0.05)。

表1 孕期砷暴露對(duì)母鼠產(chǎn)子數(shù)及雌雄比例的影響

2.2 孕期砷暴露對(duì)子代雄性小鼠臟器系數(shù)的影響與對(duì)照組相比，砷暴露組子代雄性小鼠5周齡體質(zhì)量顯著上升(P<0.01)，腎臟系數(shù)顯著下降(P<0.05)；其他各發(fā)育階段的小鼠臟器系數(shù)均無顯著性變化(表2)，表明孕期砷暴露可對(duì)子代雄性小鼠臟器造成一定的影響。

表2 孕期砷暴露對(duì)子代雄性小鼠臟器系數(shù)的影響

2.3 孕期砷暴露對(duì)子代雄性小鼠精子活率的影響取右側(cè)附睪尾制成精子懸液在顯微鏡下觀察，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3，砷暴露組子代雄性小鼠在5周齡和8周齡的精子活率均顯著低于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)，表明母鼠孕期砷暴露可影響子代雄性小鼠的精子活率。

表3 孕期砷對(duì)子代雄性小鼠精子活率的影響 %

2.4 孕期砷暴露對(duì)子代雄性小鼠精子畸形率的影響甲醇固定精子，HE染色后顯微鏡下隨機(jī)觀察不同區(qū)域的精子形態(tài)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。與對(duì)照組相比，8周齡的子代雄性小鼠精子頭部畸形率顯著升高(P<0.05)，表明母鼠孕期砷暴露可影響子代雄性小鼠的精子畸形率。

表4 孕期砷暴露對(duì)子代雄性小鼠精子畸形率的影響 %

2.5 孕期砷暴露對(duì)子代雄性小鼠血清激素的影響用ELISA試劑盒分別測(cè)定不同發(fā)育階段子代雄性小鼠血清中的FSH與LH含量，結(jié)果見圖1。與對(duì)照組相比，砷暴露組在5周齡和16周齡的FSH水平顯著下降(P<0.01,P<0.05)，8周齡略降低，但是無明顯變化(圖1A)；而3個(gè)發(fā)育階段LH水平與對(duì)照組相比無顯著性差異(圖1 B)。

A.對(duì)照組及處理組的FSH變化；B.對(duì)照組及處理組的LH變化

3 討論

本試驗(yàn)所用15 mg/L As (Ⅲ) 的砷質(zhì)量濃度是在項(xiàng)目組前期試驗(yàn)[5]基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，初衷是以人類健康為基礎(chǔ)，模擬人類日常生活的主要攝入方式和劑量。按照世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的水砷標(biāo)準(zhǔn)、美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(Environmental Protection Agency，EPA)修訂的標(biāo)準(zhǔn)及我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委和衛(wèi)生部聯(lián)合頒發(fā)的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，飲水砷的安全質(zhì)量濃度應(yīng)小于10 μg/L，然而很多地方的實(shí)際飲水砷質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于該質(zhì)量濃度，甚至超過5 000 μg/L[10-11]。據(jù)報(bào)道，某些成年人每天攝入砷的量約為50 μg，且人類對(duì)砷的敏感程度為鼠的10～100倍[12]，故本試驗(yàn)確定的砷質(zhì)量濃度是與人類健康息息相關(guān)的。而胎兒和新生兒時(shí)期對(duì)外界因素的干擾較敏感，可擾亂內(nèi)分泌信號(hào)，進(jìn)而引起長(zhǎng)遠(yuǎn)的不良后果；所以本試驗(yàn)選擇胎兒期作為受試時(shí)間，以期為人類的孕期安全防護(hù)提供理論支撐。

砷具有生殖毒性，可對(duì)機(jī)體的生殖健康造成威脅。據(jù)報(bào)道，砷可蓄積于動(dòng)物睪丸組織，致睪丸組織萎縮、質(zhì)量下降、生精細(xì)胞損害[8,13]，對(duì)精子細(xì)胞有致畸作用[13]；通過生殖細(xì)胞變性引起睪丸毒性[14]。孕期砷暴露(85 mg/L)導(dǎo)致子代雄鼠精子生成水平降低、畸形率上升和精子活力下降，且宮內(nèi)砷暴露引起的雄性生殖損傷具有跨代遺傳效應(yīng)[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，砷暴露組的5周齡和8周齡子代雄性小鼠的精子活率與對(duì)照組相比均顯著下降，8周齡的頭部畸形率顯著升高；提示孕期低質(zhì)量濃度砷暴露可影響子代雄性小鼠的精子活率和畸形率。臟器系數(shù)是亞慢性毒性試驗(yàn)中檢測(cè)受試物作用的重要指標(biāo)，本試驗(yàn)中砷暴露組子代雄性小鼠5周齡腎臟系數(shù)顯著下降，表明孕期砷暴露可對(duì)子代雄性小鼠相關(guān)臟器造成一定的影響。另有文獻(xiàn)報(bào)道，砷可使胎盤屏障功能受損，導(dǎo)致子宮高風(fēng)險(xiǎn)暴露于砷；但健康的胎盤積累可能阻止重金屬向胎兒的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低胎兒接觸重金屬的風(fēng)險(xiǎn)[16]；且砷可通過腎臟和腸道緩慢排出體外[17]。故推測(cè)本試驗(yàn)中睪丸質(zhì)量及其他階段子代小鼠的臟器系數(shù)無顯著變化，可能和砷暴露濃度低、機(jī)體代謝或胎盤屏障等因素有關(guān)。

FSH和LH是睪丸發(fā)育和功能所必需的，可調(diào)節(jié)類固醇激素的合成和配子形成，分別通過刺激間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞發(fā)揮重要作用[18-19]。LH可控制睪丸間質(zhì)細(xì)胞中睪酮(testosterone,T)的產(chǎn)生，血漿中LH激素的減少會(huì)損害間質(zhì)細(xì)胞的功能，導(dǎo)致T生成的減少，從而使附睪精子數(shù)量減少[20]。FSH可獨(dú)立影響支持細(xì)胞的增殖、成熟和功能，也可與T協(xié)同作用支持細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)信號(hào)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以維持生殖細(xì)胞的發(fā)育[21]。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)SH可通過支持細(xì)胞中的膜結(jié)合受體為精原細(xì)胞向成熟精子細(xì)胞的發(fā)育提供間接的結(jié)構(gòu)和代謝支持，且在支持細(xì)胞的數(shù)量和維持精子發(fā)生能力方面起著至關(guān)重要的作用，F(xiàn)SH或其受體的減少會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生減少[21-22]。而砷被證明可通過直接作用于雄性腺體或破壞垂體活動(dòng)而影響雄性生殖，導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞分泌雄性激素中斷，致FSH、LH和T水平降低及生精小管中出現(xiàn)生精上皮細(xì)胞層次紊亂[13,23]。另有研究表明，砷可通過提高血漿糖皮質(zhì)激素水平抑制促性腺激素細(xì)胞對(duì)促性腺激素釋放激素的敏感性及降低雄鼠血清中FSH、LH和T的激素水平[14]。本試驗(yàn)中，母鼠孕期砷暴露后，5周齡和16周齡的子代雄性小鼠FSH水平與對(duì)照組相比顯著下降，8周齡略下降但無顯著變化，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論相符；推測(cè)精子活力下降及精子發(fā)生的抑制可能是由于FSH水平降低引起的。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，母鼠孕期砷暴露可導(dǎo)致子代雄性小鼠FSH水平下降、精子質(zhì)量低，影響雄性的生殖健康。但是，具體影響生殖健康的因素較多，如As2O3可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生氧化應(yīng)激，阻礙小鼠的精子成熟和精子發(fā)生，導(dǎo)致生殖毒性[24]，故母鼠孕期砷暴露影響精子發(fā)生機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。