韓 君

(北京康仁堂藥業(yè)有限公司，北京 101301)

去氫松香酸(dehydroabietic acid)與松香酸都是松香的主要成分，來源于松柏、云杉、落葉松和冷杉等針葉類植物[1]。去氫松香酸具有抗炎等生物活性，如：通過PPAR-γ和PPAR-α的雙重激活減輕高脂肪飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗和肝臟脂肪變性[2]；通過激活Keap1/Nrf2-ARE信號(hào)通路來減少非酒精性脂肪肝的鐵死亡[3，4]。文獻(xiàn)鮮有對(duì)其在大鼠體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度的相關(guān)研究。目前，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法因其特異性強(qiáng)、靈敏度高，在血藥濃度定量分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[5-7]。本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法建立測(cè)定大鼠血漿中去氫松香酸的方法并運(yùn)用于大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究，為后續(xù)該化合物的相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和儀器

去氫松香酸(批號(hào)：X28M7B14793，上海源葉生物科技有限公司)；SOLUTOL HS 15(批號(hào)：O21GY164716，上海源葉生物科技有限公司)；去氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：PCS-210816，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)；格列本脲(Sigma-Aldrich公司，美國(guó))。液質(zhì)聯(lián)用儀(島津LCMS8030)。

8只SD雄性大鼠購自杭州醫(yī)學(xué)院，許可證號(hào)為SCXK(浙)2019-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境屏障設(shè)施：實(shí)驗(yàn)室設(shè)施許可證編號(hào)SCXK(浙)2018-0016；飼養(yǎng)溫度保持在20～26 ℃，確保溫度變化不超過4 ℃；濕度控制在40%～70%，避免噪聲刺激，將動(dòng)物房?jī)?nèi)的噪聲控制在60 dB或以下。本實(shí)驗(yàn)使用的大鼠和喂養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》的規(guī)定。

1.2 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱為ODSC18柱(100×2.1 mm,3.5 μm)，柱溫為40 ℃，流動(dòng)相(A，CAN；B，0.1%FA水溶液)。流動(dòng)相梯度：0～0.5 min，60%～5% A；0.5～1 min，5% A；1～2 min，5%～60% A；2～7 min，60% A。流速為0.25 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。每個(gè)樣品檢測(cè)所需時(shí)間為7 min。質(zhì)譜為電噴霧離子源(ESI)，多級(jí)反應(yīng)檢測(cè)(MRM)，負(fù)離子模式。

1.3 溶液制備

分別精密稱取去氫松香酸10 mg，加入甲醇定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液。取去氫松香酸儲(chǔ)備液，用甲醇進(jìn)行梯度稀釋，配制成50、100、200、500、800、1 000、5 000和10 000 ng·mL-1的工作液。取格列本脲儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋為質(zhì)量濃度為200 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。采用去氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度為150、750和7 500 ng·mL-1的去氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 血漿樣本處理

取50 μL血漿，加入150 μL內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋振蕩3 min，14 000 r·min-1離心20 min，取120 μL上清液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)分析。

1.5 專屬性

按照色譜條件，測(cè)定空白大鼠血漿、含內(nèi)標(biāo)和去氫松香酸的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本、只含內(nèi)標(biāo)的空白樣本、灌胃去氫松香酸7 min的血漿樣品、尾靜脈注射去氫松香酸7 min的血漿樣品的離子流色譜圖。

1.6 線性關(guān)系

取空白血漿45 μL，分別加入5 μL去氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成相當(dāng)于去氫松香酸濃度為50、100、200、500、800、1 000、5 000、10 000 ng·mL-1的基質(zhì)樣本，按1.4方法操作。每個(gè)濃度平行處理2份(n=2)，并以權(quán)重因子1/X2進(jìn)行線性回歸。

1.7 精密度與回收率試驗(yàn)

取50 μL空白血漿，加入去氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成去氫松香酸濃度為150、750和7 500 ng·mL-1的質(zhì)控樣本(n=6)。并按1.4方法處理后進(jìn)樣分析，連續(xù)測(cè)定3次，分析結(jié)果通過標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合計(jì)算，用偏差表示準(zhǔn)確度，用變異系數(shù)表示精密度。

分別取空白血漿以及空白血漿加入乙腈提取后的溶液各50 μL，加入去氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成去氫松香酸濃度為150、750和7 500 ng·mL-1的質(zhì)控樣本(n=6)。通過比較常規(guī)質(zhì)控樣品與加入分析物及內(nèi)標(biāo)溶液的提取空白樣品中分析物及內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值，來計(jì)算回收率(用百分比表示)。

1.8 基質(zhì)效應(yīng)

取50 μL空白血漿(基質(zhì))和超純水50 μL，分別加入去氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成相當(dāng)于去氫松香酸濃度為150和750 ng/mL的質(zhì)控樣本(n=6)。用基質(zhì)存在時(shí)的峰面積(A1)與基質(zhì)不存在時(shí)的峰面積(A2)的比值表示分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子(MF)，MF=A1/A2。用分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。

1.9 穩(wěn)定性考察

取50 μL空白血漿，加入格列本脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入去氫松香酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成相當(dāng)于去氫松香酸濃度為150、750和7 500 ng·mL-1的質(zhì)控樣本(n=6)。分別考察空白血漿室溫放置24 h、-80 ℃反復(fù)凍融3次，提取后樣本室溫放置24 h、-80 ℃放置72 h，以及配制的150、750和7 500 ng·mL-1濃度的質(zhì)控樣本室溫放置24 h的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性樣本和新鮮配制的樣本均按1.4方法處理后進(jìn)行進(jìn)樣分析。

1.10 藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

8只SD大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h后隨機(jī)均分為口服給藥組和靜脈注射組兩組?？诜o藥組通過灌胃給藥10 mg·kg-1去氫松香酸，靜脈注射組通過尾靜脈給藥1 mg·kg-1去氫松香酸?？诜o藥組樣品制備方法為稱量去氫松香酸適量，加入0.5%羧甲基纖維素鈉，超聲混懸，配制成相應(yīng)的混懸液。靜脈注射組樣品制備方法為稱量去氫松香酸適量，加入10%二甲基亞砜、20% SOLUTOL HS 15和70%生理鹽水。采血點(diǎn)設(shè)計(jì)如下：口服給藥前及服藥后0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和24 h時(shí)，眼眶后靜脈叢采血300～400 μL，血液轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入EDTA-K2的1.5 mL試管中；靜脈注射前及注射后0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h時(shí)，眼眶采血300～400 μL，血液轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入EDTA-K2的1.5 mL試管中。全血樣品離心10 min(8 000 r·min-1, 4 ℃)，獲取血漿100～200 μL，血漿樣品立即放入-70 ℃冰箱中凍存。整個(gè)樣品處理過程在采血后15 min 內(nèi)完成。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

去氫松香酸保留時(shí)間為4.3 min，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為3.6 min，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾藥物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，內(nèi)標(biāo)物不干擾藥物的測(cè)定，見圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖：空白大鼠血漿(A)、含內(nèi)標(biāo)和去氫松香酸的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本(B)、只含內(nèi)標(biāo)的空白樣本(C)、灌胃去氫松香酸7 min的血漿樣品(D)、尾靜脈注射去氫松香酸7 min的血漿樣品(E)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

去氫松香酸回歸方程y=6.250 9x+1 230.2，線性范圍為50～10 000 ng·mL-1，R2=0.999 6，最低定量下限為30 ng·mL-1。

2.3 精密度與回收率

批內(nèi)和批間精密度誤差均未超過20%，方法總誤差(即相對(duì)偏差絕對(duì)值與變異系數(shù)之和)未超過30%，回收率可達(dá)90%以上，回收率和相對(duì)回收率的變異系數(shù)小于15%。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

由6批基質(zhì)計(jì)算的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)均小于15%。

2.5 穩(wěn)定性

經(jīng)處理的血漿在室溫放置24 h、-80 ℃反復(fù)凍融3次、提取后樣本室溫放置24 h、-80 ℃放置 72 h，以及配置的150、750和7 500 ng·mL-1濃度的質(zhì)控樣本室溫放置24 h仍能保持穩(wěn)定，每份溶液的儀器響應(yīng)值變異系數(shù)在10%之內(nèi)，并且兩份溶液儀器平均響應(yīng)值的差異在±10%之內(nèi)。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果

采用建立并經(jīng)過驗(yàn)證的方法檢測(cè)大鼠血漿中去氫松香酸的濃度，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2，使用WinNolin 6.1軟件分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。由圖2(A)可知，大鼠口服去氫松香酸后，血液中藥物濃度逐漸上升，18 min達(dá)到最大吸收，即達(dá)峰時(shí)間Tmax為(0.3±0.0)h，達(dá)峰濃度Cmax為(4 996.4±958.1)ng·mL-1。由圖2(B)可知，去氫松香酸注射進(jìn)入大鼠體循環(huán)后，6 min血液中藥物濃度即達(dá)最高點(diǎn)，即Tmax為(0.1±0.0)h，Cmax為(5 928.0±803.2)ng·mL-1，并且血藥濃度隨時(shí)間推移逐漸降低。由表1可知，大鼠口服和靜脈注射去氫松香酸的絕對(duì)生物利用度(Fabs)為16.5%。

圖2 大鼠去氫松香酸給藥后血藥濃度-時(shí)間曲線：口服10 mg·kg-1(A)、靜脈注射1 mg·kg-1(B)

表1 大鼠靜脈注射和口服去氫松香酸的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 結(jié)語

劑量確定實(shí)驗(yàn)中，口服灌胃給藥3個(gè)劑量，10 mg·kg-1、100 mg·kg-1和500 mg·kg-1，每個(gè)劑量3只大鼠，連續(xù)觀察大鼠生存狀態(tài)和死亡情況，在14 d的觀察期內(nèi)，沒有大鼠死亡，大鼠的體重也沒有明顯差異。本研究建立的方法靈敏準(zhǔn)確，選擇性好，方法驗(yàn)證都符合生物樣品分析方法的基本要求，適用于大鼠血漿去氫松香酸的藥代動(dòng)力學(xué)研究。