梁思琪，劉保山，宋 歌，鄭 凱，肖 強(qiáng)

(1.湖北民族大學(xué) 林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000)

黃精為百合科(Liliaceae)黃精屬(PolygonatumMill.)植物的總稱，該屬植物迄今已發(fā)現(xiàn)60余種，我國約有31種.2020版《中國藥典》收錄的黃精來源于滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl)、多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua.)和黃精(PolygonatumsibiricumRed.)3個(gè)基源[1-3].湖北黃精(PolygonatumzanlanscianensePamp.)作為黃精屬的一個(gè)基源，該種介于卷葉黃精和黃精之間.研究表明黃精是集藥用、食品、保健于一體的高價(jià)值中草藥，具有補(bǔ)脾、潤(rùn)肺生津、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤的作用[4-6].近年來各地通過野生引種馴化擴(kuò)大栽培導(dǎo)致黃精種質(zhì)混雜、種源良莠不齊，給黃精產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來了嚴(yán)重障礙.鑒于此，許多學(xué)者對(duì)不同來源、不同種質(zhì)的黃精開展了分類與鑒定研究：楊興鑫等[7]建立的PS/AL固相萃取-LC/MS分析方法可用于快速、有效地區(qū)分3種法定基源黃精，在同基源黃精的化學(xué)成分有明顯差異的情況下亦可用于區(qū)分不同基源；王元媛等[8]通過Belousov-Zhabotinski(B-Z)振蕩反應(yīng)研究不同產(chǎn)地多花黃精的鑒別，將多花黃精粉末加入以丙二酸為耗散物的BrO3-+H++Ce4++CH2(COOH)2振蕩體系，用電化學(xué)工作站記錄數(shù)據(jù)，區(qū)分了不同產(chǎn)地的多花黃精，可用于多花黃精的鑒別分類；李松濤等[9]通過液相色譜比較山東泰安黃精和河北黃精的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)二者有顯著差異，該方法可為區(qū)分其他區(qū)域的黃精提供參考.本實(shí)驗(yàn)通過指紋圖譜[10]技術(shù)，利用傅里葉紅外光譜法[11]，采用平均值法[12]建立16批不同種質(zhì)黃精的指紋圖譜，探尋不同種質(zhì)黃精的紅外光譜特征，進(jìn)行相似度分析[13]，并結(jié)合聚類分析[14]與主成分分析[15]，對(duì)不同種質(zhì)黃精進(jìn)行區(qū)分、鑒別，為后續(xù)黃精資源的開發(fā)利用提供有效理論指導(dǎo).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

切片機(jī)(KD0250，廣東陽江膳道機(jī)械有限公司)，流水式高速中藥粉碎機(jī)(LG-20，瑞安市百信制藥機(jī)械有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)(DHG-9203A，上海善志儀器設(shè)備有限公司)，玻璃干燥器(1351-450，廣州誠儀諾儀器)，傅里葉紅外光譜儀(Nicolet iS50 FT-IR，分辨率：中遠(yuǎn)紅外波段小于0.09 cm-1，近紅外波段小于2 nm，光譜范圍：27 000～15 cm-1，Thermo公司).

1.2 材料

采自不同產(chǎn)區(qū)的黃精樣品，均同園栽培24個(gè)月.由湖北省農(nóng)科院中藥材研究所廖朝林研究員鑒定為黃精(P.sibiricum)(S1～S3)、多花黃精(P.cyrtonema)(S4～S8)、滇黃精(P.kingianum)(S9～S11)、湖北黃精(PolygonatumzanlanscianensePamp.)(S12～S16).

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

2 研究方法

2.1 樣品制備

將采摘的不同基源黃精的新鮮根莖除雜、清洗、烘干、粉碎后過40目篩，放入干燥器內(nèi)，實(shí)驗(yàn)室濕度保持30%，二氧化碳濃度正常.

2.2 紅外光譜采集及數(shù)據(jù)預(yù)處理

以KBr為背景累積掃描32次，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次，每次間隔1 h，累計(jì)獲得5個(gè)光譜圖，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，除去基線影響，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)歸一化處理，去除不同樣本間稱量的差異.利用SPSS 23.0進(jìn)行聚類分析和主成分分析.

2.3 方法學(xué)考查

精密度：對(duì)同一樣品進(jìn)行多次掃描，比較所得圖譜的差異，檢測(cè)儀器精密度.取S1樣品進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)測(cè)定5次，所得紅外圖譜的相似系數(shù)在0.999 9～1.000 0，RSD為0.003 7%，表明精密度良好.

穩(wěn)定性：對(duì)同一樣品不同時(shí)間段進(jìn)行多次掃描，比較所得圖譜的差異，確定樣品本身穩(wěn)定性.取S1樣品每隔1 h進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5次，所得紅外圖譜的相似系數(shù)在0.999 9～1.000 0，RSD為0.003 7%，表明穩(wěn)定性良好.

重現(xiàn)性：對(duì)同一樣品制備多份進(jìn)行掃描，比較所得圖譜的差異，確定樣品本身重現(xiàn)性.取S1樣品，按“2.1”條件制備5份，分別進(jìn)行測(cè)定，所得紅外圖譜的相似系數(shù)在0.984 5～0.999 4，RSD為0.56%，表明重復(fù)性良好.

2.4 黃精指紋圖譜的建立

測(cè)定所有黃精樣品的紅外圖譜，將處理后數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 23.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類；再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析，進(jìn)而對(duì)黃精進(jìn)行種質(zhì)鑒別.

圖1 16批黃精樣品紅外圖譜Fig.1 Infrared spectrum of sixteen batches of Polygonatum sibiricum samples

圖2 黃精紅外共有模式指紋圖譜Fig.2 Infrared common mode fingerprint of Polygonatum sibiricum

圖3 不同種質(zhì)黃精相關(guān)系數(shù)Fig.3 Correlation coefficient of Polygonatum sibiricum from different germplasm

3 結(jié)果與分析

3.1 不同種質(zhì)黃精紅外光譜分析

取16批黃精樣品，按“2.2”條件制樣，測(cè)定其紅外光譜圖，保存為CSV文件后，將數(shù)據(jù)輸入Origin 8.0，繪制波數(shù)為橫坐標(biāo)，透過率為縱坐標(biāo)的紅外圖譜，如圖1所示.從圖1中可以看出，16批黃精藥材的紅外圖譜峰形、峰位大致相同，在吸收峰的強(qiáng)弱方面存在一定差異，這表明16批黃精藥材的主要成分相似.

采用平均值法獲得16批藥材的共有模式，如圖2所示.由圖2可知3 373.53、2 913.26、1 735.34、1 638.32、1 420.54、1 130.43、1 126.03、930.37 cm-1為黃精藥材的主要特征峰.在3 373 cm-1處的吸收譜帶寬而強(qiáng)，為O-H伸縮振動(dòng)和N-H伸縮振動(dòng)疊加，主要貢獻(xiàn)物為蛋白質(zhì)和核酸[16]；2 913 cm-1附近為飽和C-H伸縮振動(dòng)，主要貢獻(xiàn)物為脂肪酸化合物；1 735 cm-1附近為C=O伸縮振動(dòng)，主要貢獻(xiàn)物為脂類物質(zhì)；1 200～900 cm-1范圍為多糖吸收區(qū)[17]；890～840 cm-1處為吡喃環(huán)的β異構(gòu)體[18]；540 cm-1附近為其他糖殘基[18].由此可知，黃精紅外光譜主要由蛋白質(zhì)、脂類和糖類等吸收帶組成.

3.2 相似度分析

利用測(cè)定并經(jīng)過處理后的16批黃精紅外數(shù)據(jù)，通過紅外光譜數(shù)據(jù)與共有模式光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行皮爾遜相似度計(jì)算，結(jié)果如圖3所示.

由圖3可以看出，用相似系數(shù)法計(jì)算16批不同種質(zhì)黃精的紅外圖譜與共有模式圖譜的相似度基本在0.900 0以上，最低值是云南文山滇黃精，相似度是0.900 2，但仍具有較高的相似性，表明不同種質(zhì)黃精的一致性較好，主要成分相似；其中黃精相似系數(shù)介于0.971 6～0.989 4，多花黃精相似系數(shù)介于0.979 7～0.994 0，滇黃精相似系數(shù)介于0.900 2～0.990 0，湖北黃精相似系數(shù)介于0.947 6～0.978 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同種黃精樣本間具有較好的相似性，差異較小.

3.3 聚類分析

使用軟件SPSS 23.0 將黃精屬16批不同種質(zhì)黃精的紅外指紋圖譜做系統(tǒng)聚類分析，聚類方法選擇瓦爾德法，區(qū)間選擇歐式距離，得到黃精樹狀圖如圖4所示.

由圖4可知，當(dāng)歐氏距離為5時(shí)，多花黃精、黃精、滇黃精和湖北黃精各聚為1類；表明通過傅里葉紅外光譜法可以快速鑒定不同基源黃精.當(dāng)歐氏距離為15時(shí)，所有黃精樣品聚為2大類，多花黃精單獨(dú)聚為1類，黃精、滇黃精和湖北黃精聚為1類；說明湖北黃精與黃精、滇黃精內(nèi)部質(zhì)量差異較小，且與多花黃精存在一定差異.

圖4 16批黃精樣品聚類分析Fig.4 Cluster analysis of sixteen batches of Polygonatum sibiricum samples

圖5 主成分法分析主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率Fig.5 Cumulative contribution rate of principal components analyzed by principal component method

圖6 不同種質(zhì)黃精的主成分得分散點(diǎn)圖Fig.6 Principal component scores of Polygonatum sibiricum from different germplasm

3.4 主成分分析

主成分分析即利用降維思想，在盡可能多地保留原始變量信息的情況下，通過少數(shù)幾個(gè)主成分揭示多個(gè)變量間的關(guān)系.向SIMCA-14.1 中導(dǎo)入16批黃精樣品紅外光譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行因子分析.主成分法分析主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率如圖5所示.其中PC1、PC2(PC1表示能描述多維數(shù)據(jù)矩陣最明顯的特征，PC2表示除PC1之外能描述多維數(shù)據(jù)矩陣最明顯的特征)累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了81.6%，表明該2個(gè)主要成分包含了原始變量中81.6%以上的信息，即包括了圖譜中的絕大多數(shù)信息.Q2>0.5表明構(gòu)建的模型預(yù)測(cè)能力良好.根據(jù)PC1、PC2繪制主成分得分散點(diǎn)圖如圖6所示.由圖6可知，在主成分得分圖上所有黃精樣品被聚為4類，多花黃精、黃精、滇黃精和湖北黃精各聚為1類，與聚類分析結(jié)果一致.其中黃精、滇黃精和湖北黃精大都聚在PC1得分圖的負(fù)值區(qū)域，說明湖北黃精與黃精、滇黃精的親緣關(guān)系較近；多花黃精位于PC1得分圖的正值區(qū)域，說明湖北黃精與多花黃精存在一定差異.因此，采用主成分分析方法能有效應(yīng)用于不同種質(zhì)黃精植物的生物學(xué)鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià).

4 結(jié)論

利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)16批不同種質(zhì)黃精進(jìn)行紅外光譜指紋圖譜分析，16批黃精樣品的指紋圖譜大致相似，表明不同種質(zhì)黃精均一性較好，親緣關(guān)系較為接近.紅外光譜指紋圖譜顯示，黃精塊莖主要成分為糖類、脂類和蛋白質(zhì)等.進(jìn)一步對(duì)16批黃精樣品進(jìn)行相似度分析，通過計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)可知，同種黃精組內(nèi)樣本間具有較好的相似性，差異較小.通過聚類分析與主成分分析均可將多花黃精、黃精、滇黃精與湖北黃精4種不同種質(zhì)的黃精區(qū)別開來，說明此法能有效地應(yīng)用于黃精屬植物的分類與鑒定；通過聚類分析圖與主成分分析圖還可以得到湖北黃精與黃精、滇黃精的聚類較近，親緣關(guān)系近些；湖北黃精與多花黃精聚類較遠(yuǎn)，存在一定差異，說明此法能有效應(yīng)用于不同種質(zhì)黃精的質(zhì)量評(píng)價(jià).采用傅里葉紅外光譜分析既可以減少對(duì)黃精根莖部分的浪費(fèi)，最大程度保留藥材的原始信息，又可以快速鑒定不同基源的黃精.該法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，可用于對(duì)不同種質(zhì)黃精藥材質(zhì)量的綜合評(píng)定，并為其他種質(zhì)黃精的鑒定提供參考.本文只針對(duì)湖北黃精同3種基源黃精的種質(zhì)鑒定進(jìn)行了研究，有關(guān)黃精屬資源的成分測(cè)定及其活性比較有待于后續(xù)研究.