陳建福

(漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化工學(xué)院，福建 漳州 363000)

紫玉蘭(MagnolialiliifloraDesr.)又名辛夷、木蘭，為中國(guó)特有的喬木類園林植物，在我國(guó)的福建、湖北、云南、廣東、廣西等省(自治區(qū))均有種植[1].紫玉蘭花朵呈紫色，花朵曬干后就是一味藥材“辛夷”，是我國(guó)古籍中記載的一種傳統(tǒng)中藥，可用于風(fēng)寒鼻塞、頭痛等癥[2]，此外，紫玉蘭還含有多酚、萜類、木質(zhì)素、色素、精油等多種天然有效成分[3-4]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域中.多酚是植物體內(nèi)重要的代謝物，植物的根、葉、皮以及生殖器官中大都含有多酚，多酚具有多種有益于人體的功效，如降低患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)、有效抑制自由基氧化反應(yīng)、抑制炎癥發(fā)作、抵抗病毒侵襲等[5]，植物多酚提取已成為天然產(chǎn)物化學(xué)研究的熱點(diǎn)[6].目前，植物多酚的提取主要有傳統(tǒng)提取方式如索氏萃取、熱水浸提及回流提取等，以及現(xiàn)代提取方式如超臨界、超聲輔助、微波輔助等[7].與傳統(tǒng)提取方式能耗大、耗時(shí)長(zhǎng)、提取率低等相比，超聲輔助提取是利用超聲波的空穴、機(jī)械、振動(dòng)等效應(yīng)，擊穿和破壞細(xì)胞壁,使植物組織形成裂縫并在內(nèi)部產(chǎn)熱，以實(shí)現(xiàn)多酚的有效提取并保持多酚生物活性的一種提取方法[8].

目前已有一些植物葉多酚超聲輔助提取的報(bào)道[9]，但還沒(méi)有針對(duì)紫玉蘭葉中多酚提取的研究.目前，紫玉蘭葉大都任其自由落葉且被作為垃圾清理，造成資源的浪費(fèi)，若能對(duì)葉片中的活性成分進(jìn)行合理開(kāi)發(fā)，便可以大大提高紫玉蘭的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值.本文以紫玉蘭葉為原料，先通過(guò)考察4個(gè)單因素對(duì)紫玉蘭葉多酚提取率的影響，再由單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，最終得出紫玉蘭葉多酚的最佳提取條件，并對(duì)紫玉蘭葉的抗氧化活性進(jìn)行探討，為紫玉蘭葉多酚的提取與應(yīng)用提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

紫玉蘭葉，采收于漳州市馬鞍山，選擇鮮嫩、大小均勻的紫玉蘭葉，用水沖洗干凈，烘干后用多功能粉碎機(jī)將紫玉蘭葉碎裂成粉末狀，過(guò)60目的篩網(wǎng)后，置于密封袋中備用.鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、沒(méi)食子酸等均為市售分析純.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫玉蘭葉多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 多酚含量采用福林-酚法測(cè)定[10].取7個(gè)10 mL比色管，分別加入0.5 mL福林-酚試劑，繼續(xù)分別加入系列體積0.1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，靜置1 min，用移液器移取1.5 mL 20%碳酸鈉溶液加入比色管中，定容至10 mL并搖勻后于75 ℃水下恒溫10 min，取出在765 nm波長(zhǎng)下比色，根據(jù)測(cè)定數(shù)據(jù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.100 5x+0.042 7，R2=0.999 3.

1.2.2 紫玉蘭葉多酚的提取及含量的測(cè)定 將一定質(zhì)量m(g)的紫玉蘭葉粉末倒入100 mL圓底燒瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液及適量沸石，超聲波清洗器(KQ-100TDE型，昆山市超聲儀器有限公司)提前設(shè)置一定溫度和時(shí)間，待到達(dá)目標(biāo)溫度后，將圓底燒瓶放入超聲波清洗器中進(jìn)行浸提一定時(shí)間.待超聲結(jié)束后將圓底燒瓶取下，靜置冷卻，濃縮，定容至體積V(mL)，按1.2.1方法進(jìn)行取樣，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-200型，上海美普達(dá)儀器有限公司)測(cè)試提取液中多酚質(zhì)量濃度c(mg/L)并計(jì)算多酚提取率Y(mg/g).

1.2.3 單因素試驗(yàn) 稱取紫玉蘭葉粉末1 g，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，預(yù)先將超聲波清洗器溫度分別設(shè)置為55、60、65、70、75 ℃，達(dá)到目標(biāo)溫度后進(jìn)行超聲處理30 min，得紫玉蘭葉多酚粗提液，做3次重復(fù)，分別計(jì)算提取率.

稱取紫玉蘭葉粉末1 g，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，預(yù)先將溫度設(shè)置為65 ℃的超聲波清洗器中，分別超聲10、20、30、40、50 min，得紫玉蘭葉多酚粗提液，做3次重復(fù)，分別計(jì)算提取率.

稱取紫玉蘭葉粉末1 g，分別加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，預(yù)先將溫度設(shè)置為65 ℃的超聲波清洗器中，超聲處理30 min，得紫玉蘭葉多酚粗提液，做3次重復(fù)，分別計(jì)算提取率.

稱取紫玉蘭葉粉末1 g，分別加入15、20、25、30、35 mL 70%的乙醇溶液，預(yù)先將溫度設(shè)置為65 ℃的超聲波清洗器中，超聲處理30 min，得紫玉蘭葉多酚粗提液，做3次重復(fù)，分別計(jì)算提取率.

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 通過(guò)分析上述單一因素的試驗(yàn)結(jié)果，確定影響紫玉蘭葉多酚提取率4因素的最佳取值影響范圍，以紫玉蘭葉多酚提取率為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，對(duì)提取條件進(jìn)一步優(yōu)化.最后進(jìn)行3組驗(yàn)證性試驗(yàn)，確定最佳工藝條件.

1.2.5 紫玉蘭葉多酚的抗氧化活性測(cè)定

1) DPPH?的清除能力.在一系列比色管中分別加入不同質(zhì)量濃度的紫玉蘭葉多酚溶液2 mL，繼續(xù)加入0.2 mmol/L的DPPH溶液(或無(wú)水乙醇)2 mL，混合并避光反應(yīng)30 min，分別在517 nm處測(cè)得吸光度Ai(或Aj)；以2 mL蒸餾水替代紫玉蘭葉多酚與DPPH溶液混合，測(cè)得吸光度A0，同時(shí)以維生素C替代紫玉蘭多酚為對(duì)照進(jìn)行測(cè)定，DPPH?的清除率(R，%)由下式計(jì)算：

2) ?OH的清除率能力.在一系列比色管中分別加入不同質(zhì)量濃度的紫玉蘭葉多酚溶液2 mL，繼續(xù)加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、9 mmol/L FeSO4溶液1 mL和0.01% H2O2溶液1 mL(或蒸餾水)，混合均勻后避光反應(yīng)60 min，定容，后在510 nm處測(cè)定吸光度Ai(或Aj)；以2 mL蒸餾水替代紫玉蘭葉多酚，測(cè)得吸光度A0，同時(shí)以維生素C替代紫玉蘭葉多酚為對(duì)照進(jìn)行測(cè)定，?OH的清除率(Q，%)由下式計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲溫度對(duì)提取率的影響 如圖1所示，不同的超聲溫度對(duì)紫玉蘭葉多酚提取率的影響較大.當(dāng)超聲溫度在65 ℃時(shí)達(dá)到最大值,這是因?yàn)槿軇┖妥嫌裉m葉顆粒分子的平均動(dòng)能會(huì)隨著體系溫度的升高而增加，增強(qiáng)了多酚類物質(zhì)分子的擴(kuò)散作用，有利于多酚物質(zhì)的提取[11].但超聲溫度過(guò)高會(huì)破壞多酚物質(zhì)中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差的物質(zhì)，對(duì)多酚提取不利.因此最佳的超聲溫度為65 ℃.

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響 如圖2所示，不同的超聲時(shí)間對(duì)紫玉蘭葉多酚提取率的影響較大.當(dāng)超聲時(shí)間在30 min時(shí)達(dá)到最大值,這是因?yàn)橐欢ǖ某曁幚頃r(shí)間，可以促進(jìn)紫玉蘭葉多酚物質(zhì)逐漸被浸提出來(lái)，并溶解于溶劑中，達(dá)到一定時(shí)間時(shí)，多酚基本完全浸出，所以紫玉蘭葉多酚的提取率明顯增加.然而，若超聲處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，提取液中的多酚物質(zhì)與氧氣經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的接觸，會(huì)與氧氣發(fā)生反應(yīng)而減少[12].因此最佳超聲時(shí)間為30 min.

圖1 超聲溫度對(duì)提取率的影響 圖2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction yield

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響 如圖3所示，不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫玉蘭葉多酚提取率的影響較大.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)達(dá)到最大值,這是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)升高，會(huì)使得乙醇水溶液的極性減弱，更容易破壞植物體內(nèi)的氫鍵和疏水作用力，使得多酚提取率增加[13]，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)70%時(shí)，紫玉蘭葉中大量會(huì)與多酚物質(zhì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)溶出的雜質(zhì)被提取出來(lái)，導(dǎo)致多酚溶出減少，提取率下降.因此最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%.

2.1.4 液料比對(duì)提取率的影響 如圖4所示，不同的液料比對(duì)紫玉蘭葉多酚提取率的影響較大.液料比在25 mL/g時(shí)達(dá)到最大值,這是因?yàn)橐毫媳却笥欣诙喾游镔|(zhì)和溶劑充分接觸，溶出的多酚物質(zhì)增多，但液料比過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致濃縮等操作過(guò)程中多酚物質(zhì)的損失[14].因此最佳的液料比為25 mL/g.

2.2 紫玉蘭葉多酚提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面因素及水平 根據(jù)超聲溫度、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比4個(gè)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，確定影響紫玉蘭葉多酚提取率的因素取值范圍如表1所示.以紫玉蘭葉中多酚的提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，共確定29個(gè)試驗(yàn)，其中5個(gè)中心點(diǎn)試驗(yàn)和24個(gè)析因試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3.

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響 圖4 液料比對(duì)提取率的影響 Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction yield Fig.4 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Design of Box-Behnken experiment

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到超聲波輔助提取紫玉蘭葉多酚提取率Y與各考察變量的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及測(cè)定Tab.2 Design and results of response surface methodology

表3 方差分析Tab.3 Results of analysis of variance

Y=44.28+0.22A+1.79B+1.10C-1.37D+0.40AB+0.40AC-2.02AD+

0.85BC-0.34BD-0.25CD-1.79A2-2.52B2-2.92C2-2.04D2.

由表3可知，失擬項(xiàng)P=0.088 8>0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)差異不顯著.回歸模型的F=11.37，P=0.000 1<0.01，表明模型顯著性極高.同時(shí)，該方程相關(guān)系數(shù)R2=0.919 2，說(shuō)明此回歸模型可用來(lái)分析91.92%的紫玉蘭葉中多酚提取率的變化，且擬合狀況良好，可以用來(lái)對(duì)紫玉蘭葉中多酚提取率進(jìn)行分析、預(yù)測(cè).通過(guò)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)B、C、D，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2，交互項(xiàng)AD的P值都小于0.01，說(shuō)明這幾項(xiàng)對(duì)紫玉蘭葉多酚提取率影響極顯著，其余各項(xiàng)對(duì)紫玉蘭葉多酚提取率影響不顯著，因此，試驗(yàn)因素并不是通過(guò)簡(jiǎn)單的線性關(guān)系影響紫玉蘭葉中多酚的提取率.F值越大，該因素對(duì)多酚提取的影響越顯著，因此通過(guò)表3中F值大小比較，可判斷出影響紫玉蘭葉多酚提取的順序?yàn)椋撼晻r(shí)間(B)>液料比(D)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)>超聲溫度(A).

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析 由圖5所示，當(dāng)超聲溫度一定時(shí)，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，超聲溫度的影響趨勢(shì)亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用不顯著.

(a) 超聲溫度與超聲時(shí)間的響應(yīng)面圖 (b) 超聲溫度與超聲時(shí)間的等高線圖圖5 超聲溫度與超聲時(shí)間的交互作用Fig.5 Interaction between ultrasonic temperature and time

由圖6所示，當(dāng)超聲溫度為一定時(shí)，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，超聲溫度的影響趨勢(shì)亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用不顯著.

(a) 超聲溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)的響應(yīng)面圖 (b) 超聲溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線圖圖6 超聲溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用Fig.6 Interaction between ultrasonic temperature and ethanol concentration

由圖7所示，當(dāng)超聲溫度為一定時(shí)，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當(dāng)液料比一定時(shí)，超聲溫度的影響趨勢(shì)亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用極顯著.

由圖8所示，當(dāng)超聲時(shí)間為一定時(shí)，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，超聲時(shí)間的影響趨勢(shì)亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用不顯著.

由圖9所示，當(dāng)超聲時(shí)間為一定時(shí)，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當(dāng)液料比一定時(shí)，超聲時(shí)間的影響趨勢(shì)亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用不顯著.

由圖10所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為一定值時(shí)，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當(dāng)液料比一定時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響趨勢(shì)亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用不顯著.

(a) 超聲溫度與液料比的響應(yīng)面圖 (b) 超聲溫度與液料比的等高線圖圖7 超聲溫度與液料比的交互作用Fig.7 Interaction between ultrasonic temperature and liquid-to-material ratio

(a) 超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的響應(yīng)面圖 (b) 超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線圖圖8 超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用Fig.8 Interaction between ultrasound time and ethanol concentration

(a) 超聲時(shí)間與液料比的響應(yīng)面圖 (b) 超聲溫度與液料比的等高線圖圖9 超聲時(shí)間與液料比的交互作用Fig.9 Interaction between ultrasonic time and liquid-to-material ratio

(a) 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的響應(yīng)面圖 (b) 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的等高線圖圖10 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互作用Fig.10 Interaction between ethanol concentration and liquid-to-material ratio

2.3 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證

根據(jù)Design-Expert 8.0.6b軟件計(jì)算得到最佳的參數(shù)為超聲溫度67.62 ℃、超聲時(shí)間34.96 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)73.23%和液料比21.72 mL/g，其理論上的紫玉蘭葉多酚提取率為45.41 mg/g.考慮到實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件，將條件取整為超聲溫度68 ℃、超聲時(shí)間35 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)73%、液料比22 mL/g.進(jìn)行3組驗(yàn)證性試驗(yàn)，計(jì)算平均值得出紫玉蘭葉多酚提取率為44.76 mg/g，與理論上的提取率相對(duì)誤差只有1.43%，證明了該模型可應(yīng)用于紫玉蘭葉多酚的提取.

2.4 紫玉蘭葉多酚的抗氧化活性分析

2.4.1 多酚對(duì)DPPH?的作用效果 通過(guò)考察紫玉蘭葉多酚對(duì)DPPH?的作用效果來(lái)確定其抗氧化能力，如圖11所示.從圖11中可知，紫玉蘭葉多酚對(duì)DPPH?的作用效果隨著紫玉蘭葉多酚質(zhì)量濃度的增加而增大，而當(dāng)質(zhì)量濃度大于120 mg/L時(shí)，對(duì)DPPH?的清除率增加不再明顯.紫玉蘭葉多酚對(duì)DPPH?清除率的半抑制濃度(IC50)為57.65 mg/L，當(dāng)紫玉蘭葉多酚質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，對(duì)DPPH?的清除率達(dá)到77.25%，為維生素C清除率的94.28%，說(shuō)明紫玉蘭葉多酚能較好地對(duì)DPPH?進(jìn)行清除，具有一定的抗氧化活性.

2.4.2 多酚對(duì)?OH的清除作用 通過(guò)考察紫玉蘭葉多酚對(duì)?OH的作用效果來(lái)確定其抗氧化能力，如圖12所示.從圖12中可知，紫玉蘭葉多酚對(duì)?OH的作用效果隨著紫玉蘭葉多酚質(zhì)量濃度的增加而增大，而當(dāng)質(zhì)量濃度大于300 mg/L時(shí)，對(duì)?OH的清除率增加不再明顯.紫玉蘭葉多酚對(duì)?OH清除率的IC50為114.26 mg/L，當(dāng)紫玉蘭葉多酚質(zhì)量濃度為250 mg/L時(shí)，對(duì)?OH的清除率達(dá)到80.53%，為維生素C清除率的93.28%，說(shuō)明紫玉蘭葉多酚能較好地對(duì)?OH進(jìn)行清除，具有一定的抗氧化活性.

圖11 多酚對(duì)DPPH?的清除作用 圖12 多酚對(duì)?OH的清除作用Fig.11 Scavenging effect of polyphenols on DPPH? Fig.12 Scavenging effect of polyphenols on ?OH

3 結(jié)論

以紫玉蘭葉為原料，考察了4個(gè)單因素對(duì)紫玉蘭葉多酚提取率的影響，再由單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，最終得出紫玉蘭葉多酚的最佳提取條件為：超聲溫度為68 ℃、超聲時(shí)間為35 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為73%、液料比為22 mL/g.在此工藝下得到的紫玉蘭葉多酚提取率為44.76 mg/g，與理論上的提取率45.41 mg/g之間的相對(duì)誤差只有1.43%，說(shuō)明了該回歸模型合理，能較可靠地預(yù)測(cè)紫玉蘭葉多酚的提取率.紫玉蘭葉多酚對(duì)DPPH?和?OH均具有一定的清除能力，其IC50分別為57.65 mg/L和114.26 mg/L，該研究為紫玉蘭葉多酚及其資源的開(kāi)發(fā)與利用提供了方向.