王夢(mèng)迪 郭弋凡，2 龐彥余 劉羽飛,2 趙文景*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科，北京 100010；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎臟病(end stage renal disease, ESRD)的重要病因[1]。如何有效延緩DKD進(jìn)展是目前中西醫(yī)治療的瓶頸。蛋白尿是DKD的重要臨床特征之一，也是DKD患者腎功能進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，DKD患者一旦出現(xiàn)臨床水平蛋白尿，腎功能損傷將持續(xù)進(jìn)展，進(jìn)入ESRD的速度可達(dá)其他腎臟病變的14倍[2]。足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分，其損傷與蛋白尿的發(fā)生和DKD進(jìn)展密切相關(guān)[3]。氧化應(yīng)激在DKD發(fā)生和進(jìn)展中的作用已被研究[4]證實(shí)，在糖尿病或高血糖狀態(tài)下，以活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)為主的活性分子生成增多，抗氧化物質(zhì)減少，過(guò)量ROS在細(xì)胞內(nèi)積聚，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激可以通過(guò)多種途徑及信號(hào)通路損傷足細(xì)胞，引起足細(xì)胞凋亡、脫落等各種病理改變[5]。然而臨床研究[6]顯示，單純抗氧化治療在延緩DKD進(jìn)展中的療效卻差強(qiáng)人意，因此有必要對(duì)足細(xì)胞氧化損傷機(jī)制進(jìn)行深入研究。線粒體作為細(xì)胞ROS的主要來(lái)源，近年來(lái)在DKD發(fā)病中的作用引起了廣泛關(guān)注，其在足細(xì)胞氧化損傷中的作用值得進(jìn)一步探討。本課題組前期臨床研究[7-8]表明，保腎通絡(luò)方能夠有效減少DKD患者尿蛋白、改善腎功能，在實(shí)驗(yàn)研究[9]中也證實(shí)，保腎通絡(luò)方能夠有效減少糖尿病小鼠及高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞損傷。本研究旨在觀察保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞氧化損傷的影響，并探討其對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用與改善線粒體自噬的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

永生化小鼠足細(xì)胞株MPC5，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院劉寶利教授贈(zèng)送，細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)邁阿密大學(xué)Jochen Reiser教授。

1.1.2 藥物與試劑

保腎通絡(luò)方飲片(生黃芪、熟地黃、菟絲子、鬼箭羽、劉寄奴、水蛭、丹參)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。RPMI-1640無(wú)糖培養(yǎng)基(貨號(hào)11879-020，美國(guó)Gibco公司)、RPMI-1640含糖培養(yǎng)基(貨號(hào)11875-093，美國(guó)Gibco公司)、胎牛血清(貨號(hào)C04001-500，以色列Biological Industries公司)、干擾素-γ(interferon-γ,INF-γ)(貨號(hào)315-05-20，美國(guó)Pepro Tech公司)、PBS 緩沖液(貨號(hào)KGB5001，凱基生物)、CCK-8試劑盒(貨號(hào)CK04，日本同仁化學(xué))、活性氧檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)MAK145，美國(guó)Sigma公司)、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)C2006，碧云天公司)、鬼筆環(huán)肽-FITC(貨號(hào)P5282，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)、線粒體紅色熒光探針Mito Tracker?Red CMXRos(貨號(hào)8778P，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)、Alexa Fluor 594驢抗兔IgG(貨號(hào)A32754，美國(guó)Invitrogen公司)、足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin抗體ab216341，美國(guó)Abcam公司)、自噬相關(guān)蛋白5(autophagy-related protein 5，ATG5)抗體(貨號(hào)ab108327，美國(guó)Abcam公司)、ATG7抗體(貨號(hào)ab52472，美國(guó)Abcam公司)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體(貨號(hào)ab19289，美國(guó)Abcam公司)、GAPDH抗體(貨號(hào)10494-1-AP，美國(guó)Proteintech公司)等。

33 ℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，37 ℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)、熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、普通熒光顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司)、激光共聚焦顯微鏡(日本Leca公司)、Western blotting 化學(xué)發(fā)光儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀 MK3(美國(guó)Thermo公司)、流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman coulter公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清制備

選取雄性SPF級(jí)SD大鼠40只(動(dòng)物倫理批件號(hào):BUCM-4-2020121804-4173)，體質(zhì)量為(180±20)g，數(shù)字表法隨機(jī)分為保腎通絡(luò)方組和空白對(duì)照組，分別用于制備含藥血清及空白血清，每組20只。其中保腎通絡(luò)方組按照20倍臨床劑量進(jìn)行灌胃，空白組給予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃結(jié)束后2 h，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊巴比妥鈉按照40 mg/kg 劑量麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，56 ℃水浴30 min后無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，分裝凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 足細(xì)胞培養(yǎng)與分組

MPC5于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中傳代，并于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞到70%～80%融合時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)。具體分組如下：正常對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖+空白血清)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖+空白血清)、保腎通絡(luò)方組(30 mmol/L葡萄糖+保腎通絡(luò)方含藥血清)，然后進(jìn)行細(xì)胞收集或固定，用于以下實(shí)驗(yàn)，各組試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)足細(xì)胞活力

將MPC5以2 000個(gè)/孔接種至96孔板中，每孔100 μL，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，按上述分組分別培養(yǎng)48 h后加入10 μL/孔CCK-8反應(yīng)液，于37 ℃孵育箱反應(yīng)2 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm的吸光度值并按照說(shuō)明書(shū)計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4 鬼筆環(huán)肽染色

我現(xiàn)在只好用性的方式來(lái)證明我的愛(ài)，證明我對(duì)她有強(qiáng)烈的進(jìn)取心。而這一點(diǎn)恰恰成了她嘲笑我的地方。她甚至在我們做愛(ài)的間隙，也對(duì)我的真誠(chéng)表示出懷疑。她是這樣說(shuō)的，你這么亢奮，是不是裝的？要不就是吃了偉哥？我大聲斥責(zé)說(shuō)，我靠！你就這么埋汰我?。课揖烤鼓狞c(diǎn)對(duì)不起你，讓你這么瞧不起我？白麗筠斜吊起眼睛瞥向天花板說(shuō)，你跟你的姓葉的女朋友，是不是也這么嗨？我想起跟葉靄玲的交媾，遠(yuǎn)沒(méi)有這么多的激情，但我沒(méi)有回答她。心想，你有什么權(quán)利過(guò)問(wèn)我與葉靄玲的關(guān)系呢？要知道你自己曾經(jīng)有過(guò)那么多的男人！

將MPC5以8 000個(gè)/孔接種到24孔板上，按上述方法分組培養(yǎng)48 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定，0.2%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100透膜，3%(體積分?jǐn)?shù))驢血清封閉，鬼筆環(huán)肽-FITC 1 μg/mL染色，封片，避光4 ℃保存。熒光顯微鏡觀察和拍攝具有代表性的圖像。

1.2.5 免疫熒光

將MPC5以8 000個(gè)/孔接種到24孔板上，經(jīng)上述方法分組處理48 h后，Mitotracker紅色熒光標(biāo)志物標(biāo)記線粒體，綠色熒光標(biāo)記自噬蛋白LC3-Ⅱ，共聚焦激光顯微鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)及LC3-Ⅱ與線粒體共標(biāo)的表達(dá)情況。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)

將MPC5以30 000個(gè)/孔接種于6孔板上，經(jīng)上述方法分組處理48 h后，按照活性氧檢測(cè)試劑盒及JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.2.7 Western blotting法檢測(cè)蛋白

將RIPA裂解液加入收集的足細(xì)胞中，冰上裂解30 min，離心后取上清，BCA法定量蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，將等量的蛋白加入孔槽中電泳，電泳結(jié)束后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜[LC3B(1∶2 000)、P62(1∶1 000)、ATG5(1∶2 000)、ATG7(1∶100 000)、Nephrin(1∶1 000)；GAPDH(1∶5 000)為內(nèi)參]。洗膜，二抗搖床室溫孵育1 h，ECL試劑暗室內(nèi)膠片曝光，顯影，Image J軟件分析各條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖條件下足細(xì)胞活力的影響

CCK-8法檢測(cè)不同組別足細(xì)胞活力，采用不同高濃度葡萄糖(20～60 mmol/L)干預(yù)足細(xì)胞，結(jié)果表明，30 mmol/L高糖干預(yù)48 h足細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05，圖1A)，與含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的足細(xì)胞比較，5%～12%的保腎通絡(luò)方含藥血清干預(yù)后足細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1B)。而繼續(xù)升高血清濃度，足細(xì)胞活力則顯著下降。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組足細(xì)胞活力顯著降低，加入8%保腎通絡(luò)方含藥血清可明顯恢復(fù)高糖條件下足細(xì)胞活力(P<0.01，圖1C)。

圖1 不同濃度葡萄糖及保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)足細(xì)胞活力的影響

2.2 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞氧化損傷的作用

鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組足細(xì)胞骨架褶皺呈多邊形，應(yīng)力纖維束被破壞，保腎通絡(luò)方含藥血清能夠恢復(fù)正常的細(xì)胞骨架(圖2A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組足細(xì)胞ROS水平，結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組足細(xì)胞ROS水平顯著升高，保腎通絡(luò)方含藥血清可降低高糖刺激的ROS生成(P<0.01)(圖2B,C)。Western blotting結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組足細(xì)胞Nephrin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而保腎通絡(luò)方含藥血清可部分恢復(fù)足細(xì)胞Nephrin蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)(圖2D)。

圖2 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)足細(xì)胞骨架及氧化損傷的影響

2.3 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞線粒體自噬的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組足細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白ATG5、ATG7下調(diào)(P<0.01)，LC3Ⅱ/Ⅰ比值下降(P<0.05)，與高糖組相比，保腎通絡(luò)方組ATG5、ATG7蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01，P<0.05)，LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高(P<0.05)(圖3A)。共聚焦顯微鏡顯示各組足細(xì)胞線粒體與LC3B免疫熒光共標(biāo)情況，與正常組相比，高糖組線粒體MitoTracker和自噬蛋白LC3共標(biāo)減少；而保腎通絡(luò)方含藥血清干預(yù)可使足細(xì)胞線粒體與LC3B共標(biāo)增多(圖3B)。JC-1熒光探針進(jìn)行足細(xì)胞染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組足細(xì)胞線粒體膜電位水平，紅色熒光標(biāo)記線粒體膜電位正常足細(xì)胞，綠色熒光標(biāo)記為線粒體膜電位下降的足細(xì)胞，結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組紅色/綠色熒光標(biāo)記的足細(xì)胞比值明顯降低(P<0.01)；與高糖組相比，保腎通絡(luò)方組紅色/綠色熒光標(biāo)記的足細(xì)胞比值顯著升高(P<0.01)(圖3C,D)。以上結(jié)果表明，保腎通絡(luò)方含藥血清改善高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞線粒體自噬障礙并減輕其線粒體損傷。

圖3 保腎通絡(luò)方含藥血清對(duì)足細(xì)胞線粒體自噬及線粒體膜電位的影響

3 討論

線粒體是細(xì)胞能量代謝的樞紐，而作為能量需求最為旺盛的器官之一，腎臟是除心臟外線粒體含量最為豐富的器官。線粒體功能障礙在DKD足細(xì)胞損傷中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[10]，研究[11]表明，糖尿病小鼠足細(xì)胞存在明顯線粒體損傷，長(zhǎng)時(shí)間高糖刺激使足細(xì)胞線粒體呼吸鏈活性下降，線粒體DNA拷貝數(shù)明顯降低，足細(xì)胞數(shù)量減少。在本研究中筆者同樣發(fā)現(xiàn)高糖在導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的同時(shí)，引起了足細(xì)胞線粒體功能障礙，主要表現(xiàn)為線粒體數(shù)目減少、線粒體膜電位受損。在線粒體中，主要依靠呼吸鏈復(fù)合物從還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADPH)/還原型黃素腺嘌呤二核苷酸(reduced flavin adenine dinucleotide, FADH2)接受電子進(jìn)行傳遞，并由復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ向膜間隙泵出H+從而形成線粒體膜電位，并由此與三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)合成酶相偶聯(lián)，最終在ATP合成酶作用下使二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)磷酸化生成ATP，因此，線粒體膜電位的形成是正常氧化磷酸化反應(yīng)的重要前提，在這一過(guò)程中，線粒體呼吸鏈也會(huì)有少量的電子漏出，生成少量ROS，作為細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物，在生理情況下會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)及時(shí)清除。在糖尿病或高血糖狀態(tài)下，盡管代謝底物的增加產(chǎn)生更多的NADH/FADH2，但由于線粒體功能障礙導(dǎo)致電子不能正常傳遞而漏出，過(guò)量ROS不能被及時(shí)清除，從而造成氧化應(yīng)激損傷[12]。高血糖導(dǎo)致線粒體生成過(guò)量ROS對(duì)其他細(xì)胞器造成氧化損傷的同時(shí)，也可對(duì)線粒體本身的脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和核酸等造成損傷，導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而進(jìn)入氧化損傷的惡性循環(huán)狀態(tài)[13-14]。因此，除直接針對(duì)ROS進(jìn)行抗氧化治療外，恢復(fù)線粒體功能，也可能是修復(fù)DKD足細(xì)胞損傷的重要靶點(diǎn)[15]。

線粒體自噬是通過(guò)自噬-溶酶體途徑，選擇性清除受損或不需要的線粒體，是細(xì)胞維持線粒體穩(wěn)態(tài)極為重要的自我調(diào)節(jié)機(jī)制。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí)，可激活自噬清除異常線粒體以維持線粒體穩(wěn)態(tài)，若病情進(jìn)一步加重，受損線粒體過(guò)量積聚，線粒體自噬障礙導(dǎo)致受損的線粒體不能及時(shí)清除，最終造成足細(xì)胞受損[16]。LC3是自噬標(biāo)記蛋白，參與自噬泡的生成[17]。當(dāng)自噬激活時(shí)，LC3-Ⅰ脂質(zhì)化形成LC3Ⅱ，LC3-Ⅱ與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合并定位在胞內(nèi)自噬體膜上；與此同時(shí)，自噬相關(guān)蛋白12(autophagyrelated protein 12，ATG12)與ATG7作用后進(jìn)而同ATG5發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成ATG5-ATG12復(fù)合物，該復(fù)合物再與ATG16、LC3Ⅱ結(jié)合形成更復(fù)雜的ATG5-ATG12-ATG16-LC3Ⅱ復(fù)合物，最終與自噬體膜相結(jié)合，包裹受損的線粒體，形成線粒體自噬體被溶酶體識(shí)別吞噬，啟動(dòng)線粒體降解程序，完成線粒體自噬過(guò)程[18]。研究[19]表明，持續(xù)的高血糖狀態(tài)，會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞線粒體自噬能力明顯降低，且抑制線粒體自噬，會(huì)加重糖尿病小鼠足細(xì)胞損傷。在本研究中筆者也發(fā)現(xiàn)高糖刺激下自噬相關(guān)蛋白ATG5、ATG7、LC3 Ⅱ/Ⅰ表達(dá)下降，LC3B與線粒體共標(biāo)減少。

繼承全國(guó)名老中醫(yī)、首都國(guó)醫(yī)名師張炳厚教授學(xué)術(shù)思想，本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為“腎失封藏，腎絡(luò)閉阻”是DKD發(fā)病的核心病機(jī)，基于此，筆者以“益腎通絡(luò)”立法，在張勝容教授經(jīng)驗(yàn)方保腎系列方(保腎方、改良保腎方Ⅱ號(hào))基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，增強(qiáng)通絡(luò)作用，組方為保腎通絡(luò)方。方中以黃芪補(bǔ)氣益腎為君，熟地填補(bǔ)腎精為臣，二者合用益腎氣，補(bǔ)腎精，鬼箭羽、劉寄奴、丹參、菟絲子為佐，鬼箭羽、劉寄奴、丹參合用活血通經(jīng)、祛瘀生新，菟絲子味甘澀精固腎，味辛又可發(fā)散通經(jīng)，使補(bǔ)而不滯，水蛭蟲(chóng)蟻入腎絡(luò)為使，咸苦并行、破血利水。全方通澀共施，以通入脈，以澀固精，合以辛潤(rùn)通絡(luò)、蟲(chóng)蟻通絡(luò)，使瘀血得除，絡(luò)脈得通而腎臟得補(bǔ)，精微得固，共奏“益腎澀精，活血通絡(luò)”之功。本研究顯示，保腎通絡(luò)方含藥血清可使高糖刺激的足細(xì)胞活力恢復(fù)、骨架結(jié)構(gòu)改善，足細(xì)胞標(biāo)志蛋白nephrin升高，ROS生成減少，說(shuō)明保腎通絡(luò)方含藥血清能夠減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞氧化損傷。進(jìn)一步研究表明，保腎通絡(luò)方干預(yù)可恢復(fù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞線粒體膜電位，使自噬相關(guān)蛋白ATG5、ATG7表達(dá)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高且LC3B與線粒體共定位增加，提示中藥復(fù)方保腎通絡(luò)方能夠改善線粒體自噬障礙，減輕足細(xì)胞線粒體損傷。

綜上所述，足細(xì)胞氧化損傷與線粒體功能障礙、線粒體自噬受損密切相關(guān)，保腎通絡(luò)方可改善高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞改善線粒體自噬障礙，清除受損線粒體，恢復(fù)線粒體功能，可能是保腎通絡(luò)方改善足細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制，但其具體的作用通路和靶點(diǎn)仍需要進(jìn)一步深入探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明王夢(mèng)迪、趙文景：提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案；王夢(mèng)迪、郭弋凡、龐彥余、劉羽飛：進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采集、分析數(shù)據(jù)和繪制圖表；王夢(mèng)迪：論文撰寫(xiě)；趙文景：總體把關(guān)、審定論文。