張景臣，李 新，李江濤，李海平，陳艷麗，牛 冰，祁川川，葉貝貝

鄭州人民醫(yī)院乳腺科，河南 鄭州 450053

乳腺癌作為在全球女性中最為常見的惡性腫瘤，盡管目前其診斷及治療取得了極大的進步，但患者預后情況仍不能令人滿意，其中，轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因之一，極大地降低了療效，因此，全面了解乳腺癌的進展和轉(zhuǎn)移機制對改善患者預后具有重要作用［1］。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）包括長鏈ncRNA（long ncRNA，lncRNA）及微小RNA（micro RNA，miRNA）等，lncRNA可作為miRNA海綿來調(diào)控后者表達，兩者已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中失調(diào)，與腫瘤惡性生物學行為具有密切相關(guān)性［2-3］。LINC02163被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌［4］、結(jié)直腸癌［5］等癌癥中異常上調(diào)，將其敲除可抑制乳腺癌細胞的惡性行為［4］，目前關(guān)于其在乳腺癌中的相關(guān)機制研究甚少。有研究［6］證實，miR-338-3p在乳腺癌組織中呈低表達狀態(tài)，抑制其表達可增強乳腺癌細胞（MCF7、HCC1937）生長、遷移及侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程。LINC02163對乳腺癌細胞惡性生物學行為的促進是否與其靶向調(diào)控miR-338-3p表達有關(guān)值得探究，因此，本研究通過探究LINC02163靶向miR-338-3p對乳腺癌細胞增殖、侵襲及遷移的影響，以期為闡明乳腺癌的發(fā)生機制提供線索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

將從河南省實驗動物中心購買的25只6周齡BALB/c裸小鼠［19～22 g，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級］飼養(yǎng)于保持12 h晝夜交替的環(huán)境中7 d，許可證號：SCXK（豫）2017－0001。

1.2 試劑和儀器

MCF-10 A、MCF-7、BT-20、MDA-MB-231、T47D細胞系（A2789、SG2226、A2874、ATCC-Y2455、SY4472）購自上海酶研生物科技有限公司，sh-NC、sh-LINC02163、inhibitor-NC、miR-338-3p inhibitor購自廣州市銳博生物科技有限公司，LipofectamineTM2000 Transfection Reagent（11668-019）購自上海偉進生物科技有限公司，DMEM 培養(yǎng)基（PM150210）購自武漢益普生物科技有限公司，二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白檢測試劑盒（mlE3254）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，雙熒光素酶檢測試劑盒（Omt-03）購自北京奧秘佳得醫(yī)藥科技有限公司，兔抗β-actin、c-Myc、E-鈣粘素（E-cadherin）、N-鈣粘素（N-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP9抗體、羊抗兔免疫球蛋白G H&L［辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記］（ab8227、ab32072、ab40772、ab18203、ab37150、ab38898、ab6721）購自英國Abcam公司，MTT檢測試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（M1020-500、RP1105）購自北京索萊寶科技有限公司，組織化學試劑盒（G1210）購自上海經(jīng)科化學科技有限公司，兔源抗體Ki-67（100 μg、0.8～1.04 mg/mL，ab15580）購自英國Abcam公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）試劑盒（QPG-020～QPG-023）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Gentier 48E/48R RTFQPCR檢測系統(tǒng)（FQD-96A）購自西安天隆科技有限公司，SH-520凝膠成像系統(tǒng)購自杭州申花科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 臨床組織樣本獲取

收集鄭州人民醫(yī)院2020年1月—2021年9月收治的9例女性乳腺癌患者的乳腺癌組織及距癌組織2 cm外的癌旁組織樣本，患者年齡40～60歲，平均（45.68±3.05）歲。本研究經(jīng)鄭州人民醫(yī)院倫理委員會批準且患者及家屬均簽署知情同意書。通過RTFQ-PCR檢測組織中的LINC02163表達。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

在DMEM培養(yǎng)基中接種人正常乳腺上皮細胞系（MCF-10A）和乳腺癌細胞系（MCF-7、BT-20、MDA-MB-231、T47D），于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合度為80%。

1.3.3 分組及轉(zhuǎn)染

以2×105個/孔將MDA-MB-231細胞接種到6孔板中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，將其分為control組、sh-NC組、sh-LINC02163組、sh-LINC02163+inhibitor-NC組和sh-LINC02163+miR-338-3p inhibitor組，使用LipofectamineTM2000試劑盒將sh-NC、sh-LINC02163、inhibitor-NC和miR-338-3p inhibitor分別轉(zhuǎn)染至相應(yīng)組的MDAMB-231細胞中，48 h后采用RTFQ-PCR檢測LINC02163及miR-338-3p表達。

1.3.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治鯨INC02163與miR-338-3p的靶向關(guān)系

采用starBase2.0網(wǎng)址預測LINC02163與miR-338-3p的結(jié)合位點；擴增LINC02163上與miR-338-3p結(jié)合的片段，插入pmirGLO載體：構(gòu)建野生型LINC02163-wt質(zhì)粒；采用基因突變技術(shù)對結(jié)合位點進行突變，構(gòu)建突變型LINC02163-mut質(zhì)粒。將MDA-MB-231細胞分為LINC02163-wt+miR-338-3p mimics組、LINC02163-wt+miRNC組、LINC02163-mut+miR-338-3p mimics組和LINC02163-mut+miR-NC組，將miR-NC、miR-338-3p mimics、LINC02163-wt和LINC02163-mut分別共轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細胞中，24 h后檢測海腎及螢火蟲熒光素酶值，計算MDA-MB-231細胞的相對熒光素酶活性。

1.3.5 RTFQ-PCR檢測LINC02163及miR-338-3p表達

使用TRIzol試劑提取乳腺癌組織樣本及MCF-10A、MCF-7、BT-20、MDA-MB-231、T47D細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后行RTFQPCR擴增（GAPDH作為LINC02163內(nèi)參，U6作為miR-338-3p內(nèi)參），引物見表1，用2-??Ct分析LINC02163及miR-338-3p的表達水平（n=5）。

表1 RTFQ-PCR引物Tab.1 RTFQ-PCR primers

1.3.6 MTT法檢測MDA-MB-231細胞活力

收集各組MDA-MB-231細胞按2.5×104個/孔接種到96孔板中，48 h后按20 μL/孔添加5 mg/mL MTT溶液溫育4 h，吸去培養(yǎng)液后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（150 μL）振蕩搖晃，待結(jié)晶消失后用酶標儀測定細胞490 nm處的吸光度（D）值，細胞存活率（%）=［（實驗組D值-空白組D值）/（對照組D值-空白組D值）］×100%，重復5孔。

1.3.7 Transwell實驗檢測MDA-MB-231細胞侵襲

使用Matrigel 基質(zhì)膠將上室包被24 h后，于上室接種各組MDA-MB-231細胞懸液（1×104個/孔），下室添加DMEM培養(yǎng)基500 μL，培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，使用無菌棉簽將上室未穿膜的細胞擦去，下層細胞經(jīng)過多聚甲醛溶液固定后進行結(jié)晶紫染色（30 min），在倒置顯微鏡下隨機觀察5個視野，并對穿膜細胞進行計數(shù)（n=5）。

1.3.8 劃痕實驗檢測MDA-MB-231細胞遷移

收集MDA-MB-231細胞接種在6孔板中（2×105個/孔），培養(yǎng)24 h，用移液槍吸嘴（200 μL）于6孔板底部劃痕，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗，測量劃痕間距，記為d0h，24 h后再次測量間距，記為d24h，計算遷移率=（d0h-d24h）/d0h］×100%，重復5孔。

1.3.9 Western blot檢測MDA-MB-231細胞c-Myc、MMP2、MMP9、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達

采用RIPA試劑裂解MDA-MB-231細胞后提取總蛋白，通過BCA法定量分析蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后將所分離的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，封閉2 h 后添加兔抗c-Myc、β-actin、MMP2、MMP9、E-cadherin和N-cadherin抗體（1∶1 000），搖床上溫育過夜后添加二抗（1∶3 000）溫育2 h，電化學發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）顯色，凝膠系統(tǒng)曝光，計算c-Myc、MMP2、MMP9、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達（n=5）。

1.3.10 體內(nèi)成瘤實驗

在BALB/c裸小鼠腋下分別注射各組MDAMB-231細胞（2×107個），每周測量1次：腫瘤體積（mm3）=0.5×腫瘤最長徑×腫瘤最短徑2，飼養(yǎng)30 d后處死裸小鼠，取瘤體并稱重（n=5）。體內(nèi)成瘤實驗經(jīng)鄭州人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3.11 免疫組織化學法檢測裸小鼠腫瘤組織的Ki-67增殖指數(shù)

取1.3.10的腫瘤組織進行常規(guī)石蠟切片制作，經(jīng)脫蠟及水化后，添加3%的H2O2以去除內(nèi)源性的過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液對抗原進行熱修復后封閉（牛血清白蛋白）20 min，Ki-67一抗溫育1 h，溫育生物素標記的二抗30 min，依次進行二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）液染色、蘇木精復染，HCl分化、脫水、透明及觀察（×200），Ki-67陽性細胞呈棕褐色（n=5）。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 LINC02163在乳腺癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達比較

與癌旁組織相比，LINC02163在乳腺癌組織中的表達顯著升高（1.00±0.06vs1.92±0.20）（n=9，t=13.218，P＜0.05，圖1）。

圖1 LINC02163在乳腺癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達比較Fig.1 Comparison of the expression of LINC02163 in breast cancer and corresponding adjacent tissues

2.2 LINC02163在人正常乳腺上皮細胞系（MCF-10A）和乳腺癌細胞系（MCF-7、BT-20、MDA-MB-231、T47D）中的表達水平比較

與MCF-10 A 細胞（1.01±0.09）相比，LINC02163在MCF-7、BT-20、MDAMB-231和T47D細胞中的表達均顯著升高，分別為1.40±0.11、1.62±0.24、2.06±0.32和1.51±0.16，并且其在MDA-MB-231細胞中升高最為顯著（P＜0.05），因此取MDA-MB-231細胞進行后續(xù)實驗。

2.3 LINC02163與miR-338-3p靶向關(guān)系的驗證

采用starBase網(wǎng)址預測LINC02163與miR-338-3p間存在結(jié)合位點，詳見圖2。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與LINC02163-wt+miRNC組相比，MDA-MB-231細胞熒光素酶活性在LINC02163-wt+miR-338-3p mimics組中顯著降低（0.89±0.09vs0.41±0.05，P＜0.05），而在LINC02163-mut+miR-338-3p mimics組、LINC02163-mut+miR-NC組中無顯著變化（0.87±0.09vs0.88±0.10，P＞0.05）。

圖2 LINC02163與miR-338-3p結(jié)合位點Fig.2 Binding site of LINC02163 and miR-338-3p

2.4 各組MDA-MB-231細胞中LINC02163及miR-338-3p表達水平的比較

與control組相比，LINC02163及miR-338-3p表達在sh-NC組中無顯著變化（P＞0.05），sh-LINC02163組LINC02163表達顯著降低，miR-338-3p表達顯著升高（P＜0.05）。與sh-LINC02163組相比，LINC02163及miR-338-3p表達在sh-LINC02163+inhibitor-NC組中無顯著變化（P＞0.05），sh-LINC02163+miR-338-3p inhibitor組LINC02163表達無顯著變化（P＞0.05），miR-338-3p表達顯著降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組MDA-MB-231細胞中LINC02163及miR-338-3p表達水平的比較Fig.3 Comparison of LINC02163 and miR-338-3p expression levels in MDA-MB-231 cells in each group

2.5 各組MDA-MB-231細胞存活率的比較

與control組相比，MDA-MB-231細胞存活率在sh-NC組中無顯著變化（P＞0.05），在sh-LINC02163組中顯著降低（P＜0.05）。與sh-LINC02163組相比，MDA-MB-231細胞存活率在sh-LINC02163+inhibitor-NC組中無顯著變化（P＞0.05），在sh-LINC02163+miR-338-3p inhibitor組中顯著增加（P＜0.05，圖4）。

圖4 各組MDA-MB-231細胞存活率的比較Fig.4 Comparison of MDA-MB-231 cell survival rate in each group

2.6 各組MDA-MB-231細胞侵襲能力的比較

與control組相比，MDA-MB-231細胞侵襲細胞數(shù)在s h-N C 組中無顯著變化（P＞0.05），在sh-LINC02163組中顯著降低（P＜0.05）。與sh-LINC02163組相比，侵襲細胞數(shù)在sh-LINC02163+inhibitor-NC組中無顯著變化（P＞0.05），在sh-LINC02163+miR-338-3p inhibitor組中顯著增加（P＜0.05，圖5）。

圖5 各組MDA-MB-231細胞侵襲能力的比較Fig.5 Comparison of the invasion ability of MDA-MB-231 cells in each group

2.7 各組MDA-MB-231細胞遷移能力的比較

與control組相比，MDA-MB-231細胞遷移率在sh-NC組中無顯著變化（P＞0.05），在sh-LINC02163組中顯著降低（P＜0.05）。與sh-LINC02163組相比，細胞遷移率在sh-LINC02163+inhibitor-NC組中無顯著變化（P＞0.05），在sh-LINC02163+miR-338-3p inhibitor組中顯著增加（P＜0.05，圖6）。

圖6 各組MDA-MB-231細胞遷移能力的比較Fig.6 Comparison of MDA-MB-231 cell migration ability in each group

2.8 各組MDA-MB-231細胞c-Myc、MMP2、MMP9、E-cadherin和N-cadherin蛋白水平的比較

與control組相比，MDA-MB-231細胞c-Myc、MMP2、MMP9、E-cadherin和N-cadherin蛋白水平在sh-NC組中無顯著變化（P＞0.05），c-Myc、MMP2、MMP9和N-cadherin水平在sh-LINC02163組中顯著降低，E-cadherin水平顯著增加（P＜0.05）。與sh-LINC02163組相比，c-Myc、MMP2、MMP9、E-cadherin和N-cadherin水平在sh-LINC02163+inhibitor-NC組中無顯著變化（P＞0.05），c-Myc、MMP2、MMP9和N-cadherin水平在sh-LINC02163+miR-338-3p inhibitor組中顯著增加，E-cadherin水平顯著降低（P＜0.05，表2，圖7）。

圖7 各組MDA-MB-231細胞蛋白水平的比較Fig.7 Comparison of MDA-MB-231 cell protein level in each group

表2 各組MDA-MB-231細胞c-Myc、MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的比較Tab.2 Compare of c-Myc,MMP2,MMP9,E-cadherin,and N-cadherin protein expression in each group of MDA-MB-231 cells

2.9 各組MDA-MB-231細胞成瘤能力及移植瘤組織Ki-67增殖指數(shù)的比較

與control組相比，腫瘤體積及重量、Ki-67增殖指數(shù)在sh-NC組中無顯著變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在sh-LINC02163組中顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與sh-LINC02163組相比，腫瘤體積及重量、Ki-67增殖指數(shù)在sh-LINC02163+inhibitor-NC組中無顯著變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在sh-LINC02163+miR-338-3p inhibitor組中顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖8）。

圖8 各組MDA-MB-231細胞成瘤能力及Ki-67增殖指數(shù)的比較Fig.8 Comparison of tumor-forming ability and Ki-67 proliferation index of MDA-MB-231 cells in each group

3 討論

隨著生活節(jié)奏的加快及工作壓力的增加，乳腺癌的發(fā)生率也在逐漸升高，盡管近年來患者的生存率明顯提高，預后也明顯改善，但術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移仍是患者死亡的主要原因［7-8］，乳腺癌患者整體5年生存率約為90%，而轉(zhuǎn)移患者5年生存率僅為26%，因此，闡明乳腺癌的潛在轉(zhuǎn)移機制，尋找新的治療靶點對患者生存至關(guān)重要［9］。

長度大于200個核苷酸的lncRNA作為一類來自基因組非編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄本，被發(fā)現(xiàn)可調(diào)節(jié)癌癥的許多重要病理學過程，如腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移及抗藥性［10］。LINC02163是近幾年新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，盡管被發(fā)現(xiàn)在胃癌［11］、結(jié)直腸癌［12］、肝癌［13］及乳腺癌［4］中具有明顯的促癌作用，但其機制仍不完全清楚。LINC02163可通過抑制miR-511-3p/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）3軸促進結(jié)直腸癌進展，而抑制其表達則可減弱癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移［12］。LINC02163在乳腺癌組織中表達上調(diào)，其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤大小密切相關(guān)，在體外抑制LINC02163表達可降低MDA-MB-231及MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲并增加細胞凋亡，這可能與其激活miR-511-3p/高遷移率族蛋白A2（high mobility group A2，HMGA2）軸有關(guān)［4］。EMT是細胞由上皮極性向間充質(zhì)細胞特性轉(zhuǎn)化的過程，該過程中由于E-cadherin表達降低，而N-cadherin表達增加，可降低細胞間的黏附作用，從而促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，LINC02163在乳腺癌組織及細胞系中表達顯著升高，抑制其表達可顯著降低MDA-MB-231細胞存活率、侵襲細胞數(shù)及遷移率、c-Myc、MMP2、MMP9、N-cadherin表達、裸小鼠移植瘤體積及重量、腫瘤組織中的Ki-67增殖指數(shù)，增加E-cadherin表達，與之前的研究［4］一致，本研究結(jié)果表明，LINC02163表達降低可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移及EMT過程，其可作為乳腺癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移機制研究的潛在靶點。

有研究［15］顯示，miRNA在癌癥中失調(diào)，可充當腫瘤抑制因子或癌基因參與癌癥進程。miR-338-3p可在胃癌中通過直接靶向SOX5并阻斷Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號轉(zhuǎn)導來充當腫瘤抑制因子［16］。Zhang等［17］研究發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系（BCAP-37和HCC1937）中表達降低，Hsa_circ_0008945可通過靶向抑制miR-338-3p表達來促進同源框A3（homeobox A3，HOXA3）表達，從而加快乳腺癌進程。黃芩苷可通過促進miR-338-3p表達來抑制MORC4表達，從而抑制MCF-7及MDAMB-231細胞活力、遷移及侵襲，并促進細胞凋亡［18］。本研究證實在乳腺癌中miR-338-3p是LINC02163的靶基因，LINC02163過表達可抑制miR-338-3p表達，因此，LINC02163可能通過靶向miR-338-3p促進乳腺癌細胞增殖、侵襲及遷移。本研究還發(fā)現(xiàn)，LINC02163表達沉默可促進miR-338-3p表達，而降低miR-338-3p表達可逆轉(zhuǎn)LINC02163低表達對MDA-MB-231細胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移及EMT過程的抑制作用，表明LINC02163低表達可能是通過促進miR-338-3p表達來抑制乳腺癌細胞的惡性生物學行為。

綜上所述，LINC02163低表達可通過促進miR-338-3p表達來抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲及遷移。本研究不僅有助于闡明LINC02163在乳腺癌中的作用機制，還為尋找新的治療靶點提供了線索，但仍需深入研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。