葛珍珍，許明月，趙玉翔，趙光遠，縱 偉,

（1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450001；2.河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，河南鄭州 450001；3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450001）

杜仲（Oliv）是我國特有的名貴滋補藥材和珍稀樹種，主要分布在陜西、甘肅、四川、河南等秦嶺以南地區(qū)。杜仲籽油作為新資源食品，含有多種功能性的營養(yǎng)成分，但其在生產(chǎn)時，大量籽粕遭到丟棄，不僅對環(huán)境造成污染，而且導致大量營養(yǎng)素和功能因子的流失。杜仲籽粕的蛋白含量高達35.98%，含有18種氨基酸，人體必需氨基酸含量占總氨基酸的32.3%，是一種新型的植物蛋白來源，但其高回收價值尚未得到重視。

目前，綠豆多肽、大豆多肽、鷹嘴豆多肽等植物源多肽因其具有較好的抗氧化性而備受關注，并且已有較多新型的抗氧化肽，如紅花籽抗氧化肽、菠蘿蜜種子蛋白肽、木薯葉片多肽等被開發(fā)出來。黃群等通過酶解制備的杜仲籽粕抗氧化肽對超氧陰離子自由基清除率最高可達56.6%；葛珍珍等前期發(fā)現(xiàn)，杜仲籽粕蛋白經(jīng)消化酶體外消化的產(chǎn)物對 DPPH·、ABTS·和·OH的清除率分別可達63.34%、58.16%、71.11%。因此，通過不同方法制備得到的杜仲籽粕水解肽的抗氧化能力有所不同，但是否能以不同的評判指標得到抗氧化性更強的水解肽還有待進一步探究。

綜上，本文以杜仲籽粕為原料，通過響應面試驗優(yōu)化酶解制備杜仲籽粕水解肽的工藝條件，在此工藝基礎上選取DPPH、超氧陰離子以及ABTS三種自由基的清除率對杜仲籽粕水解肽的體外抗氧化性進行研究，旨在為提高杜仲籽粕附加價值，杜仲籽粕蛋白的功能性開發(fā)及其水解肽在功能性產(chǎn)品中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲籽粕 中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所；酸性蛋白酶（50 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒 上海源葉生物科技有限公司；2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） Sigma 公司；其余試劑均為分析純。

PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；HC-3618R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；SPARK多模式酶標儀 奧地利Tecan有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵 鄭州杜普儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲籽粕蛋白提取 按照葛珍珍等的方法提取蛋白。稱取杜仲籽粕20 g，按料液比1:15（杜仲籽粕質量（g）與水體積（mL）的比例）混合均勻，用1 mol/L NaOH溶液調pH至10，在40 ℃的水浴鍋中浸提1.5 h，9000 r/min離心15 min，得上清用1 mol/L HCl溶液調 pH至 4.2，靜置 30 min，9000 r/min離心15 min后，將沉淀用少量的蒸餾水復溶，調其pH至中性，冷凍干燥得到杜仲籽粕蛋白粉（純度為70.03%）。

1.2.2 蛋白酶的篩選 選擇酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶分別對杜仲籽粕蛋白進行初步水解。水解條件為酶添加量6000 U/g、底物質量濃度30 g/L，在不同蛋白酶的最適酶解溫度和pH條件下（表1），水解3 h，以總抗氧化能力和水解度為評價指標，綜合篩選出具有抗氧化且水解度相對較高的蛋白酶，進行下一步實驗。

表1 不同蛋白酶酶解試驗條件Table 1 Test conditions for enzymatic hydrolysis of different proteases

1.2.3 酶解單因素實驗 選取中性蛋白酶為最適水解酶，在該酶的最適溫度（45 ℃）和 pH（7.5）下，設定其單因素水解的基本條件為：酶添加量為6000 U/g，酶解時間為2.5 h，底物濃度為40 g/L。改變其中一個條件，固定其他條件并分別考察酶添加量、酶解時間及底物濃度對總抗氧化能力和水解度的影響。各個因素水平梯度分別為：酶添加量 2000、4000、6000、8000、10000 U/g；酶解時間1.5、2、2.5、3、3.5 h；底物濃度 10、20、30、40、50 g/L。酶解結束后，沸水浴滅酶10 min，然后離心、取上清液，測定其總抗氧化能力和水解度，通過比較確定各因素酶解工藝最適的條件。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素實驗上，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，以總抗氧化能力和水解度的總評歸一值（OD）為響應值，選取酶添加量、酶解時間、底物濃度作為響應因子，利用Design Expert軟件進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設計，試驗因素及水平見表2。

表2 Box-Behnken 試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 總抗氧化能力（T-AOC）測定 用T-AOC檢測試劑盒進行測定。將ABTS溶液和氧化劑等體積混合配制成ABTS工作液。臨用前，用蒸餾水將ABTS工作液稀釋至在405 nm處的吸光度為1.4±0.05。用蒸餾水將Trolox溶液（10 mmol/L）稀釋至0.05、0.15、0.3、0.6、0.9、1、1.2、1.5 mmol/L。取200 μL ABTS工作液再分別加入5 μL的酶解液，混勻，室溫放置6 min，測定405 nm下的吸光值，帶入標準曲線方程（y=-1.1833x+1.5175，=0.994）算出樣品的總抗氧化能力。

1.2.6 水解度測定 參考PENAS等的鄰苯二甲醛法，取400 μL酶解液與3 mL鄰苯二甲醛法OPA試劑迅速混勻，避光反應2 min，以未水解樣品做空白對照，測定340 nm處的吸光值，按照下式計算水解度（degree of hydrolysis，DH）。

式中：ΔA為水解樣品的吸光度與未水解樣品的吸光度的差值；d為稀釋倍數(shù)；c為蛋白質質量濃度，g/L。1.2.7 計算總評歸一值OD 以總抗氧化能力和水解度為指標，采用Hassan法處理歸一化，單指標評價值（d）和總評歸一值（OD）按照下列公式進行換算：

式中：d表示單指標評價值，d表示總抗氧化能力指標評價值，d表示水解度指標評價值，Y表示指標中第i個值，Y表示指標中最小值，Y表示指標中最大值。

1.2.8 杜仲籽粕水解肽的體外抗氧化試驗

1.2.8.1 DPPH自由基清除率測定 參考YANG等的方法，并進行一定的調整。將杜仲籽粕水解物配成質量濃度分別為 0.02、0.04、0.08、0.2、0.4、0.8、2、4、6、8 mg/mL的溶液。在試管中依次加入150 μL上述濃度的酶解液及150 μL的DPPH乙醇溶液（0.6 mmol/L），振蕩混勻后，在室溫條件下避光靜置30 min，測定517 nm處的吸光值。

式中：A為加樣品與DPPH乙醇溶液時的吸光度；A為加樣品與無水乙醇時的吸光度；A為無水乙醇與DPPH乙醇溶液時的吸光度。

1.2.8.2 超氧陰離子自由基清除率測定 參考楊永濤的方法，并進行一定的調整。配制質量濃度分別為 0.2、0.4、0.8、2、4、6、8 mg/mL的樣品溶液。在試管中加入4.5 mL Tris-HCl緩沖溶液（pH為8.2，濃度為 0.05 mol/L），2.5 mL 的蒸餾水，30 ℃ 水浴20 min。然后加入1.5 mL不同濃度樣品溶液，以及0.5 mL的鄰苯三酚溶液（25 mmol/L），快速搖勻，于 30 ℃水浴反應 8 min后，立即滴加 0.1 mL的HCl（8 mmol/L）終止反應，測定320 nm處的吸光值。

式中：A為加樣品時的吸光度；A為用蒸餾水代替鄰苯三酚溶液時的吸光度；A為用蒸餾水代替樣品時的吸光度。

1.2.8.3 ABTS自由基清除率的測定 參考ZILIC等的方法，并進行一定的調整。配制質量濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.2、0.4、0.8、2、4、6、8 mg/mL的樣品溶液。將ABTS溶液（7 mmol/L）和過硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L）按照 1:1 體積比混合均勻，避光放置12 h。取上述混合液，用無水乙醇調其吸光度在734 nm處為0.70±0.02，即得ABTS工作液。取0.4 mL樣品溶液，加入ABTS工作液4.0 mL，靜置反應5 min后，測定734 nm處的吸光度。

式中：A為加樣品時的吸光度；A為用蒸餾水代替ABTS工作液時的吸光度；A為用蒸餾水代替樣品時的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均進行3組平行實驗，數(shù)據(jù)采用平均值±標準差的形式表示，采用SPSS22.0和 Origin Expert8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。顯著性差異用單因素方差分析法（one-way ANOVA）進行表示（＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由圖1可知，中性蛋白酶酶解液的總抗氧化能力最高，其次是酸性蛋白酶、堿性蛋白酶；而堿性蛋白酶對杜仲籽粕蛋白的水解度最高，其次是中性蛋白酶、酸性蛋白酶。不同的蛋白酶具有特定的酶切位點，從而得到不同肽鏈組成的酶解產(chǎn)物，所以其生物活性也存在較大差異。本研究中，中性蛋白酶處理后的OD值最大，綜合考慮酶解液的水解度和抗氧化活性，本實驗選擇中性蛋白酶為最適作用酶。

圖1 不同蛋白酶對杜仲籽粕蛋白水解肽T-AOC和水解度（A）、OD 值（B）的影響Fig.1 Effects of different proteases on T-AOC, degree of hydrolysis (A) and OD value (B) of Eucommia ulmoides seed meal protein hydrolysate

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 酶添加量的影響 由圖2可知，在測量范圍內，酶解液的總抗氧化能力呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢。當酶添加量為8000 U/g時，總抗氧化能力達到24.03 μmol/g，達到最大值；而當酶添加量為4000 U/g時，水解度達到最大值，為55.7%。這可能是由于隨著酶量的增加，酶和底物達到飽和，其水解度達到最大值，隨著酶量繼續(xù)增加，過多的酶將抗氧化能力較低的肽段進一步水解，從而得到抗氧化性較好的多肽。綜合兩者得到的OD值，與總抗氧化能力呈現(xiàn)相同的趨勢。因此，確定酶添加量為8000 U/g。

圖2 酶添加量對杜仲籽粕蛋白水解肽T-AOC和水解度（A）、OD 值（B）的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on T-AOC, hydrolysis degree(A) and OD value (B) of Eucommia ulmoides seed meal protein hydrolysate

2.2.2 酶解時間的影響 由圖3可知，在酶解時間為1.5～3.5 h內，酶解液的水解度和總抗氧化能力均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢。當酶解時間為2 h時，總抗氧化能力達到最大值18.92 μmol/g，繼續(xù)增加酶解時間，底物逐漸被轉化而導致酶解速率下降，生成的活性肽被進一步水解，從而導致酶解液的總抗氧化能力降低。酶解時間為2.5 h時，其水解度達到最大值52%。綜合考慮酶解液的總抗氧化能力和水解度的大小，確定酶解時間為2 h。

圖3 酶解時間對杜仲籽粕蛋白水解肽T-AOC和水解度（A）、OD 值（B）的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on T-AOC, hydrolysis degree(A) and OD value (B) of Eucommia ulmoides seed meal protein hydrolysate

2.2.3 底物濃度的影響 由圖4可知，隨著底物濃度的增加，總抗氧化能力和水解度均先增加后降低，其中底物濃度20 g/L時，總抗氧化能力為29.3 μmol/g，達到最大值，水解度為36.4%。在底物濃度為30 g/L時其水解度為53.4%，相較前者有所增加，之后逐漸降低。這是因為在底物濃度較低時，隨著底物濃度的增加，酶和底物結合速率也隨之增加，當酶和底物達到飽和后，繼續(xù)增加底物濃度，會對酶與底物的反應起到抑制作用。而總抗氧化能力先增加后降低，這是因為隨著水解度的增加使多肽暴露出更多的活性基團，但過高的水解度會破壞活性肽的結構，從而使總抗氧化性降低。綜合考慮酶解液的總抗氧化能力和水解度的大小，確定底物濃度為20 g/L。

圖4 底物濃度對杜仲籽粕蛋白水解肽T-AOC和水解度（A）、OD 值（B）的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on T-AOC, hydrolysis degree (A) and OD value (B) of Eucommia ulmoides seed meal protein hydrolysate

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 中心組合試驗結果 根據(jù)前述實驗設計方案，選擇酶添加量（A）、酶解時間（B）、底物濃度（C）三個因素為考察指標，以總抗氧化能力和水解度的總評歸一值（OD）為響應值，利用Origin-Expert8.0.6軟件對響應結果進行多元回歸擬合，建立的二次響應面回歸方程如下：OD=0.33+0.10A+0.041B-0.20C-0.10AB-0.028AC+0.078BC+0.085A+0.10B-0.054C。

從實驗結果（表3）和方差分析（表4）可以看出，模型極顯著（=0.0026＜0.01），說明模型較為穩(wěn)定，失擬項不顯著（=0.1509＞0.05），說明方程擬合性良好，即回歸方程模型有顯著意義。決定系數(shù)為0.9312，即響應值的變化有93.12%與所選變量有關系，說明模型擬合程度良好，能夠較準確地預測和分析實際情況；模型的校正決定系數(shù)為0.8427，說明不確定因素對實驗結果的干擾較小，該模型與數(shù)據(jù)擬合度良好，即回歸方程模型適合杜仲籽粕多肽制備工藝的分析與預測。模型的一次項A、C極顯著（＜0.01），交互項 AB、二次項 B差異顯著（＜0.05）。對比各因素的值大小可知，在三個因素中，按照對結果的影響排序，底物濃度（C）＞酶添加量（A）＞酶解時間（B）。

表3 響應面設計及結果Table 3 Response surface design and results

表4 回歸方程模型的顯著性檢驗及方差分析Table 4 Explicitness test and variance analysis of regression equation model

2.3.2 響應面模型驗證 通過對響應面優(yōu)化工藝結果擬合分析得出：中性蛋白酶酶解杜仲籽粕蛋白制備抗氧化肽的最佳工藝條件為酶添加量9999.98 U/g，酶解時間1.50 h，底物濃度20 g/L，在最佳工藝條件下，杜仲籽粕抗氧化肽的OD值為0.938。

結合實際情況將上述所得最佳條件修正為：酶添加量10000 U/g，酶解時間 1.50 h，底物濃度20 g/L，在此條件下進3組驗證試驗，測得杜仲籽粕蛋白酶解液的總抗氧化能力為（30.62±0.59 μmol/g），水解度為47.45%±1.50%，OD值為0.932，與響應面回歸模型所得到的預測值（0.938）偏差0.397%，說明這次響應面分析的回歸模型可以很好地預測實際試驗結果。

2.4 杜仲籽粕水解肽的體外抗氧化試驗

不同質量濃度的酶解液和V對DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及ABTS自由基的清除率測定結果如圖5所示。在測量的質量濃度范圍內，酶解液和V對自由基的清除能力均隨著質量濃度的增大而逐漸增大，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。當水解肽的濃度為0.8 mg/mL時，對DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及ABTS自由基的清除率分別為57.4%、16.7%、75.2%；濃度為8 mg/mL時，對自由基的清除率分別為78.6%、75.4%、96.1%，而當V的濃度為0.8 mg/mL時，對DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及ABTS自由基的清除率分別為91.5%、94.4%、99.5%，由此可看出，杜仲籽粕水解肽對DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及ABTS自由基的清除能力在低濃度時不如V，但高濃度時與V相當。本研究以水解度和總抗氧化能力為指標，在響應面優(yōu)化的最佳工藝條件下制備出來的多肽，對超氧陰離子自由基的清除率可高達75.4%，且該最佳條件所需的底物質量濃度、酶添加量和酶解時間與黃群等制備抗氧化肽條件相比（底物質量濃度為7.32 g/100 mL、酶用量為12292.3 U/g、酶解時間為2.59 h）更少，即此次優(yōu)化得到的杜仲籽粕水解肽具有更強的抗氧化能力。

圖5 不同濃度酶解液對自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of different concentrations of enzymatic hydrolysate on free radicals

采用SPSS22.0軟件進行回歸擬合，計算得水解肽對DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及ABTS自由基清除率的IC分別為0.731、4.258、0.407 mg/mL。當某物質的IC低于10 mg/mL時，一般說明其有較好的抗氧化活性，杜仲籽粕水解肽對三種自由基清除率的IC均遠小于10 mg/mL，綜上，杜仲籽粕蛋白水解肽具有明顯的抗氧化性。

3 結論

本實驗以杜仲籽粕為原料，通過堿提酸沉得到杜仲籽粕蛋白，利用酶解法制備多肽，通過單因素實驗及響應面試驗對酶添加量、酶解時間和底物濃度這三個因子進行優(yōu)化，得到最佳工藝條件：酶添加量10000 U/g，酶解時間1.50 h，底物濃度20 g/L，在此條件下，酶解液的水解度為47.45%±1.50%，總抗氧化能力為（30.62±0.59 μmol/g），且隨著杜仲籽粕蛋白酶解液濃度的增大，其清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及ABTS自由基的能力也不斷增大，表明杜仲籽粕多肽具有良好的抗氧化功能。本文僅對酶解杜仲籽粕蛋白制備多肽工藝條件及其抗氧化性進行了研究，但其抗氧化能力與結構特征間的關聯(lián)性仍有待進一步探究。