馬少卿 龔士香 張微 路承彪 李小俚 李英偉?

1) (燕山大學信息科學與工程學院,秦皇島 066004)

2) (河北省信息傳輸與信號處理重點實驗室,秦皇島 066004)

3) (新鄉(xiāng)醫(yī)學院河南省無創(chuàng)神經調控國際重點實驗室,新鄉(xiāng) 453000)

4) (北京師范大學認知神經科學與學習國家重點實驗室,北京 100875)

太赫茲波位于氫鍵和范德瓦耳斯力作用能級范圍內,可以直接與蛋白質耦合激發(fā)蛋白質的非線性共振效應,從而影響蛋白質的構象、神經元的結構和功能.基于此機制,體外培養(yǎng)SD 大鼠原代皮層神經元,利用寬帶微量太赫茲(0.3—3.0 THz,最大輻射功率100 μW)短時間累計輻射(3 min/d,共3 d)皮層神經元;記錄皮層神經元的動態(tài)發(fā)育參數(胞體面積和突起總長度);并分析輻射結束后神經元受體相關蛋白(GluA1 和GluN1)、突觸素(SY-38)和突觸后致密蛋白-95(PSD-95)的表達變化.太赫茲輻射1 d 后,神經元胞體面積增長值提高了144.9% (P＜ 0.05);太赫茲輻射的2 d 和3 d 后,神經元突起總長度增長值分別提高了65.1% (P ＜0.05)和109.4% (P ＜ 0.05);太赫茲輻射3 d 后,GluA1 和SY-38 蛋白表達分別提高了38.1% (P ＜ 0.05)和19.2% (P ＜ 0.05).結果表明,寬帶微量太赫茲短時累計輻射可以促進皮層神經元胞體和突起的生長,并且對神經元突起的促進作用存在累計效應;太赫茲輻射對神經元生長發(fā)育的促進作用可能與GluA1 和SY-38 蛋白表達相關.這些結果預示著特定頻率和能量的太赫茲波可以發(fā)展為一種治療或干預神經發(fā)育障礙等疾病的新型神經調控技術.

1 引言

神經系統(tǒng)是一個復雜的網絡結構,這一網絡調控著人的呼吸、感覺、情感和學習等行為活動[1].神經元是神經網絡的重要組成部分,神經元的生長發(fā)育在神經元的功能和交流方面起著重要的作用[2].具體來說神經元的發(fā)育狀態(tài)影響著其接收和傳遞信息的方式,神經元樹突的功能是接收整合臨近神經元的傳入信息,其形態(tài)的多樣性(長度和分支數)促進了局部和遠程信號的傳遞,并且神經元發(fā)育的完整性在神經信息傳遞和正常神經功能的維持中起重要的作用[3].神經元發(fā)育異常及由此導致的神經網絡結構異常可導致多種精神和神經疾病的發(fā)生,例如阿爾茲海默癥[4]、自閉癥[5]和帕金森癥[6]等.因此發(fā)展有效的神經發(fā)育調控技術,不僅有助于干預和治療神經發(fā)育障礙相關疾病,也可以幫助理解疾病的發(fā)病機制,找到干預靶點.

目前調控神經元生長發(fā)育的手段大致可以歸納為兩類,第一類是藥物調控,有研究表明,白藜蘆醇和阿托伐他汀能夠促進正常培養(yǎng)神經元突起的生長,同時能夠改善腦缺血后大鼠神經功能,增強突觸素表達[7,8].但是,藥物在達到預期效果的過程中有許多障礙,這些包括生物利用度差、吸收低(食物效應)、首過代謝、靶向性低和劑量依賴性副作用[9].第二類為物理調控(聲、光、電、磁),經顱磁刺激(transcranial magnetic stimulation,TMS)利用電磁感應原理在神經網絡中產生感應電流,這些電流使神經元去極化,從而調節(jié)神經元的興奮性.有研究表明TMS 對大腦的影響不僅限于神經元的興奮性,可能包括其他類型的細胞被間接激活,甚至在分子層面發(fā)揮作用[10].重復對海馬神經元施加TMS,使神經元去極化,誘導BDNF (brain-derived neurotrophic factor)從其樹突中釋放[11],并且有研究指出TMS 通過增加BDNF 和神經生長因子(nerve growth factor,NGF)促進神經元的分化、生長、發(fā)育和存活[12].這些研究表明,TMS對神經元生長發(fā)育的影響都是起源于TMS 對神經元活動的影響.經顱超聲刺激(transcranial ultrasound stimulation,TUS)通過激活神經元上的機械敏感離子通道使神經元去極化,影響神經網絡的興奮性,也有研究指出TUS 可以影響神經元的力學特性,TUS 可以通過觸發(fā)神經突起短暫收縮和誘導細胞體收縮來調節(jié)神經元生長發(fā)育[13].這些表明TMS 和TUS 都是通過一種間接的方式來調控神經元生長發(fā)育,它們的調控靶點多為神經元層面,并且超聲波在空氣中的衰減較大,通常需要在超聲探頭和樣本之間添加水或者超聲耦合劑等介質來減少超聲波的衰減.因此,目前缺乏一種非接觸式的,調控靶點為分子層面的神經調控技術來調節(jié)神經元的生長發(fā)育.

太赫茲波是位于微波與遠紅外之間的一種電磁波,頻率范圍為0.1—10 THz,太赫茲波處于氫鍵、電荷轉移反應和范德瓦耳斯力作用的能級范圍內,因此太赫茲輻射有望影響蛋白質的構象,甚至影響細胞的結構和功能[14].近年來,研究者們開始重視太赫茲波的神經生物學效應,各項研究之間的差異主要在于樣本、太赫茲波頻率、功率和輻射時間.目前的研究主要是利用太赫茲輻射神經元一段時間后,分析神經元結構的變化,其中主要包括神經元膜結構、突起、胞體[15-17].還沒有學者關注太赫茲輻射對神經元動態(tài)生長發(fā)育和長期效應的研究,同時還缺少從蛋白層面分析太赫茲輻射促進神經元生長發(fā)育機制的研究.當使用功率較大(瓦量級)的太赫茲輻射神經元時會導致樣本升溫、生長紊亂、脫水效應(細胞體積減小)和形態(tài)的損傷[18].為了減小太赫茲輻射的熱效應和負面影響,可以通過降低輻射功率、減少輻射時間、采用太赫茲脈沖波來實現(xiàn).

本研究的重點是分析寬帶微量太赫茲(頻帶為0.3—3 THz,最大輻射功率100 μW)短時間累計輻射(3 min/day,共3 d)的安全性.提供一些太赫茲輻射影響神經元生長發(fā)育的證據,并且分析這樣的輻射協(xié)議對神經元動態(tài)生長發(fā)育的影響規(guī)律及長期效應.另外也提供了一些太赫茲輻射影響神經元蛋白層面變化的證據,以解釋太赫茲輻射對神經元生長發(fā)育影響機制.

2 實驗儀器與方法

2.1 光纖耦合太赫茲輻射平臺

實驗中使用的光纖耦合太赫茲輻射系統(tǒng)是德國Menlo Systems 公司生產的TERA K15,在其基礎上對太赫茲波的傳輸光路進行了改進,如圖1(a)所示.太赫茲頻率分辨率小于1.2 G Hz,激光激發(fā)波長為1560 n m,激光系統(tǒng)的重復頻率為100 M Hz,太赫茲系統(tǒng)輸出有效頻率范圍為0.3—3 T Hz,最大輸出功率為100 μ W.

圖1 實驗平臺、實驗協(xié)議和太赫茲波衰減測試 (a)太赫茲輻射神經元實驗平臺;(b)太赫茲輻射神經元實驗協(xié)議;(c)太赫茲波穿透培養(yǎng)液后的時域圖;(d)太赫茲波穿透培養(yǎng)液后的頻域圖Fig.1.Experimental platform,protocol and terahertz wave attenuation test: (a) Terahertz radiation neuron experimental platform;(b) experimental protocol for terahertz radiation neurons;(c) time domain diagram of terahertz wave after penetrating culture medium;(d) frequency domain map of terahertz wave after penetrating culture medium.

該系統(tǒng)配備飛秒光纖耦合激光器(Menlo systems T-light),激光器輸出分為兩路,一路通過一個2.5 m 的光纖連接器傳輸到光纖耦合太赫茲發(fā)射器(TERA 15-TX-FC Fe: InGaAs),發(fā)射器在偏置電壓的作用下產生太赫茲波;另外一束輸入到光延遲器,并通過光纖連接器傳輸到光纖耦合太赫茲探測器(TERA 15-RX-FC LT: InGaAs),通過調節(jié)激光在光延遲器中的傳輸距離使其與入射的太赫茲波同步.發(fā)射器產生太赫茲波后可以通過4 個透鏡(L1,L2,L3,L4)將太赫茲光束聚焦為直徑很小的光斑.由于發(fā)射器產生的太赫茲波具有發(fā)散性,所以首先通過平凸透鏡L1 來準直太赫茲波束,L1 的焦距越長,光束的直徑越寬;隨后利用凸平透鏡L2 將太赫茲波聚焦,為了增大太赫茲輻射到樣本的能量,將樣本放在太赫茲波焦點位置;平凸透鏡L3 用來收集通過樣本的太赫茲波,并將太赫茲波束準直,凸平透鏡L4 將太赫茲波聚焦到探測器上,用于探測透過樣本的太赫茲波.探測器采樣的太赫茲信號首先通過鎖相放大器(FEMTO,LCA-S10)對信號進行放大,隨后對太赫茲信號進行數字處理,最后通過電腦顯示.

2.2 實驗協(xié)議

太赫茲輻射實驗協(xié)議如圖1(b)所示,首先提取胎鼠大腦皮層神經元,并進行為期2 d 的培養(yǎng),使皮層神經元適應環(huán)境且貼壁生長;為了減少培養(yǎng)液對太赫茲波(頻帶為0.3—3 T Hz,最大輻射功率100 μ W)的吸收,從培養(yǎng)皿底部輻射皮層神經元.由于體外培養(yǎng)的神經元大致可以分成5 個階段,并且每個階段的持續(xù)時間都以天為單位,所以選擇在神經元快速增長的3 d,利用太赫茲累計輻射神經元,同時為了盡可能的降低太赫茲輻射的熱效應,采用3 m in/d 的輻射量.為了保證神經元的活性,以便于有效提取神經元的蛋白質,在太赫茲輻射結束后的2 d 內提取神經元蛋白,利用免疫印跡技術提取神經元相關蛋白含量.

2.3 實驗材料

無特定病原體(specific pathogen free,SPF)SD (sprague-dawley)雌鼠,孕期12—15 d,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司.皮層原代神經元培養(yǎng)所用藥品: 達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(Gibco,11965092)、神經基礎培養(yǎng) 基 (Gibco,21103049)、B-27 (Gibco,17504044)、胎牛血清(Gibco,10099141C)、胰蛋白酶0.25% (Gibco,15050057)、青霉素-鏈霉素(Gibco,15140163)、谷丙氨酸二肽(Gibco,35050061)、多聚-L-賴氨酸溶液(Sigma,P4832)、HBSS (Beynotime,C0218)、HEPES(Beynotime,ST090).免疫印跡實驗所用藥品: Anti-AMPAR1(GluA1,Abcam,Cat #ab174785)、Anti-NMDAR1 (GluN1,Abcam,Cat #ab134308)、Anti-SY38 (SY38,Abcam,Cat #ab8049)、Anti-PSD95(PSD95,Abcam,Cat #ab13552)、Anti-GAPDH(Proteintech,Cat #60004-1-lg)、Anti-Beta Tubulin(Proteintech,Cat #66240-1-lg)、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) (Proteintech,Cat #SA00001-1).

2.4 皮層原代神經元培養(yǎng)

皮層原代神經元培養(yǎng)參考Legutko等[19]的方法,并稍作改進.選用SPF-SD 孕鼠,孕期12—15 d,體重300—350 g,在無菌工作臺中取所孕胚胎,提取胎鼠的大腦皮層,剪碎、加入0.25%的胰蛋白酶,培養(yǎng)箱消化15 min,每3 min 取出搖勻.用尖端經火焰鈍化處理后的巴氏滴管緩慢、輕柔吹打,分散細胞.用含有10%胎牛血清、90%達爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養(yǎng)基種植,根據實驗目的,調整細胞懸液濃度.觀察神經元生長發(fā)育時調整細胞濃度為每毫升1×104個.接種于預先用100 μg/L的多聚-L-賴氨酸溶液包被處理過的35 mm 培養(yǎng)皿;37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱孵育,4 h后用含97%神經基礎培養(yǎng)基、2% B27、1% 谷丙氨酸二肽的維持培養(yǎng)基替代種植培養(yǎng)基(換半液).

2.5 免疫印跡實驗

原代培養(yǎng)神經元蛋白提取參考Wang等[20]的方法.太赫茲輻射神經元實驗結束后裂解細胞,收集上清液作為總蛋白,BCA 法測定蛋白濃度、定量,添加上樣緩沖液,95 ℃水浴變性10 min,分裝蛋白樣品.免疫印跡實驗中,每個上樣孔添加30 μg樣品,10% SDS-PAGE 凝膠電泳(80 V×30 min;100 V×60 min)分離蛋白,濕法(100 V×120 min)轉至0.45 μm NC 膜.含5%脫脂奶粉TBST 封閉,37 ℃緩慢搖動狀態(tài)下封閉1 h.分別加入GluA1抗體(1∶1000)、GluN1 抗體(1∶1000)、SY38 抗體(1∶500)、PSD95抗體 (1∶1000)、GAPDH抗體(l∶2000)、β-Tubulin 抗體(1∶20000),4 ℃孵育過夜.洗膜,HRP-conjugated(1∶2000)室溫孵育1 h,洗膜,加入ECL 發(fā)光液,曝光.采用VILBER 公司Fusion FX7 軟件及ImageJ 軟件對蛋白電泳條帶進行分析,以條帶蛋白吸光度值作為蛋白表達含量.

2.6 神經元結構參數提取及分析方法

首先為了保證每次記錄到的神經元都是被太赫茲輻射過的,同時能夠快速有效地找到同一個神經元.在培養(yǎng)皿上做了兩條標記線,兩條線的交點為培養(yǎng)皿的中心.拍攝以培養(yǎng)皿中心為直角坐標系的4 個象限的神經元生長發(fā)育狀態(tài).其次篩選出背景清晰,神經元密度低(可清晰觀察到單個神經元的胞體和突起,并且與其他神經元沒有連接)的圖片.然后利用ImageView 軟打開光學顯微鏡拍攝圖片,并使用軟件“測量”菜單中的任意連接曲線測量神經元突起長度,采用任意多邊形測量神經元胞體面積,神經元的所有突起的總和為突起總長度.在太赫茲輻射前記錄神經元發(fā)育狀態(tài),將此時的神經元胞體面積和突起總長度作為初始值.記錄第一次太赫茲輻射的24 h 后神經元胞體面積和突起總長度,將其與初始值相減作為太赫茲輻射后第1 天神經元胞體面積和突起的增長值,以此類推,分別計算出太赫茲輻射后第2 天和第3 天后神經元胞體面積和突起總長度的增長值.最后將測量的同一個培養(yǎng)皿中的神經元參數求一個平均值,代表整個培養(yǎng)皿的細胞情況,并作為一個樣本值.

2.7 統(tǒng)計學分析方法

統(tǒng)計分析的實驗樣本n=9,數據均采用平均值±均值標準誤差(SEM)表示,特定情況單獨說明,實驗組與對照組結果的顯著性分析采用獨立樣本t檢驗,統(tǒng)計分析通過Matlab 完成,P值小于0.05 時認為結果具有顯著性差異.

3 實驗結果

3.1 太赫茲輻射促進神經元胞體和突起的生長

在研究初期由于細胞培養(yǎng)液對太赫茲波的吸收較大,為了估計太赫茲輻射到神經元的能量以及頻段范圍,測量了太赫茲波穿透空培養(yǎng)皿和培養(yǎng)液后的時域和頻域信號,實驗結果如圖1(c),(d)所示.其中圖1(c)為太赫茲波穿透培養(yǎng)皿和培養(yǎng)液后的時域圖,從圖1(c)可以發(fā)現(xiàn),太赫茲波可以透過培養(yǎng)皿和培養(yǎng)液,并且透射的太赫茲信號均有不同程度時間延遲.圖1(d)為太赫茲波穿透培養(yǎng)皿和培養(yǎng)液后的頻域圖,圖中紅色曲線為太赫茲在空氣中的傳播特性,可以發(fā)現(xiàn)太赫茲系統(tǒng)的有效頻譜范圍在3 THz 以下,其中峰值功率大約集中在0.4 T Hz 左右.在太赫茲波穿過培養(yǎng)皿后,透射太赫茲波的頻率范圍為0.3—3 T Hz,并且主要能量集中在0.3—1 T Hz.其頻譜曲線如圖1(d)中紫色所示,所以大致可以估計出輻射到神經元上的太赫茲波頻段有效范圍大致為0.3—3 T Hz.因此,實驗中認為主要研究0.3—3 T Hz 這個頻段的太赫茲波對神經元生長發(fā)育的影響.在太赫茲波透過空培養(yǎng)皿后,其頻譜曲線(紫色)相較于紅色、綠色和藍色波動較大.在培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液,發(fā)現(xiàn)太赫茲波仍可以穿過,但是培養(yǎng)液對太赫茲波衰減較大,并且與加入培養(yǎng)液容量呈現(xiàn)出正相關.

為了研究太赫茲輻射對神經元生長發(fā)育的影響,選擇神經元胞體面積和突起總長度作為統(tǒng)計分析量,主要統(tǒng)計分析了4 d 的神經元生長發(fā)育狀態(tài),其中第1 天是太赫茲輻射前1 天的神經元,剩余3 d為太赫茲輻射3 d 內神經元發(fā)育狀態(tài),實驗結果及統(tǒng)計分析如圖2 所示.為了監(jiān)控實驗過程中神經元發(fā)育狀態(tài),拍照記錄了神經元發(fā)育過程,結果如圖2 所示.可以發(fā)現(xiàn)對照組和太赫茲組在太赫茲輻射1 d 后神經元突起開始生長,并在第2 天后神經元的一個突起出現(xiàn)快速增長,顯示出神經元的特性,在太赫茲輻射結束后神經元依舊發(fā)育良好,為免疫印跡實驗提供了很好的樣本.

圖2 太赫茲輻射前后神經元的胞體面積和突起總長度變化 (a)太赫茲輻射1 d 后對照組和太赫茲組神經元生長發(fā)育狀態(tài);(b)太赫茲輻射2 d 后對照組和太赫茲組神經元生長發(fā)育狀態(tài);(c)太赫茲輻射3 d 后對照組和太赫茲組神經元生長發(fā)育狀態(tài)(t 檢驗顯著性差異: p＜0.05,*;p＜0.01,**)Fig.2.Changes in cell body area and total neurite length of neurons before and after terahertz radiation: (a) The growth and development status of neurons in the control group and the terahertz group after 1 d of terahertz radiation;(b) the growth and development status of neurons in the control group and the terahertz group after 2 d of terahertz radiation;(c) the growth and development status of neurons in the control group and the terahertz group after 3 d of terahertz radiation(significance of t-test: p＜0.05,*;p＜0.01,**).

神經元的胞體是神經元代謝和營養(yǎng)中心,與神經元的存活和發(fā)育息息相關,因此統(tǒng)計分析了太赫茲輻射前后神經元胞體面積的增長量,統(tǒng)計分析方法參照2.6 節(jié)和2.7 節(jié),統(tǒng)計結果如圖2 所示.

在對照組中隨著時間的延長,神經元胞體面積的增長值也在不斷增大,也就是說神經元胞體面積的增長值隨著時間的延長在不斷提高,在太赫茲組中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象.并且發(fā)現(xiàn)在第1 天中太赫茲組神經元胞體面積的增長值((20.5 ± 2.6) μ m2)顯著高于對照組的增長值((10.3 ± 2.0) μ m2).在第2 天和第3 天太赫茲組都高于對照組,但是統(tǒng)計結果并不顯著.為了分析太赫茲輻射時間對神經元胞體面積增長值的影響,分析第1 天到第3 天太赫茲組和對照組胞體面積增長值的差值,結果如圖3(a)所示.太赫茲組和對照之間的差值隨著時間的延長在不斷減小.

圖3 太赫茲輻射時間與神經元胞體面積和突起總長度的相關性 (a)對照組和太赫茲組神經元胞體面積增長均值誤差曲線;(b)對照組和太赫茲組神經元突起總長度增長均值誤差曲線Fig.3.Correlation between terahertz radiation time and neuronal cell body area and total neurite length: (a) The mean error curve of neuronal cell body area growth in the control group and the terahertz group;(b) the mean error curve of the total length of neurites in the control group and the terahertz group.

神經元的突起是神經元之間信息通信的基礎,是神經網絡形成的關鍵.因此統(tǒng)計分析了太赫茲輻射前后神經元突起總長度的增長量,統(tǒng)計分析方法參照2.6 節(jié)和2.7 節(jié),統(tǒng)計結果如圖2 所示.在對照組中,神經元突起總長度的增長值與天數呈現(xiàn)出正相關,在太赫茲組中也存在相同的現(xiàn)象.在太赫茲輻射的第1 天太赫茲組神經元突起總長度增長值((68.9±10.2) μm)顯著高于對照組((35.4±10.7) μm,在太赫茲輻射的第2 天和3 天太赫茲組((132.3±15.3) μm,(184.3.3±21.5) μm)都顯著高于對照組((74.8±11.4) μm,(91.6±21.9) μm).為了研究太赫茲輻射時間對神經元突起總長度增長值的影響,分析了第1 天到第3 天太赫茲組和對照組突起總長度增長值的差值,結果如圖3(b)所示.太赫茲組神經元突起長度的增長值與太赫茲輻射時間近似于線性增長,但是對照組突起總長度的增長幅度卻在隨著天數減小.隨著時間的延長,太赫茲組和對照組神經元突起長度增長值的差值在不斷變大.

3.2 太赫茲輻射提高GluA1 和SY38 蛋白的表達

為了進一步研究太赫茲輻射促進神經元生長發(fā)育的原因,提取了輻射結束后神經元中的蛋白,其中包括AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid)受體亞型GluA1、NMDA (N-methyl-D-aspartic acid) 受體亞型GluN1、突觸前特異性蛋白突觸素-38 (synaptophysin-38,SY-38)、突觸后致密物質-95 (postsynapticdensity-95,PSD-95),利用免疫印跡技術分析太赫茲輻射對其相對含量的影響.

實驗結果如圖4 所示.從圖4(a),(b)中可以發(fā)現(xiàn),太赫茲輻射后GluA1 和GluN1 蛋白含量都有增加,輻射后GluA1 蛋白含量相較于對照組顯著提高了38%;由圖4(c),(d)所示,太赫茲輻射顯著提高了SY-38 蛋白含量,較對照組提高了19%,但是對PSD-95 蛋白的影響并不顯著.

圖4 太赫茲輻射前后神經元相關蛋白表達變化 (a) GluA1 蛋白表達變化;(b) GluN1 蛋白表達變化;(c) SY38 蛋白表達變化;(d) PSD-95 蛋白表達變化 (t 檢驗顯著性差異: p＜0.05,*;p＜0.01,**)Fig.4.Changes of neuron-related protein expression before and after terahertz radiation: (a) Changes of GluA1 protein expression;(b) changes of GluN1 protein expression;(c) expression changes of SY38 protein;(d) changes of PSD-95 protein expression (significance of t-test: p＜0.05,*;p＜0.01,**).

4 討論

蛋白質是生命體中重要的組成部分,功能和活性在很大程度上依賴于其特定構型和構象[21].蛋白質分子是由氨基酸首尾相連縮合而成的共價多肽鏈,為了能夠發(fā)揮其生物學功能,蛋白質會折疊成一種或多種特定的空間構象,這些構象是由許多非共價鍵來維持結構穩(wěn)定的.例如蛋白質的二級結構主要通過氫鍵來維持其穩(wěn)定,三級結構主要以非共價鍵相互作用為主,其中包括范德瓦耳斯力、氫鍵等[21].有研究表明,生物組織中氫鍵和范德瓦耳斯力能級正好位于太赫茲波段[22].這些預示著太赫茲波可以直接與蛋白質耦合誘導相干激發(fā)以產生非熱效應,即激發(fā)蛋白質的非線性共振效應[14].蛋白質在發(fā)揮其作用時往往伴隨著動態(tài)的構象變化[23],所以特定頻率和能量的太赫茲波可以影響蛋白質的構象,進而影響蛋白質的功能[24].

在研究中發(fā)現(xiàn)太赫茲輻射對神經元的結構產生了影響.當用寬帶微量太赫茲(頻帶為0.3—3 T Hz,最大輻射功率100 μ W)累計輻射神經元細胞3 d,皮層神經元中AMPA 受體亞型GluA1蛋白含量增加,并且發(fā)現(xiàn)突觸前特異性蛋白SY-38蛋白表達也增加.但是對NMDA 受體亞型GluN1和PSD-95 蛋白表達沒有顯著影響,這可能與蛋白質的類型有關,不同的蛋白質的氨基酸類型、折疊和旋轉的方式不同,這樣就導致了蛋白質對太赫茲波的吸收和響應的差異[25].有研究發(fā)現(xiàn)太赫茲輻射對皮層神經元中突觸相關蛋白表達無顯著影響,但是卻下調了PSD-95 蛋白表達[15].這種影響的差異也體現(xiàn)在了神經元的類型中,研究中分析了太赫茲波分別對4 個大鼠的腦區(qū)(海馬、大腦皮層、小腦和腦干)中突觸相關蛋白(SYN)和PSD-95 蛋白表達的影響,太赫茲輻射僅下調了海馬神經元的SYN 和皮層神經元PSD-95 蛋白表達[15].太赫茲輻射功率為輻射到樣本的所有光子的能量總和,所以影響著蛋白質對太赫茲波能量的吸收,不同的功率也會對蛋白質的表達產生影響[26].有研究發(fā)現(xiàn),當分別用50 m W 和10 m W 的太赫茲輻射海馬神經元3 d,50 m W 輻射的神經元中SYN 蛋白表達顯著低于10 m W 輻射[15].同時在皮層神經元也發(fā)現(xiàn)太赫茲輻射功率與神經元中PSD-95 蛋白表達呈現(xiàn)反比[15].此外,太赫茲的輻射時間也會影響蛋白質的表達,有研究表明,用太赫茲分別對皮層神經元輻射6 min 和60 min,發(fā)現(xiàn)輻射60 min 神經元中的PSD-95 蛋白表達顯著低于6 min 的,在提高太赫茲的輻射功率后,仍然發(fā)現(xiàn)了相同的現(xiàn)象[15].但是在更大的時間尺度下卻出現(xiàn)了不同現(xiàn)象,太赫茲分別輻射皮層神經元4 d 和6 d,輻射6 d 后神經元中的SYN 蛋白顯著高于輻射4 d 的神經元[27].由此可知,太赫茲波對蛋白質構象的影響因素不僅與蛋白質的類型有關,同時還與太赫茲波的輻射功率、輻射時間相關,目前的研究中并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律,太赫茲輻射對蛋白質的影響規(guī)律表現(xiàn)出多因素復合作用.

在分析太赫茲輻射對神經元相關蛋白表達的影響機制時,多數研究將太赫茲輻射與蛋白質的構象變化建立聯(lián)系,但是影響神經元中蛋白質表達的因素有很多,例如太赫茲輻射后神經元中蛋白表達與谷氨酸表達變化相關[15],也有研究發(fā)現(xiàn)太赫茲輻射皮層神經元后SYN 基因表達與蛋白表達變化一致[27].

在研究中發(fā)現(xiàn)太赫茲輻射可以促進神經元胞體和突起的增長,為了研究影響神經元結構變化在蛋白質層面的原因,在太赫茲輻射結束后,也就是第5 天,提取了神經元相關蛋白,并分析了太赫茲輻射對蛋白表達的影響,發(fā)現(xiàn)AMPA 受體亞型GluA1 蛋白含量增大.有研究表明,AMPA 受體介導神經元功能,并在神經元發(fā)育、突觸傳遞、可塑性和結構重塑中起關鍵作用[28].此外,AMPA 受體在神經元的Ca2+通透性方面發(fā)揮重要作用[29].神經元的生長發(fā)育與胞內Ca2+的濃度高度相關,當Ca2+濃度過高或過低時,會阻礙神經元突起的生長,甚至導致神經元死亡,而合適的Ca2+可以促進突起的連續(xù)增長[30].神經元生長發(fā)育中,AMPA 受體轉錄物被大量的拼接和編輯,產生多種生理、物理性質不同的亞單位[29].AMPA 受體是由多個亞基組成的多異聚體結構,構成異聚體的亞基比例的不同會導致受體呈現(xiàn)出不同的特性[31],尤其是GluA1 和GluA2 的所占比例的大小,影響著皮層神經元AMPA 型谷氨酸受體通道Ca2+的通透性,并且發(fā)現(xiàn)AMPA 受體構成亞型的比例不同,神經元的反轉電位也存在顯著差異[29].在神經元的發(fā)育初期(體外培養(yǎng)3—7 d),胞內Ca2+的濃度主要受到AMPA 受體的影響[20].

目前也有一些研究更加直接地表明了太赫茲輻射對神經元Ca2+動力學的影響[32,33],采用頻率為0.1 T Hz,功率密度為2.65 m W/cm2的太赫茲輻射大鼠海馬神經元15—25 min,誘發(fā)了海馬神經元的去極化,同時發(fā)現(xiàn)神經元中Ca2+濃度顯著增大[34].這表明在神經元發(fā)育初期,太赫茲輻射可能通過影響AMPA 受體亞型構成比例,進而影響神經元中Ca2+的濃度,從而實現(xiàn)對神經元胞體和突起生長的影響.另外,突觸前特異性蛋白SY-38 也參與了中樞神經元發(fā)育過程中幾個重大事件,包括神經元突起延伸、神經元極性建立、突觸形成以及突觸維持[35].越來越多的證據表明突觸素在神經元的發(fā)育中有廣泛的作用,在神經元早期非分化突起延伸及其后分化為軸突與樹突的過程中起重要作用[35,36].

在研究太赫茲神經生物效應時,太赫茲輻射協(xié)議的安全性是首先要考慮的問題,從物理角度來看,太赫茲輻射神經生物組織導致生物效應本質上來源于太赫茲波的熱效應和非熱效應.目前主要通過太赫茲輻射過程中的生物材料溫度的變化來判斷[37].較高的太赫茲輻射功率和較長的輻射時間會導致神經生物組織升溫,導致一系列的生物效應.有研究表明,一定條件下太赫茲輻射強度增大,生物樣本的溫度呈線性增長[37].芝加哥伊利諾伊大學的研究人員發(fā)現(xiàn)當神經元在太赫茲(0.094 T Hz,3.1 W/cm2)下輻射30 min 后,細胞溫度上升超過7 ℃,導致神經元的肌動蛋白結構解體,對肌動蛋白結構造成了損傷[16].也有研究表明太赫茲輻射會導致神經元生長紊亂、脫水效應(細胞體積減小)和神經元形態(tài)的損傷,細胞損傷的程度與太赫茲輻射的功率和頻率有關[38].

為了盡可能降低太赫茲輻射對神經元的熱效應,可以通過降低輻射功率、縮短輻射時間、采用太赫茲脈沖波來實現(xiàn).Sulatsky等[39]研究了寬帶太赫茲波 (0.05—1.2 T Hz) 輻射 3 min 和 5 min對雞胚脊神經節(jié)的影響.他們在不改變其他條件的前提下,通過降低太赫茲輻射功率,來探究功率對神經節(jié)的影響規(guī)律.研究發(fā)現(xiàn)太赫茲輻射功率密度為928 m W/cm2時,神經元突起的生長受到抑制;但是當功率密度降低到78 m W/cm2時,太赫茲輻射促進了神經元突起的增長.這些研究表明不同的太赫茲輻射參數(頻率、功率、時間)會對神經元產生損傷、抑制生長、促進生長等不同的效應[39].

本研究為了降低太赫茲輻射對神經元的熱效應,采用寬帶微量的太赫茲波作為輻射源(頻帶為0.3—3 T Hz,最大輻射功率100 μ W),并且使用短時間累計輻射的方式(3 m in/d,共3 d).實驗中利用溫度計(TASi,TA612A,測量精度為0.1 ℃)測量了太赫茲輻射30 min 后培養(yǎng)液的溫度變化,發(fā)現(xiàn)太赫茲累計輻射30 min 后培養(yǎng)液的溫度平均升高了0.4 ℃,并且在太赫茲輻射的前5 min 培養(yǎng)液溫度變化大約在0.1 ℃.研究發(fā)現(xiàn),在太赫茲輻射神經元的3 d 內,神經元胞體發(fā)育良好,神經突起出現(xiàn)快速增長,與對照組表現(xiàn)出了相同的發(fā)育特性,符合體外培養(yǎng)神經元的生長發(fā)育周期[39].因此,采用本研究的太赫茲輻射協(xié)議不會對神經元造成明顯的負面作用,并且不會影響神經元的生長規(guī)律.在研究中發(fā)現(xiàn)太赫茲輻射第1 天后,神經元胞體面積的增長值顯著高于對照組,這表明太赫茲輻射可以促進皮層神經元胞體的增長.但是有研究指出,用太赫茲(0.09—0.16 T Hz)輻射蝸牛神經元20 min 會導致脫水效應(胞體面積減小),并且該效果一直持續(xù)到了太赫茲輻射結束[38].顯然本研究中并不是因為脫水效應導致的神經元胞體面積的變化.在太赫茲輻射的第2 天和第3 天神經元胞體面積的增長值都大于對照組,但是統(tǒng)計的結果并不顯著,如圖2(b),(c)所示.為此分析了第1 天到第3 天太赫茲組和對照組胞體面積增長值的差值,結果如圖3(a)所示.在太赫茲輻射的第1 天,太赫茲組與對照組胞體面積的增長值的差值最大,隨著輻射天數的增加,差值不斷減小.這可能與體外培養(yǎng)神經元的發(fā)育周期相關.有研究表明,體外培養(yǎng)的神經元在接種后存在“潛伏期”,在這個時期細胞進行貼壁和環(huán)境適應,細胞的增長緩慢,潛伏期一般持續(xù)6—24 h[40].潛伏期結束后,細胞進入快速生長期,在這個時期細胞出現(xiàn)快速的增長,快速生長期一般出現(xiàn)在細胞接種的第2—5 天.隨著培養(yǎng)天數的延長細胞的增長速度減緩,細胞進入成熟期[40].太赫茲輻射的第1 天剛好處于神經元接種的第3 天,細胞處于快速增長期,這時太赫茲輻射后神經元胞體增長速度顯著高于對照組.

神經元的突起是神經元之間信息通信的基礎,是神經網絡形成的關鍵[41].在研究中發(fā)現(xiàn)太赫茲輻射的第1 天,神經元突起總長度增長值較對照組顯著提高了95.5%,第2 天提高了77.0%,第3 天達到了101.2%.在分析第1 天到第3 天太赫茲組和對照組突起總長度增長的差值時發(fā)現(xiàn),對照組神經元突起總長度的增長隨著輻射天數的增加不斷升高,但是并非線性增長,曲線斜率在不斷的降低,如圖3(b)中藍色曲線所示.對照組神經元突起生長的規(guī)律與神經元突起生長規(guī)律相符,體外培養(yǎng)的神經元在2—4 d 內突起快速增長,并出現(xiàn)軸突[40],5—7 d 內突起快速發(fā)育成樹突,同時軸突保持快速增長.也就是體外培養(yǎng)的神經元快速生長的時間在2—7 d 內,在3—6 d 內增長速度較快.在太赫茲輻射后,神經元突起總長度增長曲線如圖3(b)中紅色曲線所示,神經元突起總長度增長值隨著輻射時間的延長呈近乎線性增長.對照組與太赫茲組神經元突起總長度增長的差值隨著時間的延長,在不斷的增大.以上表明,寬帶微量太赫茲輻射并不會改變神經元的生長規(guī)律,太赫茲輻射促進神經元突起的增長只會出現(xiàn)在神經元突起的固有增長時期,并且太赫茲輻射對神經元突生長的促進作用存在累計效應.

5 結論

本研究中利用寬帶微量太赫茲(頻帶為0.3—3 T Hz,最大輻射功率100 μ W)短時間,累計輻射(3 m in/d,共3 d)皮層神經元細胞,分析了輻射后神經元胞體面積、突起長度和蛋白表達的變化規(guī)律.結果表明: 1)本研究使用寬帶微量太赫茲短時間累計輻射不會造成皮層神經元死亡,并且不會影響其生長規(guī)律;2)寬帶微量太赫茲輻射可以促進皮層神經元胞體和突起的生長,但是對皮層神經元胞體和突起的影響規(guī)律不同,這可能與體外培養(yǎng)皮層神經元的發(fā)育周期相關,并且寬帶微量太赫茲輻射對神經元突起的促進作用存在累計效應;3)寬帶微量太赫茲輻射對神經元生長發(fā)育的促進作用可能與AMPA 受體亞型構成比例以及突觸前特異性蛋白SY-38 表達相關.這些結果預示著特定頻率和能量的太赫茲波可以發(fā)展為一種治療或干預神經發(fā)育障礙等疾病的新型神經調控技術.