陳鏗銓 王忠芹 劉超 楊星 蔣建剛

430030 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院心內(nèi)科，心血管病遺傳與分子機制湖北省重點實驗室(陳鏗銓、王忠芹、劉超、楊星)；430030 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院心內(nèi)科(蔣建剛)

1-磷酸鞘胺醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是生物膜上膜磷脂代謝的中間產(chǎn)物，是近年來發(fā)現(xiàn)具有重要生物學功能的小分子化合物。S1P由鞘胺醇激酶催化鞘胺醇而生成，并通過S1P裂解酶降解成磷酸乙醇胺或十六醛[1]。S1P發(fā)揮其生物學功能通過兩種途徑，一是作為第二信使直接作用于細胞內(nèi)的相應靶點[2]，二是分泌到細胞外從而作用于細胞膜上的受體[3]，S1P主要通過后者發(fā)揮其生物學功能。在心血管系統(tǒng)中，主要表達S1P受體1(sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1PR1)、S1PR2和S1PR3[4-5]。以往研究表明，S1P具有心臟保護作用，能抑制缺氧誘導的心肌細胞和內(nèi)皮細胞凋亡，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化和降低心肌梗死后的氧化應激水平等作用[6-8]。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，S1P能改善心肌肥大[9]，但尚不明確S1P是通過哪一型受體發(fā)揮該作用的。前期的一項研究發(fā)現(xiàn)，S1P能通過內(nèi)皮細胞上的S1PR1發(fā)揮抗病理性心肌肥厚的作用[10]，而S1PR3在心肌細胞中表達豐度次于S1PR1，在心臟成纖維細胞中表達豐度最高，且目前尚無明確報道關(guān)于S1P/S1PR3在病理性心肌肥厚中的作用。因此，本實驗旨在探討S1P/S1PR3在病理性心肌肥厚中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

S1P(Cayman Chemical公司)；2-乙?；?5-四羥基丁基咪唑[2-acetyl-4(5)-tetrahydroxybutyl imidazole，THI](Cayman Chemical公司)；血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)(Master of Bioactive Molecules公司)；S3I-201(STAT3抑制劑)(Master of Bioactive Molecules公司)；H2O2(Sigma-Aldrich公司)；p-STAT3抗體(1∶1 000，Cell signaling公司)；t-STAT3抗體(1∶1 000，Cell signaling公司)；MYH7抗體(1∶1 000，Abcam公司)；ANP抗體(1∶1 000，Abcam公司)；S1PR3抗體(1∶2 000，Abcam公司)；GAPDH抗體(1∶1 000，Abcam公司)；HRP標記山羊抗兔IgG二抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)；HRP標記山羊抗小鼠IgG二抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)；qPCR SYBR Green Master Mix(翌圣生物科技股份有限公司)；RT-PCR引物合成(武漢奧科生物科技技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗動物

所有動物實驗均經(jīng)過華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準。S1PR3基因敲除小鼠模型(S1PR3-KO)由上海南方模式生物科技股份有限公司建立，并采用聚合酶鏈反應(PCR)進行S1PR3基因敲除純合子(S1PR3-/-)小鼠基因型鑒定。以下4種引物用于小鼠基因型鑒定：P1，5’-GGGACGCAGAGTCGGCTATT-3’；P2，5’-AAAGAAGGGGTGGTAAGGGGAGAC-3’；P3，5’-TTAGCCGCAGCAAATCAGACAACT-3’；P4，5’-AGAAGGGGTGGTAAGGGGAGACAG-3’。對于野生型小鼠，P1和P2引物獲得單一的3 662 bp片段，P3和P4引物獲得374 bp片段。對于S1PR3基因敲除雜合子(S1PR3+/-)小鼠，P1和P2引物獲得856 bp和3 662 bp兩個片段；P3和P4引物獲得374 bp片段。對于S1PR3-/-小鼠，P1和P2引物獲得單一的856 bp片段，P3和P4不能獲得條帶。

SPF級雄性10～12周齡的C57BL/6野生型(wild-type)小鼠和S1PR3-/-小鼠飼養(yǎng)于同濟醫(yī)學院實驗動物中心。根據(jù)實驗需求，wild-type和S1PR3-/-小鼠分別接受胸主動脈縮窄手術(shù)(transverse aortic constriction，TAC)和假手術(shù)(sham，手術(shù)過程同TAC，但不進行主動脈弓結(jié)扎)。手術(shù)1周后，wild-type和S1PR3-/-小鼠分別按隨機數(shù)字表法分成sham組、sham+THI組、TAC組和TAC+THI組。sham+THI組和TAC+THI組以灌胃的方式每天兩次給予THI(10 μg/mouse)干預，而sham組和TAC組則給予藥物溶劑干預。THI干預7周后，心臟超聲檢測小鼠心功能以及取小鼠心臟進行后續(xù)的實驗檢測。

1.3 小鼠心臟超聲檢測

在使用1.5%的異氟烷麻醉小鼠后，使用配有30 MHz高頻探頭的VisualSonic Vevo770型超聲儀獲取5個以上連續(xù)心動周期M型超聲影像，采集影像后使用分析軟件進行分析。

1.4 細胞處理

人心肌細胞系(AC16)購自美國菌種保藏中心(ATCC)，使用含有10%青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 μg/ml)和10%的胎牛血清(Gibco公司)的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Gibco公司)在37℃及5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞處理分組，AngⅡ組：1 μM AngⅡ處理48 h；AngⅡ+S1P組：1 μM S1P預孵育1 h后，用1 μM AngⅡ處理48 h；AngⅡ+S1P+S3I-201組：1 μM S1P和5 μM S3I-201預孵育1 h后，用1 μM AngⅡ處理48 h。H2O2組：100 μM H2O2處理24 h；H2O2+S1P組：1 μM S1P預孵育1 h后，100 μM H2O2處理24 h；H2O2+S1P+S3I-201組：1 μM S1P和5 μM S3I-201預孵育1 h后，用100 μM H2O2處理24 h。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)實驗

將干預結(jié)束的各組AC16細胞加入預冷的細胞裂解液，于冰上裂解20 min，收集細胞裂解液于4℃離心機離心15 min，收集上清液后采用BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度，并加入相應體積的loading buffer，于100℃水浴變性。經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5% BSA封閉1.5 h后，以及相應的一抗工作液4℃孵育過夜和二抗室溫孵育1.5 h后，PVDF膜使用ECL化學發(fā)光試劑盒在化學發(fā)光凝膠成像儀上拍照，之后使用Image J軟件檢測蛋白條帶灰度值并進行分析。

1.6 免疫熒光染色

細胞爬片經(jīng)過固定和通透后，或心臟組織切片經(jīng)過脫蠟復水及抗原修復后，用5% BSA在室溫下封閉2 h。滴入麥胚凝集素(WGA)染液(碧云天公司)于細胞爬片或組織切片上，放置于37℃溫箱避光孵育1 h，1×PBS清洗3遍后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。使用FITC-Phalloidin(武漢賽維爾生物科技有限公司)染色工作液和細胞一起在37℃溫箱避光孵育30 min后，經(jīng)過1×PBS洗3遍后使用DAPI染色液對細胞核進行染色，PBS洗滌后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。使用含有1 μM的二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)溶液和細胞或組織切片一起在37℃溫箱避光孵育30 min后，經(jīng)過適當?shù)南礈?，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 蘇木素-伊紅(HE)染色

取小鼠心臟組織，在4%中性多聚甲醛固定24 h后，經(jīng)過石蠟包埋，使用石蠟切片機進行切片，厚度約5 μm。心臟組織切片經(jīng)過二甲苯脫蠟和梯度乙醇復水后，使用HE染色試劑盒進行染色。在中性樹膠封片后，在顯微鏡下對心臟組織切片進行觀察并拍照。

1.8 RNA提取和實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)

使用組織RNA柱式提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)提取各組心臟組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明書進行cDNA合成。按照SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書進行RT-PCR反應液配置，并利用ABI 7500 fast實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems)對BNP、MYH6、S1PR3和GAPDH的mRNA的表達進行定量分析。PCR反應條件：預變性95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；循環(huán)40次。以GAPDH的mRNA作為內(nèi)參，使用2-△△Ct方法計算基因相應mRNA的表達量。引物序列見表1(其中S1PR3引物序列在文獻中獲得)[11]。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

1.9 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗

THI干預7周后，采集各組小鼠血漿以及取小鼠心臟組織制備組織勻漿。按照產(chǎn)品說明書，使用小鼠S1P ELISA檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)檢測各組小鼠血漿和心臟組織中S1P水平，并使用不同濃度S1P標準品制備標準曲線，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，根據(jù)標準曲線，計算樣品濃度。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 THI升高小鼠體內(nèi)S1P水平，并通過S1PR3改善小鼠心功能

使用PCR法鑒定wild-type、S1PR3+/-和S1PR3-/-小鼠的基因型。對于S1PR3-/-小鼠，P1和P2引物獲得單一的856 bp片段，P3和P4不能獲得條帶(圖1A)。Western bolt和qPCR技術(shù)檢測S1PR3 mRNA及蛋白的表達情況，結(jié)果顯示S1PR3-/-小鼠心臟組織中S1PR3幾乎不表達(圖1B和1C)，提示S1PR3-/-小鼠模型建立成功。THI是S1P裂解酶抑制劑，抑制S1P裂解酶能顯著升高S1P的水平[12]。THI干預7周后，檢測各組小鼠血漿和心臟組織中S1P水平，發(fā)現(xiàn)與非THI干預組相比，THI干預組小鼠的血漿和心臟組織中S1P水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(均為P<0.001)(圖1D和1E)；此外，對比sham組，TAC組小鼠血漿和心臟組織中S1P水平明顯下降(均為P<0.001)，提示在壓力超負荷誘導的心力衰竭小鼠模型中，S1P的生成減少以及S1P的心臟保護功能被削弱[13](圖1D和1E)。心臟超聲結(jié)果提示，在wild-type小鼠中，與TAC組相比，給予THI能顯著改善小鼠心功能，差異有統(tǒng)計學意義(圖1F～1J)；相反，在S1PR3-/-小鼠中，TAC組和TAC+THI組小鼠的心功能比較并無統(tǒng)計學差異(圖1F～1J)，提示S1P可能通過S1PR3改善小鼠心功能。

2.2 S1P通過S1PR3改善壓力超負荷誘導的病理性心肌肥厚

HE和WGA染色顯示，在wild-type小鼠中，與TAC組相比，THI能改善壓力超負荷誘導的心肌肥大(P<0.001)(圖2A～2C)；然而，在S1PR3-/-小鼠中，TAC組和TAC+THI組小鼠的心肌細胞橫截面積大小并無統(tǒng)計學差異(圖2A～2C)。其次，心臟超聲結(jié)果顯示，在wild-type小鼠中，TAC組小鼠的左室質(zhì)量增加，而THI能降低左室質(zhì)量(P=0.04)(圖2D)。同樣，THI能降低心臟重量與脛骨長度的比值(HW/TL)(P<0.01)(圖2E)；相反，在S1PR3-/-小鼠中，壓力超負荷誘導左室質(zhì)量和HW/TL增加，但THI不能降低左室質(zhì)量和HW/TL(圖2D～2E)。Western blot和qPCR結(jié)果表明，在wild-type小鼠中，對比TAC組，THI能降低心肌肥厚標志物ANP、BNP和MYH7的表達，促進MYH6的表達，差異有統(tǒng)計學意義(圖2F～2J)；但在S1PR3-/-小鼠中，心肌肥厚標志物的表達在TAC組和TAC+THI組中并無統(tǒng)計學差異(圖2F～2J)。上述結(jié)果提示，S1P可能通過S1PR3改善壓力超負荷誘導的病理性心肌肥厚。

2.3 S1P通過S1PR3減少壓力超負荷誘導活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成

給予wild-type小鼠THI干預7周后，對比TAC組，DHE熒光染色顯示，TAC+THI組的小鼠心臟組織中ROS水平顯著降低(P<0.001)。然而，THI并不能降低S1PR3-/-小鼠心臟組織中ROS水平(圖3)。上述結(jié)果提示，S1P能減少壓力超負荷誘導心臟組織中的ROS生成，且可能通過S1PR3發(fā)揮該作用。

2.4 S1P通過JAK/STAT3信號通路抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大

JAK/STAT3是S1P/S1PR3下游的信號通路，已有文獻報道S1P可通過JAK/STAT3信號通路發(fā)揮心臟保護作用[14]。對比sham組小鼠，壓力超負荷(TAC)降低了心臟組織中磷酸化STAT3的蛋白表達水平(P<0.001)。然而，給予wild-type小鼠THI干預后，Western blot實驗顯示，心臟組織中磷酸化STAT3的蛋白表達水平顯著增加(P<0.01)。但在S1PR3-/-小鼠中，THI并沒有升高心臟組織中磷酸化STAT3的蛋白表達水平(圖4A和4B)。

S3I-201是STAT3的特異性抑制劑。Phalloidin免疫熒光結(jié)果顯示，S1P能抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大(P<0.001)，而給予S3I-201預處理后S1P的抗心肌肥大作用被逆轉(zhuǎn)(P<0.01)(圖4C和4E)。同樣，Western blot分析表明，S1P下調(diào)了AngⅡ誘導的心肌肥大標志物的表達(P<0.001)，而S3I-201則促進了心肌肥大標志物的表達，差異有統(tǒng)計學意義(圖4D、4F和4G)。提示S1P可能通過JNK/STAT3信號通路發(fā)揮抗心肌細胞肥大的作用。

sham：假手術(shù)組；sham+THI：假手術(shù)+2-乙酰基-5-四羥基丁基咪唑組；TAC：胸主動脈縮窄術(shù)組；TAC+THI：胸主動脈縮窄術(shù)+2-乙?；?5-四羥基丁基咪唑組。A：PCR法鑒定小鼠基因型；B和C：Western blot和qPCR技術(shù)檢測wild-type和S1PR3-/-小鼠心臟組織中S1PR3的表達情況；D：TAC 8周后，wild-type和S1PR3-/-小鼠各組血漿中的S1P濃度；E：TAC 8周后，wild-type和S1PR3-/-小鼠各組心臟組織中的S1P濃度；F：wild-type和S1PR3-/-小鼠各組代表性心臟超聲圖片；G：wild-type和S1PR3-/-小鼠各組左室射血分數(shù)(LVEF)；H：wild-type和S1PR3-/-小鼠各組左室縮短分數(shù)(LVFS)；I：wild-type和S1PR3-/-小鼠各組左室收縮期內(nèi)徑(LVID；s)；J：wild-type和S1PR3-/-小鼠各組左室舒張期內(nèi)徑(LVID；d)。與sham組比較，aaaP<0.001；與TAC組比較，bbP<0.01，bbbP<0.001(n=6)。ND：not detected(未檢測到)圖1 THI顯著升高小鼠體內(nèi)S1P水平和通過S1PR3改善小鼠心功能

sham：假手術(shù)組；sham+THI：假手術(shù)+2-乙?；?5-四羥基丁基咪唑組；TAC：胸主動脈縮窄術(shù)組；TAC+THI：胸主動脈縮窄術(shù)+2-乙?；?5-四羥基丁基咪唑組。A：wild-type和S1PR3-/-小鼠各組代表性的心臟組織HE染色圖片；B：wild-type和S1PR3-/-小鼠各組代表性的心臟組織WGA染色圖片；C：wild-type和S1PR3-/-小鼠各組心肌細胞橫截面積大??；D：wild-type和S1PR3-/-小鼠各組左室質(zhì)量(LV mass)；E：wild-type和S1PR3-/-小鼠各組心臟重量與脛骨長度的比值(HW/TL)；F、G和H：western blot檢測wild-type和S1PR3-/-小鼠各組心臟組織中ANP和MYH7的蛋白表達變化；I和J：qPCR檢測wild-type和S1PR3-/-小鼠各組心臟組織中BNP和MYH6 mRNA的表達變化。與sham組比較，aP<0.05，aaaP<0.001；與TAC組比較，bP<0.05，bbP<0.01，bbbP<0.001(n=6)圖2 S1P通過S1PR3改善壓力超負荷誘導的病理性心肌肥厚

sham：假手術(shù)組；sham+THI：假手術(shù)+2-乙?；?5-四羥基丁基咪唑組；TAC：胸主動脈縮窄術(shù)組；TAC+THI：胸主動脈縮窄術(shù)+2-乙酰基-5-四羥基丁基咪唑組。A和B：wild-type和S1PR3-/-小鼠各組代表性的心臟組織DHE熒光染色圖片和統(tǒng)計圖。與sham組比較，aaaP<0.001；與TAC組比較，bbbP<0.001(n=6)圖3 S1P通過S1PR3減少壓力超負荷誘導ROS的生成

2.5 S1P通過JAK/STAT3信號通路發(fā)揮抗氧化應激作用

給予AC16細胞S1P預處理后，DHE熒光染色結(jié)果顯示，S1P降低H2O2誘導的ROS水平(P<0.001)，但加入S3I-201抑制STAT3的活性后ROS水平顯著升高(P<0.001)(圖5)。提示S1P通過JAK/STAT3信號通路發(fā)揮抗氧化應激作用。

3 討論

心力衰竭是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿，也是最主要的死亡原因之一[15]。心肌肥大是心臟對血流動力學超負荷的一種代償性反應，在持續(xù)的壓力超負荷和心臟損傷下，心臟無法再代償，則從代償性肥大發(fā)展為失代償性肥大，導致心功能障礙和心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性重構(gòu)，最后發(fā)展為心力衰竭[16-17]。因此，防治病理性心肌肥厚是延緩心力衰竭發(fā)生發(fā)展的一個重要治療靶點[18]。

S1P主要與S1P受體結(jié)合后發(fā)揮其生物學功能。在心血管系統(tǒng)中，主要表達S1PR1、S1PR2和S1PR3三種受體。在心肌細胞中，S1PRs的表達豐

sham：假手術(shù)組；sham+THI：假手術(shù)+2-乙酰基-5-四羥基丁基咪唑組；TAC：胸主動脈縮窄術(shù)組；TAC+THI：胸主動脈縮窄術(shù)+2-乙?；?5-四羥基丁基咪唑組；Con：對照組；AngⅡ：血管緊張素Ⅱ組；AngⅡ+S1P：血管緊張素Ⅱ+1-磷酸鞘胺醇組；AngⅡ+S1P +S3I-201：血管緊張素Ⅱ+1-磷酸鞘胺醇+STAT3抑制劑組。A和B：Western blot檢測wild-type和S1PR3-/-小鼠各組心臟組織中磷酸化STAT3的蛋白表達變化(n=6)；C和E：FITC-Phalloidin染色心肌細胞微絲以顯示心肌細胞橫截面積大小的代表性圖片和統(tǒng)計圖；D、F和G：Western blot檢測各組心肌細胞中ANP和MYH7的蛋白表達變化。與sham組或Con組比較，aaaP<0.001；與TAC組或AngⅡ組比較，bbP<0.01，bbbP<0.001；與AngⅡ+S1P組比較，ccP<0.01，cccP<0.001(n=3)圖4 S1P通過JAK/STAT3信號通路抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大

Con：對照組；H2O2：過氧化氫組；H2O2+S1P：過氧化氫+1-磷酸鞘胺醇組；H2O2+S1P +S3I-201：過氧化氫+1-磷酸鞘胺醇+STAT3抑制劑組。A和B：DHE染色顯示心肌細胞中ROS水平的代表性圖片及統(tǒng)計圖。與Con組比較，aaaP<0.001；與H2O2組比較，bbbP<0.001；與H2O2+S1P組比較，cccP<0.001(n=3)圖5 S1P通過JAK/STAT3信號通路減少心肌細胞中ROS的生成

度依次為S1PR1>S1PR3>S1PR2；在心臟成纖維細胞中，S1PRs的表達豐度依次為S1PR3>S1PR1>S1PR2[5]。既往研究表明，S1P可通過S1PR1和S1PR3促進內(nèi)皮細胞增殖和抑制其凋亡，調(diào)節(jié)血管發(fā)生和誘導新生血管形成[19-20]；另一方面，S1P分別激活S1PR1和S1PR3發(fā)揮抗心臟缺血再灌注損傷[21-22]。上述研究表明S1PR1和S1PR3具有相似的心臟保護效應。既往研究表明，S1P能通過內(nèi)皮細胞上S1PR1發(fā)揮抗病理性心肌肥厚的作用[10]，而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)S1P通過S1PR3改善壓力超負荷誘導的病理性心肌肥厚，表明S1PR1和S1PR3具有相似的抗病理性心肌肥厚的作用。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)S1P通過S1PR3改善壓力超負荷誘導的病理性心肌肥厚和降低ROS水平。但對比wild-type和S1PR3-/-小鼠的TAC組，心肌細胞橫截面積大小和心臟組織中ROS水平并無統(tǒng)計學差異，提示S1PR3基因并不參與壓力超負荷誘導的病理性心肌肥厚和ROS產(chǎn)生的發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)，wild-type 和S1PR3-/-小鼠心肌梗死模型或離體心臟缺血再灌注模型的心臟梗死面積大小并無統(tǒng)計學差異[21]。此外在2001年Ishii等[23]發(fā)現(xiàn)，與wild-type小鼠相比，S1PR3-/-小鼠發(fā)育正常，且無明顯的表型異常，提示S1PR3基因在小鼠的正常發(fā)育過程中并未起到重要的作用。所以上述研究提示，S1PR3基因可能沒有參與壓力超負荷誘導的病理性心肌肥厚的發(fā)展。

越來越多的研究表明，氧化應激與心力衰竭發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[24]。過量ROS的產(chǎn)生會導致心肌細胞功能障礙，最后導致不可逆的細胞損傷或死亡[25]，所以抗氧化應激是防治心力衰竭的一個重要藥物干預靶點。已有研究表明S1P具有抗氧化應激作用[26]，但目前尚無S1P/S1PR3與壓力超負荷誘導的氧化應激之間關(guān)系的相關(guān)報道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)S1P通過S1PR3發(fā)揮抗壓力超負荷誘導的氧化應激的作用，提示S1P可能通過S1PR3減少ROS的產(chǎn)生進而改善病理性心肌肥厚。

JAK/STAT3是S1P下游的一條重要的信號通路。以往研究表明，S1P能激活JAK/STAT3信號通路發(fā)揮保護心臟的作用[14， 27]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)S1P可能通過S1PR3激活JAK/STAT3信號通路從而發(fā)揮其心臟保護作用。但仍需在未來的研究中，通過體內(nèi)、外實驗明確S1P是否通過S1PR3/JAK/STAT3信號通路發(fā)揮抗病理性心肌肥厚和抗氧化應激的作用。

在本研究中，我們選擇使用S1PR3-/-小鼠進行研究，而不是選擇心肌細胞S1PR3基因特異性敲除鼠，是由于目前并無明確的對S1PR3與心力衰竭病理性心肌肥厚之間的關(guān)系的文獻報道。另外，S1P是否通過心肌細胞上的S1PR3發(fā)揮抗心力衰竭病理性心肌肥厚的作用也尚未見報道，以及S1P是否通過心臟中非心肌細胞上的S1PR3對心肌細胞產(chǎn)生影響進而發(fā)揮抗心力衰竭病理性心肌肥厚的作用也尚未明確。所以，本研究設想首先通過構(gòu)建S1PR3-/-小鼠，明確S1P/S1PR3與心力衰竭病理性心肌肥厚之間的關(guān)系，在后續(xù)的實驗中進一步探究S1P是通過心臟中哪種細胞類型上的S1PR3發(fā)揮抗心力衰竭病理性心肌肥厚的作用。

本研究存在不足之處：本次研究尚未闡明S1P通過心臟中哪一種細胞類型上的受體發(fā)揮其生物學效應，這需要建立心肌細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等細胞類型的條件性S1PR3基因敲除鼠來進行下一步的研究。此外，還需要在體內(nèi)外實驗中探索S1P是否通過S1PR3激活JAK/STAT3信號通路發(fā)揮抗病理性心肌肥厚和抗氧化應激的作用。綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)，S1P通過S1PR3發(fā)揮抗病理性心肌肥厚和抗氧化應激的作用，且可能通過JAK/STAT3信號通路發(fā)揮該作用，為防治心力衰竭的藥物研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，未來可通過激活S1PR3從而延緩心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。

利益沖突：無