連家勝， 鄔嘉琦， 宋彩銀， 康丹菊， 周光現(xiàn)

(廣東海洋大學濱海農(nóng)業(yè)學院，廣東 湛江 524088)

抗生素耐藥性在全球廣泛存在，近些年報道每年都有幾十萬人死于抗生素耐藥。耐藥細菌產(chǎn)生主要歸于人們對抗生素的濫用，尤其是在畜牧業(yè)中的應用，2012年美國在畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域售賣14 800 t抗生素，歐盟國家售賣8 000 t抗生素[1]。1950—2020年，抗生素在畜牧業(yè)飼料添加應用已有70年歷史[2-3]?？股卦谛竽翗I(yè)中使用量已超過人用量，抗生素在畜牧業(yè)養(yǎng)殖種起著重要作用。但為了人民生活健康，各國陸陸續(xù)續(xù)開始了抗生素在飼料添加劑中的禁用?？股氐慕?，對養(yǎng)殖有不小沖擊。因此，新型的抗菌方案孕育而生?？咕淖鳛樾滦涂咕镔|(zhì)，具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)良特性，在畜牧業(yè)具有較大應用價值和潛力，具備完全替代抗生素的能力[4-5]。天然抗菌肽并非完美，有的在抗菌的同時對機體有一定損傷，如溶血性和細胞毒性。通過人工設(shè)計優(yōu)化抗菌肽，可以增強抗菌活性降低溶血性風險[6]。

蜂毒肽(melitten)為蛋白質(zhì)多肽類，由26個氨基酸組成，據(jù)報道研究表明該多肽具有抗菌、抗病毒和抗炎等多種藥理學作用[7-8]。蜂毒肽可融入質(zhì)膜，可以使細菌內(nèi)物質(zhì)泄漏或使細菌質(zhì)壁分離，從而導致細菌死亡。金環(huán)蛇抗菌肽(cathelicidin_BF)由30個氨基酸組成，具有廣譜的抗菌活性，不僅對細菌、某些真菌以及病毒具有非常強的殺菌活性[9]。抗菌肽的獲取面臨兩大難題，一是獲取具有良好抗菌效果且對動物機體無損傷的抗菌肽，一是抗菌肽制備工藝問題。天然抗菌肽含量豐富但提取成本較高，合成抗菌肽也面臨成本較高問題，不利于經(jīng)濟生產(chǎn)。

國內(nèi)外研究表明設(shè)計合成許多種雜合肽，在抑菌等效果明顯優(yōu)于天然肽，且降低了毒性和溶血性?？咕淖鳛樾滦惋暳咸砑觿?，抗生素替代品，具有較高的研究價值。改造已有抗菌肽，并設(shè)計新抗菌肽分子是創(chuàng)造高活力抗菌肽的有效途徑，通過生物合成降低抗菌肽獲取成本。為了獲得優(yōu)良的抗菌肽，這就需要在設(shè)計改造前對抗菌肽進行生物信息等理化性質(zhì)分析，從而為抗菌肽分子的改造和設(shè)計提供足夠的理論依據(jù)。總之，新型雜合肽的設(shè)計優(yōu)化等研發(fā)對解決天然抗菌肽存在的問題有著重要的意義和實用價值。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取蜂毒肽(GI：EU753183.1)C端序列GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ為新雜合肽N端序列，選取金環(huán)蛇抗菌肽(GI：JQ867103.1)C端序列KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF為新雜合肽C端序列。

1.2 方 法

1.2.1 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的理化性質(zhì)分析 借助ProtParam工具[10](https://web.expasy.org/protparam/)對雜合抗菌肽Melitten-cathelicidin_BF進行分子量、等電點、相對分子質(zhì)量、親水疏水性等理化參數(shù)預測。

1.2.2 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的親疏水性分析 利用ProtScale工具[11](https://web.expasy.org/protscale/)分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF氨基酸位點的疏水性/親水性，分別選擇Hphob./Kyte & Doolittle和Hphob./Hopp & Woods算法進行分析，滑窗大小為9，線性加權(quán)模型。

1.2.3 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的跨膜區(qū)和信號肽分析 利用TMHMM-2.0工具[12](https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的跨膜區(qū)。利用SignalP 5.0 Server工具[13](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的信號肽，選擇真核生物類別進行分析。

1.2.4 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的糖基化和磷酸化位點預測 利用NetOGlyc 4.0 Server工具[14](http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)和NetPhos 3.1 Server工具[15](http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的糖基化和磷酸化位點。

1.2.5 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的二級結(jié)構(gòu)分析 利用SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的二級結(jié)構(gòu)組成與分布，選擇構(gòu)象狀態(tài)數(shù)4(包括螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲)、相似閾8、窗口寬度17。

1.2.6 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的酶切位點分析 通過PeptideCutterL在線工具https://web.expasy.org/peptide-cutter/分析該雜合肽蛋白酶切割的潛在位點。解析其安全性。

1.2.7 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的三維結(jié)構(gòu)分析 通過SWISS-MODEL在線工具https://swissmodel.expasy.org/interactive分析比對雜合肽Melitten-cathelicidin_BF匹配情況，再通過I-TASSER在線工具https://zhanggroup.org/I-TASSER/構(gòu)建雜合肽三維結(jié)構(gòu)。

1.2.8 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的功能分析 通過interpro在線工具http://www.ebi.ac.uk/interpro分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF功能作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜合抗菌肽Melitten-cathelicidin_BF的理化性質(zhì)分析

該雜合肽一級序列為GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQKFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF。利用ProtParam進行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明Melitten-cathelicidin_BF共含有56個氨基酸殘基，分子式為C307H516N86O66，預測分子量為6.47 kDa，理論等電點為12.20。該雜合肽由14種基本氨基酸組成，其中賴氨酸(Lys)含量最高，占氨基酸總數(shù)的21.4%，其次為精氨酸(Arg)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)和纈氨酸(Val)，分別均占氨基酸總數(shù)的8.9%，帶負電的殘基(Asp+Glu)數(shù)為1個，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)數(shù)為17個(表1)。該雜合肽在不同環(huán)境中半衰期預測，在哺乳動物細胞中約為30 h，在酵母中>20 h，在大腸桿菌中>10 h。不穩(wěn)定指數(shù)為25.95，脂肪族氨基酸指數(shù)為100.89，總親水性平均系數(shù)GRAVY值為-0.161，表明該雜合肽為親水性蛋白。

表1 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的氨基酸組成

2.2 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的親疏水性分析

利用ProtScale進行雜合肽Melitten-cathelicidin_BF氨基酸位點的親疏水性預測。Hphob./Kyte & Doolittle方法其值大于0表示具有較強疏水性，小于0具有較強的親水性；Hphob./Hopp & Woods方法其小于0表示具有較強疏水性，大于0具有較強親水性。綜合兩種方法，該雜合肽在預測結(jié)果顯示位點5～19區(qū)域具有強疏水性；位點20～49區(qū)域表現(xiàn)為親水性。雖然Hphob./Kyte & Doolittle和Hphob./Hopp & Woods算法不同，但每個氨基酸親疏水性強弱都能夠在一定程度上得到展現(xiàn)。這兩種算法，都表明該雜合肽整體呈親水性。

注：橫坐標表示氨基酸位置，縱坐標表示不同算法的值。

2.3 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的跨膜區(qū)和信號肽分析

經(jīng)TMHMM-2.0分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF無跨膜區(qū)(圖2A)。第4～21氨基酸，在膜上和在里面的概率在0.1～0.2，而在外的概率均大于0.6。第22～56氨基酸，在外的概率均大于0.7，在膜上概率為0。SignalP分析結(jié)果表明雜合肽Melitten-cathelicidin_BF無信號肽(圖2B)。

注：A-跨膜區(qū)預測；B-信號肽預測。

2.4 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的糖基化和磷酸化位點分析

經(jīng)NetOGlyc軟件分析，雜合肽Melitten-cathelicidin_BF存在5個糖基化位點，分別是第10和11位的蘇氨酸殘基，第18、35和53位的絲氨酸殘基，得分分別為0.175，0.264，0.220，0.100，0.052。經(jīng)NetPhos軟件分析，雜合肽Melitten-cathelicidin_BF共有1個絲氨蘇氨酸磷酸化位點(得分0.886)和1個蘇氨酸磷酸化位點(得分均>0.5)(圖3)。

圖3 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的磷酸化位點預測

2.5 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的二級結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)SOPMA軟件分析，雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋占比64.29%，由36個氨基酸殘基參與；延伸帶占比8.93%，由5個氨基酸殘基參與；轉(zhuǎn)角占比7.14%，由4個氨基酸殘基參與；無規(guī)則卷曲占比19.64%，由11個氨基酸殘基參與(圖4)。表明雜合肽Melitten-cathelicidin_BF二級結(jié)構(gòu)的主要元件為α螺旋和無規(guī)則卷曲。

注：①為α螺旋，②為延伸帶,③為無規(guī)則卷曲，④為β轉(zhuǎn)角。

2.6 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的酶切位點分析

由表5可知：雜合肽Melitten-cathelicidin_BF可被17種蛋白酶剪切，同一位點可被多種蛋白酶剪切，該肽含有的56個氨基酸殘基均可作為酶切位點。其中，13種蛋白酶有≥5個剪切位點，天冬氨酸-N端+谷氨酸-N端肽鏈內(nèi)切酶、糞臭素酶、谷酰基肽鏈內(nèi)切酶、Iodosobenzoic acid、脯氨酸肽鏈內(nèi)切酶和葡萄球菌的肽酶I僅有1個剪切位點。

表5 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的酶切位點

2.7 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的三維結(jié)構(gòu)分析

利用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫比對雜合肽Melitten-cathelicidin_BF結(jié)構(gòu)信息。比對發(fā)現(xiàn)該雜合肽分別與數(shù)據(jù)庫中Melittin(SMTL ID：3qrx.1)(圖5A)和Cathelicidin-like peptide(SMTL ID：2mwt.1)匹配率高(圖5B)，相似度達到100%和73.53%，GMEQ值分別為0.19和0.44。通過I-TASSER在線軟件對雜合肽建模分析(圖5C)，其C-score值為-2.17，說明蛋白質(zhì)模型相對可靠。

注：A，與Melittin匹配模型；B，與Cathelicidin-like peptide匹配模型；C，I-TASSER在線分析模型。

2.8 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF功能分析

雜合肽Melitten-cathelicidin_BF為人工合成肽，具有蜂毒肽和金環(huán)蛇抗菌肽部分或全部功能。通過功能分析，該雜合肽為蛋白酶抑制劑類肽，具有蛋白酶抑制劑系列功能(圖6)。該雜合肽無信號肽、無跨膜區(qū)，且該雜合肽為陽離子肽，可通過靜電吸附作用貼在細菌表面形成“氈子”結(jié)構(gòu)，從而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)。

圖6 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF功能預測分析

3 討 論

絕大部分抗菌肽為陽離子肽，可以通過與帶負電荷的細胞膜相互作用，破壞膜完整性從而殺死細胞，也可通過抑制蛋白質(zhì)、DNA和RNA的合成，或相互作用有特定的細胞內(nèi)目標，從而達到抑菌或殺菌效果[16-19]。然而抗菌肽的抗菌活性及其生物學特性，受到肽鏈長度、氨基酸組成和空間結(jié)構(gòu)等因素的影響[20-21]。因此，可以通過優(yōu)化肽氨基酸組成及其數(shù)量，改變肽鏈長度或是拼接組成新型雜合抗菌肽，獲取較理想的抗菌肽片段。自然界中雖存在大量抗菌肽，但提取不易、提取成本高，故此采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽是目前首選的方式。該技術(shù)成熟并具有一定的預測性。生產(chǎn)前可以通過生物信息學方式，對抗菌肽理化性質(zhì)進行系統(tǒng)分析，進而對所生產(chǎn)抗菌肽抗菌效果及其抗菌方式進行評估。

本研究選取抗菌肽為蜂毒肽和金環(huán)蛇抗菌肽，分別源于蜜蜂和金環(huán)蛇兩個物種。蜂毒肽是蜂毒的主要成分，由26個氨基酸組成，具有兩極性。小劑量蜂毒肽具有廣泛的抗炎作用，高劑量蜂毒肽會引起局部疼痛、瘙癢和發(fā)炎等癥狀[22]；蜂毒肽為致敏肽，需要降低致敏性再投入使用。金環(huán)蛇抗菌肽由30個氨基酸組成，具有抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫作用，其負面報道鮮少[23]。本研究將蜂毒肽和金環(huán)蛇抗菌肽融合表達形成56個氨基酸新肽，其作用是否具有二者效果有待進一步研究。通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)新肽具有抗菌肽顯著特點，新型雜合肽為陽離子肽，具有兩親性，主要有α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)組成。推測該融合肽具有一定抗菌效果。該合成肽通過蛋白質(zhì)功能預測發(fā)現(xiàn)該肽為蛋白酶抑制劑類肽動物機體內(nèi)酶系繁多，可降解不同底物。本研究通過酶切位點分析發(fā)現(xiàn)，雜合肽Melitten-cathelicidin_BF能被18種蛋白酶消化，雖不利于該雜合肽在機體內(nèi)穩(wěn)定存在，但有助于消除生物潛在危害，提高抗菌肽生物安全性。雜合肽Melitten-cathelicidin_BF多次被酶解轉(zhuǎn)化，易形成小分子氨基酸類物質(zhì)，易于機體吸收?；陔s合肽Melitten-cathelicidin_BF潛在威脅較小，有望成為新型抗生素替代添加劑飼料，從而解決畜牧業(yè)中微生物耐藥等健康養(yǎng)殖問題。

3 結(jié) 論

雜合肽Melitten-cathelicidin_BF為人工合成小分子、無信號肽、無跨膜區(qū)，且該雜合肽為陽離子肽，可通過靜電吸附作用達到抗菌效果。該肽易被生物體內(nèi)多種蛋白酶酶解，故此具有良好的安全性，具有作為抗菌飼料添加劑潛力。