賈雅婷，胡慧慧，翟亞軍，趙冰，何坤，潘玉善，胡功政，苑麗

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046

0 引言

【研究意義】 質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因水平散播是導(dǎo)致臨床中多重耐藥菌急劇增多的重要原因之一。IncFⅡ質(zhì)粒是大腸埃希菌中最常見的攜帶基因的接合型質(zhì)粒，可在不同菌屬間通過質(zhì)粒接合作用進(jìn)行水平傳播。H-NS核蛋白為常見的負(fù)調(diào)控蛋白，可調(diào)控外源性基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。但是，H-NS能否調(diào)控經(jīng)接合作用獲得的IncFⅡ質(zhì)粒，以及調(diào)控其接合轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明晰。本研究旨在通過研究 H-NS對 IncFⅡ質(zhì)粒接合的調(diào)控作用及機(jī)制，以期為控制IncFⅡ質(zhì)粒介導(dǎo)的多重耐藥基因水平快速散播提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】IncFⅡ質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因水平傳播是耐藥基因在菌屬間快速散播的重要途徑之一，是腸桿菌科細(xì)菌獲得耐藥的最重要途徑，也是大腸埃希菌中最常見的流行性接合質(zhì)粒。研究發(fā)現(xiàn)，IncFⅡ質(zhì)粒不僅在基因的傳播中發(fā)揮了重要作用，同時也參與了許多其他耐藥基因（如、、、和等）在菌屬間的水平傳播，從而對人和動物的健康造成嚴(yán)重威脅。H-NS是一種廣泛存在于革蘭陰性菌中的核酸樣 DNA結(jié)合蛋白，能夠負(fù)調(diào)控細(xì)菌獲得的大量外源性基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。研究證實，H-NS自身能夠形成同源或異源二聚體，與富含AT的DNA序列結(jié)合形成DNA-HNS復(fù)合物，從而抑制相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，且H-NS的抑制作用主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄啟動水平。tra基因是IncFⅡ質(zhì)粒常見的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移基因，tra基因的操縱子是一個長為33.3 kb的多順反子，P為啟動子，其編碼了質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移所必需的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)，只有tra基因正常表達(dá)，IncFⅡ等接合型質(zhì)粒才能完成接合轉(zhuǎn)移。tra基因的表達(dá)受TraJ和 TraM調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，2004年，WILL等人證明了H-NS可在細(xì)菌進(jìn)入生長穩(wěn)定期后抑制 F質(zhì)粒中和的表達(dá)。2006年，WILL等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)H-NS可阻遏F質(zhì)粒操縱子的P啟動子的轉(zhuǎn)錄。但是，H-NS核蛋白對 IncFⅡ質(zhì)粒的接合作用是否也具有調(diào)控作用尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內(nèi)外關(guān)于IncFⅡ質(zhì)粒的報道較多，但主要集中在其質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及攜帶的耐藥基因散播方面，有關(guān)H-NS對IncFⅡ質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的調(diào)控分子機(jī)制尚未見有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過揭示H-NS調(diào)控IncFⅡ質(zhì)粒接合作用的靶基因、確切調(diào)控方式和調(diào)控位點，從而明晰H-NS調(diào)控IncFⅡ質(zhì)粒接合作用的分子機(jī)制，以期為臨床深入研究控制IncFⅡ質(zhì)粒介導(dǎo)的多重耐藥基因水平快速散播提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，大腸埃希菌 J53（耐疊氮鈉）為質(zhì)粒接合試驗的受體菌。pEC011是河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院藥理實驗室從雞大腸埃希菌ST117分離株中發(fā)現(xiàn)的含有多種耐藥基因（、和）的IncFⅡ（F33: A-: B-）質(zhì)粒。pKP302為無啟動子的報告質(zhì)粒。下列菌株均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院藥理實驗室構(gòu)建保存：（1）缺失株 Δ和回補株 Δ/p；（2）菌株 F25922、FΔ和 FΔ/p為攜帶 pEC011（IncFⅡ）質(zhì)粒的重組菌（含頭孢噻肟抗性），是將 pEC011質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)分別導(dǎo)入大腸埃希菌ATCC25922、Δ和 Δ/p菌中。（3）重組菌pBAD25922是將pBAD質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸埃希菌ATCC25922。LB肉湯、LB瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基等均購于北京路橋技術(shù)有限公司。無水乙醇（≥99.7%）、異丙醇（≥99.7%）、氯仿（≥99.0%）、RNase-free水購于北京奧萊博科技有限公司；RNAiso Plus、Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光染料 TB Green?Premix Ex Taq? Ⅱ（Tli RNaseH Plus）均購自 TaKaRa公司；β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒購于Promega公司，96孔化學(xué)發(fā)光板購于美國Corning公司；EMSA試劑盒購于賽默飛，使用時均在有效期內(nèi)。本研究于2019年1月至2021年3月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院藥理實驗室完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長曲線測定 分別挑取大腸埃希菌ATCC25922、pBAD25922、F25922、FΔ和 FΔ/p單菌落至LB肉湯中，其中pBAD25922和回補菌株FΔ/p用0.2% L-阿拉伯糖誘導(dǎo)（下同），培養(yǎng)至OD約為0.5，按1∶1 000轉(zhuǎn)接至新的LB肉湯，在 0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11和12 h分別檢測受試菌的OD值，試驗重復(fù)3次，繪制生長曲線。

1.2.2 接合試驗 以重組菌 F25922、FΔ和FΔ/p為供體菌，大腸埃希菌J53為受體菌，分別培養(yǎng)至OD值為0.5后，按1∶1混合培養(yǎng)4 h，吸取1 mL菌液依次進(jìn)行10倍稀釋，并將不同稀釋倍數(shù)的菌液均勻涂布于含適量疊氮鈉和頭孢噻肟的雙抗麥康凱平板和僅含適量頭孢噻肟的單抗麥康凱平板，37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。選取菌落數(shù)在30—300之間稀釋倍數(shù)的平板進(jìn)行菌落計數(shù)。按下式計算各重組菌中IncFⅡ質(zhì)粒的接合頻率：接合頻率=接合子菌落數(shù)×10/供體菌菌落數(shù)×10（x，y為稀釋倍數(shù)）。

1.2.3 實時熒光定量PCR 選取3個質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、和進(jìn)行實時熒光定量PCR，通過Primer Premier 5.0設(shè)計引物并由北京擎科新業(yè)生物科技有限公司合成，引物序列見表1。分別挑取F25922、FΔ和FΔ/p的單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，其中回補菌株FΔ/p用0.2% L-阿拉伯糖誘導(dǎo)，培養(yǎng)至 OD值為 0.5時，用 Trizol法提取細(xì)菌總RNA。去除gDNA后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL gDNA去除反應(yīng)后產(chǎn)物、1 μL Prime Script RT Enzyme Mix1、1 μL RT Primer Mix、4 μL 5×Prime Script Buffer2和4 μL RNase-free HO。反應(yīng)條件為37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。最后以反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA為模板，以16S rRNA為內(nèi)參，使用各個待測基因的RT-qPCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。每個樣品設(shè)置3個平行，反應(yīng)體系為12.5 μL TB GreenⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）、上下游引物各 1、2 μL（＜100 ng）cDNA模板和8.5 μL ddHO。

表1 本研究所用到的引物序列Table 1 Sequences of primers used in this study

1.2.4 β-半乳糖苷酶活性測定 以pEC011（IncFⅡ）質(zhì)粒為模板，用帶有R I和H I雙酶切位點的引物P-F/R、P-F/R和P-F/R擴(kuò)增、和的完整啟動子區(qū)序列（各引物序列見表1）并克隆到pKP302質(zhì)粒上，將重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化入F25922、FΔ和 FΔ/p中，得到融合報告菌株F25922/P（P/P）、FΔP（P/P）和 FΔ/pP（P/P）。

將報告菌株分別接種至LB肉湯中，其中回補菌株FΔ/p的融合報告菌株用0.2% L-阿拉伯糖誘導(dǎo)，培養(yǎng)至OD值均約為0.5時，離心收集菌體，用PBS沖洗兩遍；用10倍體積的buffer（含50 mmol·L葡萄糖、10 mmol·LEDTA、25 mmol·LpH8.0的Tris和4 mg·mL溶菌酶）將沉淀懸浮，室溫孵育5 min，冰上孵育30 min；4 ℃離心后取上清液，按照β-半乳糖苷酶檢測試劑盒說明書操作檢測活性大小?；钚源笮∮肕iller Units衡量，表示單位個數(shù)細(xì)胞在單位時間內(nèi)A的變化。Miller Units=10×[(OD-1.75 ×OD)]/(T×V×OD)（其中T為反應(yīng)時間，min；V：用于檢測樣品上清體積，μL）。

1.2.5 電泳遷移率變動分析試驗（EMSA） 構(gòu)建H-NS蛋白原核表達(dá)載體，采用鎳離子親和層析法純化H-NS蛋白。用于與蛋白結(jié)合的啟動子序列由PCR擴(kuò)增或退火得到（引物序列見表1）；按照EMSA試劑盒說明書操作。具體方法如下：10 μL反應(yīng)體系包括：10×結(jié)合反應(yīng)液4 μL，啟動子DNA序列200 ng，H-NS蛋白200—1 000 ng，雙蒸水補足至10 μL，30℃反應(yīng)30 min 后加入 2 μL 6×EMSA gel-loading solution，充分混勻。反應(yīng)產(chǎn)物在200 V電壓，4℃條件下進(jìn)行（6%）非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后取下膠片置于塑料容器內(nèi)，加入50 mL SYBR Green 染色液，50 r/min搖床染色20 min，用去離子水清洗膠片后照膠保存。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。用 t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，＜0.001為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 生長曲線

F25922、pBAD25922與大腸埃希菌ATCC25922菌株生長曲線相似，均在1.5 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，且達(dá)到穩(wěn)定期的 OD值相近，說明質(zhì)粒 pEC011（IncFⅡ）和pBAD的導(dǎo)入并沒有明顯影響菌株的生長速度。菌株FΔ和FΔ/p適應(yīng)性比較差，生長速度明顯較F25922緩慢，且在3 h后才進(jìn)入對數(shù)生長期，達(dá)到穩(wěn)定期的OD值明顯低于F25922（圖1），說明H-NS缺失后重組株不僅適應(yīng)性較差，而且生長速度較慢。

圖1 hns缺失菌株的生長曲線Fig. 1 Growth curves of hns deleted strains

2.2 接合試驗

各受試菌中的 IncFⅡ質(zhì)粒的接合頻率結(jié)果如圖2所示。缺失重組菌FΔ中IncFⅡ質(zhì)粒的接合頻率極顯著高于F25922，且比后者高1 279.33倍（＜0.001），說明的缺失會導(dǎo)致IncFⅡ質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率升高。而回補菌株FΔ/p中IncFⅡ質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移頻率盡管仍未完全恢復(fù)到對照菌的原有水平，但已極顯著低于 FΔ（＜0.001）。上述試驗結(jié)果證明H-NS能明顯負(fù)調(diào)控pEC011（IncFⅡ）質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。

圖2 pEC011（IncFⅡ）質(zhì)粒的接合頻率Fig. 2 Conjugation transfer frequencies for IncFⅡ plasmid pEC011

2.3 實時熒光定量PCR

不同菌株中的、和的mRNA相對表達(dá)量見圖3。

圖3 3種接合轉(zhuǎn)移基因mRNA的表達(dá)量Fig. 3 The expression levels of 3 selected transfer genes involved in conjugation

由圖3可知，缺失重組菌FΔ中3基因的mRNA相對表達(dá)量均極顯著高于對照菌（＜0.001），其中的mRNA表達(dá)量最高，為F25922的1 510.14倍；其次是，是 F25922的 448.14倍；而的mRNA相對表達(dá)水平是F25922的81.54倍。同時，與缺失重組菌FΔ相比，回補菌株FΔ/p3個基因的 mRNA的相對表達(dá)量均有不同程度的降低，盡管仍明顯高于對照菌F25922。上述結(jié)果證明H-NS通過顯著下調(diào)pEC011（IncFⅡ）質(zhì)粒的、和的mRNA表達(dá)量而抑制該質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。

2.4 β-半乳糖苷酶活性測定

9株報告菌株經(jīng)活化培養(yǎng)后，用試劑盒檢測其β-半乳糖苷酶活性，結(jié)果見圖4。由圖可知，缺失重組菌 FΔ不同啟動子（P、P和 P）的 β-半乳糖苷酶活性均極顯著高于對照菌的相應(yīng)啟動子（＜0.001），且分別是后者的21.91、10.45和5.66倍。而缺失回補株FΔ/p不同啟動子（P、P和P）的 β-半乳糖苷酶活性均恢復(fù)到對照菌 F25922的相應(yīng)水平，說明H-NS可減弱3個tra基因的啟動子P、P和P的活性。同時，H-NS對3個啟動子P、P、P的調(diào)控有明顯差異（＜0.001），其中對啟動子P調(diào)控作用最強(qiáng)，其次為P。

圖4 受試菌不同啟動子的β-半乳糖苷酶活性Fig. 4 β-galactosidase activity of difference promoters of reporter strains

2.5 EMSA試驗

首先分別用較長的啟動子序列P（488 bp）、P（403 bp）和P（377 bp）與H-NS蛋白進(jìn)行EMSA試驗。結(jié)果顯示，H-NS蛋白可明顯阻滯P、P和P的遷移（圖5）。隨后參考相關(guān)文獻(xiàn)，預(yù)測了H-NS與、和的結(jié)合位點，并用EMSA對預(yù)測的結(jié)合位點進(jìn)行驗證，確定了當(dāng)啟動子長度為20—25 bp時，啟動子中AT含量≥60%的區(qū)域均可與H-NS蛋白結(jié)合（圖6）。結(jié)合區(qū)域的啟動子序列分別為：P25：5′-TTGTTTCAGAATATAAAAGGTACTG-3′；P25：5′-ATTGAAACTGAAAATCGCCGATGCA-3′；P20：5′-GTTAAGTAAATGTTAAATAA-3′。

圖5 H-NS與tra基因啟動子的結(jié)合Fig. 5 H-NS protein binding to the promoters of tra gene

圖6 H-NS與tra基因啟動子的結(jié)合位點Fig. 6 The binding sites of H-NS protein and the promoters of tra genes

3 討論

3.1 hns缺失株和回補株的生長情況

生長曲線結(jié)果顯示，缺失重組菌 FΔ的生長速度明顯低于大腸埃希菌ATCC25922和F25922，說明 hns基因的缺失會導(dǎo)致細(xì)菌生長適應(yīng)性變差，細(xì)菌的生長速率變慢。2017年，DE LA CRUZ等在研究產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌IV型菌毛（Longus）的表達(dá)受 LngR、LngS以及 H-NS、CpxR和 CRP等的調(diào)控中發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（ETEC）E9034A中缺失了后其生長也明顯受到影響，生長速率明顯比原菌株低，即與本試驗結(jié)果相似，H-NS的缺失會導(dǎo)致菌株的適應(yīng)性變差和生長速度變慢，但不影響菌株的存活。2020年，HUANG等在研究H-NS在鮑曼不動桿菌中的作用時，發(fā)現(xiàn)會通過影響VIM-2或SPM-1的表達(dá)而減慢鮑曼不動桿菌的生長速度。而本試驗中 hns基因影響大腸埃希菌生長速度的機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。而回補重組菌FΔ/p的生長速度與缺失株FΔ類似，進(jìn)一步證明了pBAD質(zhì)粒的導(dǎo)入并未明顯影響宿主菌的生長繁殖。但是，回補后，F(xiàn)Δ/p的生長速度仍明顯較對照菌差，推測可能與回補株的構(gòu)建方法有關(guān)。本試驗構(gòu)建的回補菌株是將全序列克隆連接至表達(dá)載體pBAD后，再經(jīng)電轉(zhuǎn)將其導(dǎo)入缺入株Δ中，從而生成Δ/ p，即回補重組菌FΔ/p中的位于pBAD質(zhì)粒上，與原菌的位于染色體基因組中，兩者的表達(dá)量可能有一定差異。

3.2 H-NS負(fù)調(diào)控IncFⅡ型質(zhì)粒pEC011的接合轉(zhuǎn)移

接合試驗結(jié)果顯示的缺失能明顯增高pEC011（IncFⅡ）質(zhì)粒的接合頻率，初步證明對pEC011（IncFⅡ）質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移呈負(fù)調(diào)控作用。2014年，WILL等研究發(fā)現(xiàn)，H-NS對啟動子的保守序列有沉默作用，雖然這種沉默作用可在PhoP與SlyA的協(xié)同作用下被消除。2018年，LU等也證明H-NS對P啟動子的沉默可以被TraJ和ArcA消除，從而激活F型質(zhì)粒的接合，這些研究均表明能影響 F型質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移頻率，與本研究結(jié)果相類似。但是，前人在研究H-NS調(diào)控機(jī)制時僅涉及到和P啟動子，并未研究其對其他（如和）和其他啟動子（P和P）有無調(diào)控作用。為弄清其調(diào)控的確切方式和位點，我們進(jìn)一步完成了實時熒光定量PCR、Z融合報告菌株的β-半乳糖苷酶活性測定和EMSA試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)H-NS均可顯著下調(diào)pEC011（IncFⅡ）質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、和的mRNA表達(dá)量，證明了H-NS核蛋白不僅能抑制的表達(dá)，而且還能同時抑制和的表達(dá)，解釋了在細(xì)菌對數(shù)生長期間，缺失株FΔ的IncFⅡ質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移大幅上升的原因。9株融合報告菌株（F25922/P（P/P）、FΔ/P（P/P）和 FΔ/p/P（P/P））的 β-半乳糖苷酶活性測定結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，缺失重組菌FΔ的3個啟動子活性（P、P和P）較對照菌的啟動子均極顯著增強(qiáng)。同時，EMSA結(jié)果表明H-NS均可與traM、traJ和traY基因的啟動子區(qū)（P、P和P）結(jié)合，當(dāng)將 P、P和 P的序列分別截短至 20—25 bp（AT≥60%）時，H-NS蛋白仍能與之結(jié)合，即H-NS蛋白可選擇性的與調(diào)控基因啟動子區(qū)的 AT富集區(qū)發(fā)生結(jié)合。上述結(jié)果不僅證明了 H-NS能直接與的啟動子區(qū)結(jié)合，而且還創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)H-NS能直接與和的啟動子區(qū)結(jié)合，從而直接下調(diào)3種tra基因的表達(dá)，并顯著抑制IncFⅡ質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。

4 結(jié)論

本研究表明H-NS蛋白的確切調(diào)控方式是通過直接與pEC011（IncFⅡ）質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、和啟動子區(qū)的AT富集區(qū)結(jié)合，通過抑制啟動子的活性，從而導(dǎo)致啟動子下游相關(guān)轉(zhuǎn)移基因、和的表達(dá)量下降而直接產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用，為臨床深入研究控制多重耐藥雞大腸埃希菌IncFⅡ質(zhì)粒介導(dǎo)的多重耐藥基因水平快速散播提供理論依據(jù)。