李德龍，王思媛，楊云川，劉泓邑，何憶簫，劉錦琳，高繼業(yè)，李繼祥*，陳思懷*

(1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460； 2.西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心，重慶 402460)

鴨疫里氏桿菌()是一種不運(yùn)動(dòng)、無芽胞、革蘭陰性短小桿菌，是鴨傳染性漿膜炎的主要病原，鴨疫里氏桿菌已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要病原之一。該病表現(xiàn)為急性、敗血性傳染病，發(fā)病率和死亡率均很高，一旦鴨疫里氏桿菌感染鴨群，就會(huì)迅速在鴨群中傳播，并有發(fā)展為地方流行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。由于鴨疫里氏桿菌血清型眾多，且各血清型菌株間缺少交叉免疫保護(hù)，耐藥性嚴(yán)重，目前疫苗免疫及藥物防治鴨傳染性漿膜炎均遇到困難，鴨疫里氏桿菌的致病機(jī)制及新的防治措施是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。鴨疫里氏桿菌感染可以引起雛鴨嚴(yán)重的組織損傷和炎癥反應(yīng)，但其機(jī)制尚不清楚。

補(bǔ)體系統(tǒng)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在維護(hù)機(jī)體免疫平衡及抵抗病原微生物入侵等方面發(fā)揮了重要作用。病原微生物進(jìn)入機(jī)體后，補(bǔ)體系統(tǒng)可以通過3種途徑激活：經(jīng)典途徑(classical pathway，CP)、凝集素途徑(lectin pathway，LP)和旁路途徑(alternate pathway，AP)。3種途徑最終均會(huì)級(jí)聯(lián)激活C5分子，C5分子進(jìn)一步裂解為C5a和C5b，C5b通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)與C6-C9形成攻膜復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)，MAC可通過裂解方式清除病原。C5a 可以誘導(dǎo)大量的生物學(xué)效應(yīng)，包括增加血管通透性，細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，炎癥細(xì)胞的趨化作用以及吞噬作用。而C5a發(fā)揮這些生物學(xué)效應(yīng)主要是通過其受體來介導(dǎo)和完成，它的受體有兩種，一種是C5aR，另一種是C5L2。C5aR是目前研究得最為徹底的一種受體，C5aR在許多細(xì)胞類型中均有表達(dá)，尤其在嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞中表達(dá)更為豐富。C5a與C5aR的N端結(jié)合后可誘導(dǎo)C5aR構(gòu)象改變并產(chǎn)生一系列反應(yīng)以激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和cAMP信號(hào)通路。C5a-C5aR軸與許多細(xì)菌性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，C5a-C5aR軸在某些革蘭陰性菌感染模型中可以過度激活，以誘發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。應(yīng)用C5a-C5aR軸拮抗劑(C5a抗體或C5aR抗體)能夠減緩疾病發(fā)展過程，減輕組織病變.

鴨疫里氏桿菌感染能夠引起雛鴨嚴(yán)重的纖維素性滲出性炎癥，推測(cè)在鴨疫里氏桿菌感染中C5a-C5aR軸發(fā)揮了重要作用。因此本研究通過全血試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)，從體外和體內(nèi)水平上驗(yàn)證C5a-C5aR軸激活對(duì)鴨疫里氏桿菌感染雛鴨組織損傷及炎癥反應(yīng)的影響，阻斷C5a-C5aR軸能顯著降低雛鴨發(fā)病率和死亡率及炎性因子的表達(dá)水平，減輕組織損傷。研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步闡明鴨疫里氏桿菌致病機(jī)制具有重要意義，同時(shí)也將為后續(xù)開發(fā)針對(duì)鴨疫里氏桿菌新的疫苗靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和試驗(yàn)動(dòng)物 鴨疫里氏桿菌AF株由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究室分離并保存。10日齡健康雛鴨(櫻桃谷鴨)購(gòu)自重慶永健生物技術(shù)有限公司，所有試驗(yàn)用鴨經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鴨疫里氏桿菌陰性。

1.1.2 主要試劑 鴨C5a、TNF-α、IL-6和IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司。PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、DL2000 DNA Marker、DEPC、Premix Taq、TB GreenPremix Ex TaqII購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；熒光定量PCR八聯(lián)管購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 兔抗C5a抗體和兔抗C5aR抗體制備 為制備兔抗C5a抗體和兔抗C5aR抗體，根據(jù)鴨C5(GenBank No. XP_027326464.1)和C5aR(GenBank No. XP_027303283.1)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，選取C5a和C5aR功能區(qū)序列，依據(jù)大腸桿菌最適密碼子進(jìn)行合成，將合成的C5a片段及C5aR片段克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)，分別命名為pET-32a-C5a和pET-32a-C5aR。將pET-32a-C5a和pET-32a-C5aR轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，用1.0 mmol·LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，鎳柱親和層析純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，間接ELISA測(cè)定多抗效價(jià)，Western blot鑒定多抗特異性。

1.2.2 全血試驗(yàn) 新鮮鴨外周血采自10日齡雛鴨，以肝素鈉為抗凝劑制備抗凝血。將-80 ℃保存的鴨疫里氏桿菌AF菌種劃線接種于巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)至單菌落形成；挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至飽和；細(xì)菌懸液于4 ℃條件下5 000 r·min離心15 min，菌泥用0.01 mol·LPBS(pH7.4)重懸洗滌2次，制成終濃度為1×10CFU·mL菌液。試驗(yàn)分為4組，第1～3組的5 mL抗凝血中分別加入15 μL鴨疫里氏桿菌懸液，第4組加入15 μL PBS，混勻；第1～2組分別加入15 μL的兔抗C5a抗體和兔抗C5aR抗體，第3～4組分別加入15 μL滅活兔健康血清，輕輕混勻；于37 ℃恒溫?fù)u床中孵育1、2和4 h后取樣，加入20 mmol·L乙二胺四乙酸二鈉，2 500 r·min離心10 min，分離血漿，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 動(dòng)物試驗(yàn) 依據(jù)“1.2.2”中的方法制備鴨疫里氏桿菌菌液，調(diào)整濃度為1×10CFU·mL。在進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)之前篩選兔抗C5a抗體和兔抗C5aR抗體最佳注射劑量和注射時(shí)間，經(jīng)測(cè)定，兔抗C5a抗體和兔抗C5aR抗體最佳注射劑量為0.5 mL·只，最佳注射時(shí)間為鴨疫里氏桿菌感染同時(shí)皮下注射抗體。

44只10日齡健康雛鴨隨機(jī)分為4組，每組11只，隔離飼養(yǎng)。第1～3組動(dòng)物頸部皮下注射5×10CFU·mL鴨疫里氏桿菌后，分別腿部皮下注射0.5 mL兔抗C5a抗體、C5aR抗體和滅活健康兔血清；第4組為健康對(duì)照組，頸部皮下注射0.5 mL PBS和腿部皮下注射0.5 mL滅活健康兔血清。每組動(dòng)物隨機(jī)分成2個(gè)小組，第1小組5只，用于每日觀察記錄發(fā)病率、死亡率和臨床癥狀；第2小組6只，于感染后12、24、48和72 h經(jīng)頸靜脈采血，制備抗凝血和分離血清。鴨疫里氏桿菌感染后72 h捕殺第1小組的全部雛鴨，采集心、肝和脾進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，采集肝用于載菌量測(cè)定和基因表達(dá)檢測(cè)。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查 鴨疫里氏桿菌感染72 h處死全部雛鴨，尸體剖檢觀察主要組織器官病理變化，并用10%福爾馬林固定心、肝和脾制備病理組織切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.5 血清酶活性測(cè)定 鴨疫里氏桿菌感染后12、24、48和72 h，采集各組雛鴨頸靜脈血，分離血清，利用邁瑞Mindray生化分析自動(dòng)儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)的含量。

1.2.6 外周血及肝細(xì)菌數(shù)量測(cè)定 在無菌條件下采集捕殺鴨肝組織，稱量后玻璃研磨器中研磨，加入滅菌生理鹽水混勻，室溫靜置10 min，上層勻漿液用于細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法參照文獻(xiàn)[24]，并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。利用巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板以涂布的方式進(jìn)行抗凝血和肝組織勻漿液的細(xì)菌計(jì)數(shù)，樣品10倍遞進(jìn)稀釋，每個(gè)樣品選擇3個(gè)合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度的樣品涂布3個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，0.1 mL·板。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h至菌落形成后計(jì)數(shù)。

1.2.7 C5a及炎性因子測(cè)定 利用商品化ELISA檢測(cè)全血試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)中采集的血清樣品C5a、TNF-α、IL-6和IL-1β水平。具體步驟：標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；加樣孔分為空白孔和待測(cè)樣品孔，待檢樣品孔中加樣品稀釋液40 μL和待測(cè)樣品10 μL；加入酶標(biāo)試劑100 μL·孔，空白孔除外； 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h；棄掉液體，加入洗滌液300 μL·孔，重復(fù)5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；加入終止液50 μL·孔，15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD。

1.2.8 熒光定量PCR檢測(cè)肝各基因的表達(dá) 利用Trizol抽提法提取肝總RNA，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增cDNA，熒光定量PCR檢測(cè)C5aR、鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase 1，SphK1)、纖維蛋白原樣蛋白2(fibrinogen-like protein 2，F(xiàn)GL2)、-α和-1β mRNA水平，-為內(nèi)參基因。各基因引物：C5aR-F：CAGCTCCTTGTTCAAGAGCG；C5aR-R：CATCACCACGTAGATGATGGG；SphK1-F：GAAGAAGCTGC-TGACGAACT；SphK1-R：GCCCAGGAAGGAGA-AGAAAC；FGL2-F：GTACCTGAAGTACCGTC-TAAGCG；FGL2-R：ATGCCCCACAGTTTCCTGAG；TNF-α-F：CAGATGGGAAGGGAATGAA-C；TNF-α-R：GAACTGGGCGGTCATAAAAT；IL-1β-F：GCTTCATCTTCTACCGCCTGGAC；IL-1β-R：TTAGCTTGTAGGTGGCGATGTTGAC；β-actin-F：ACCGCAAATGCTTCTAAACC：β-actin-R：ATCCTGAGTCAAGCGCCAAA。反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 12.5 μL，模板2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DEPC水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)比較值法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，先計(jì)算各組差值(ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因)；再計(jì)算ΔΔ(即Δ—Δ)，最后將結(jié)果轉(zhuǎn)化相對(duì)差異倍數(shù)(=2-ΔΔ)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采集自3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，不同組別的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)為mean±S.E.M.，用單因素方差分析和Bonferroni 檢驗(yàn)分析各組之間的差異顯著性，分析軟件是SPSS 20.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)，<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白的表達(dá)、鑒定和純化

依據(jù)大腸桿菌最適密碼子進(jìn)行序列合成，將合成的C5a片段及C5aR片段克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，分別獲得約為29和25 ku的重組目的蛋白，與預(yù)期條帶大小一致，表明成功表達(dá)重組蛋白C5a和C5aR(圖1)。經(jīng)鎳柱親和層析純化和SDS-PAGE檢測(cè)，在洗脫液中可見1條清晰的條帶，雜蛋白較少(圖2)。將純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，經(jīng)間接ELISA測(cè)定，兔抗C5a抗體和兔抗C5aR抗體效價(jià)均超過1∶12 800(表1)，且特異性良好。

M. 雙色預(yù)染蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-32a/BL21誘導(dǎo)；2. pET-32a-C5a/BL21未誘導(dǎo)；3. pET-32a-C5a/BL21誘導(dǎo)；4. pET-32a/BL21誘導(dǎo)；5. pET-32a-C5aR/BL21未誘導(dǎo)；6. pET-32a-C5aR/BL21誘導(dǎo)；▲.代表各蛋白目的條帶M. Two-color pre-stained protein marker; 1. Induced pET-32a/BL21; 2. Non-induced pET-32a-C5a/BL21; 3. Induced pET-32a-C5a/BL21; 4. Induced pET-32a/BL21; 5. Non-induced pET-32a-C5aR/BL21; 6. Induced pET-32a-C5aR/BL21; ▲. The targeted bands of the proteins圖1 pET-32a-C5a及pET-32a-C5aR重組表達(dá)SDS-PAGE分析Fig.1 Identification of pET-32a-C5a and pET-32a-C5aR by SDS-PAGE

M. 雙色預(yù)染蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-32a-C5a；2. pET-32a-C5a過柱后；3. pET-32a-C5a第1次洗滌；4. pET-32a-C5a第2次洗滌；5. pET-32a-C5a第3次洗滌；6. pET-32a-C5a第1次洗脫；7. pET-32a-C5a第2次洗脫；8. pET-32a-C5a第3次洗脫；9. pET-32a-C5aR；10. pET-32a-C5aR過柱后；11. pET-32a-C5aR第1次洗滌；12. pET-32a-C5aR第2次洗滌；13. pET-32a-C5aR第3次洗滌；14. pET-32a-C5aR第1次洗脫；15. pET-32a-C5aR第2次洗脫；16. pET-32a-C5aR第3次洗脫；▲.代表各蛋白目的條帶M. Two-color pre-stained protein marker; 1. pET32a-C5a; 2. pET-32a-C5a after column; 3. pET-32a-C5a first washing; 4. pET-32a-C5a second washing; 5. pET-32a-C5a third washing; 6. pET-32a-C5a first elution; 7. pET-32a-C5a second elution; 8. pET-32a-C5a third elution; 9. pET32a-C5aR; 10. pET-32a-C5aR after column; 11. pET-32a-C5aR first washing; 12. pET-32a-C5aR second washing; 13. pET-32a-C5aR third washing; 14. pET-32a-C5aR first elution; 15. pET-32a-C5aR second elution; 16. pET-32a-C5aR third elution; ▲. The targeted bands of the proteins圖2 pET-32a-C5a及pET-32a-C5aR的純化SDS-PAGE分析Fig.2 Purification of pET-32a-C5a and pET-32a-C5aR by SDS-PAGE

表1 C5a及C5aR多克隆抗體 ELISA 結(jié)果(OD450 nm)Table 1 ELISA results of polyclonal antibodies of C5a and C5aR (OD450 nm)

2.2 血清C5a及炎性因子表達(dá)水平

為檢測(cè)C5a-C5aR軸在鴨疫里氏桿菌感染影響補(bǔ)體系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)中的作用，ELISA檢測(cè)全血和雛鴨外周血血清中C5a、TNF-α、IL-6和IL-1β水平。在全血試驗(yàn)中，鴨外周抗凝血受到鴨疫里氏桿菌刺激后，C5a、TNF-α和IL-6表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，抗C5a抗體和抗C5aR抗體均能抑制C5a、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)(圖3)。動(dòng)物試驗(yàn)中，鴨疫里氏桿菌感染雛鴨后，各組雛鴨血清C5a、TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)也呈上調(diào)趨勢(shì)，抗C5a抗體和抗C5aR抗體均能抑制雛鴨血清C5a、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)(圖4)。結(jié)果表明，阻斷C5a-C5aR軸能夠降低鴨疫里氏桿菌感染的補(bǔ)體反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。

A. 全血中C5a表達(dá)量檢測(cè)；B. 全血中IL-1β表達(dá)量檢測(cè)；C. 全血中IL-6表達(dá)量檢測(cè)；D. 全血中TNF-α表達(dá)量檢測(cè)。ELISA檢測(cè)全血中C5a、IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)量。數(shù)據(jù)采集自3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，*表示差異顯著(P<0.05)A. Detection of C5a in the whole blood; B. Detection of IL-1β in the whole blood; C. Detection of IL-6 in the whole blood; D. Detection of TNF-α in the whole blood. ELISA was used to detect the expression of C5a, TNF-α, IL-6, IL-1β in the whole blood. Data were collected from three repeated experiments and the results were represented as mean ± SEM. An asterisk (*) shows a statistically significant difference (P<0.05)圖3 ELISA檢測(cè)全血中C5a及炎性因子表達(dá)水平Fig.3 The expression of C5a and inflammatory factors in the whole blood detected by ELISA

A. 雛鴨血清C5a表達(dá)量檢測(cè)；B. 雛鴨血清IL-1β表達(dá)量檢測(cè)；C. 雛鴨血清IL-6表達(dá)量檢測(cè)；D. 雛鴨血清TNF-α表達(dá)量檢測(cè)。ELISA檢測(cè)雛鴨血清樣品C5a、IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)量，數(shù)據(jù)采集自3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，*.P<0.05A. Detection of C5a in the serum of ducklings; B. Detection of IL-1β in the serum of ducklings; C. Detection of IL-6 in the serum of ducklings; D. Detection of TNF-α in the serum of ducklings. ELISA was used to detect the expression of C5a, TNF-α, IL-6, IL-1β in the serum of ducklings. Data were collected from three repeated experiments and the results were represented as mean±SEM. *.P<0.05圖4 ELISA檢測(cè)雛鴨血清樣品C5a及炎性因子表達(dá)水平Fig.4 The expression of C5a and inflammatory factors in the serum of ducklings detected by ELISA

2.3 阻斷C5a-C5aR軸對(duì)鴨疫里氏桿菌感染鴨發(fā)病、死亡、臨床癥狀及組織病理變化的影響

鴨疫里氏桿菌感染雛鴨后，每日觀察記錄各組雛鴨臨床癥狀，并且在感染后72 h處死雛鴨采集心、肝和脾進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果顯示，鴨疫里氏桿菌感染后，雛鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，嗜睡，縮頸蹲伏，排黃綠色稀糞，氣喘，呼吸困難等癥狀；而抗C5a抗體和抗C5aR抗體處理后雛鴨僅表現(xiàn)為蹲地不起，神經(jīng)癥狀，臨床癥狀明顯減輕。病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，組雛鴨可見明顯的黃白色纖維素性滲出物，尤其是心、肝和氣囊，主要表現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎。兩個(gè)抗體處理組雛鴨僅在心和肝可見少量的纖維素性滲出物。組鏡下病變表現(xiàn)為心肌纖維腫脹、顆粒變性，部分心肌纖維斷裂；肝表現(xiàn)為中央靜脈和肝竇充滿紅細(xì)胞，肝細(xì)胞發(fā)生水泡變性和/或脂肪變性；脾表現(xiàn)為脾竇高度擴(kuò)張、淤血及出血，白髓淋巴濾泡數(shù)量減少，淋巴細(xì)胞稀疏分布，紅髓和白髓的界限不清晰。兩個(gè)抗體處理組鏡下病變表現(xiàn)為心肌纖維輕度顆粒變性，肝細(xì)胞脂肪變性，脾結(jié)構(gòu)完整，僅見少量淋巴細(xì)胞減少及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5)。

圖5 阻斷C5a-C5aR軸對(duì)鴨疫里氏桿菌感染雛鴨主要組織病理變化的影響(標(biāo)尺：50 μm，箭頭所指為病變位置)Fig.5 The influence of blocking C5a-C5aR axis on pathological changes of main tissues in R. anatipestifer infected ducklings (Bar: 50 μm, the arrow refers to the location of the lesions)

鴨疫里氏桿菌感染雛鴨后，每日觀察記錄各組雛鴨發(fā)病率及死亡率。結(jié)果顯示，組雛鴨在感染后48 h發(fā)病率平均值為53.3%，而兩個(gè)抗體處理組雛鴨在感染后72 h內(nèi)發(fā)病率均低于50%；組雛鴨在感染后72 h存活率平均值為33.3%，而兩個(gè)抗體處理組雛鴨在感染后72 h存活率均超過70%(圖6)。

A. 鴨疫里氏桿菌感染72 h內(nèi)各組雛鴨發(fā)病率檢測(cè)；B. 鴨疫里氏桿菌感染72 h內(nèi)各組雛鴨存活率檢測(cè)A. The morbidity of ducklings in different groups was detected within 72 h after R. anatipestifer infection; B. The survival rates of ducklings in different groups were detected within 72 h after R. anatipestifer infection圖6 鴨疫里氏桿菌感染雛鴨發(fā)病率和存活率測(cè)定Fig.6 Detection of the morbidity and mortality of ducklings infected by R. anatipestifer

2.4 阻斷C5a-C5aR軸對(duì)鴨疫里氏桿菌感染鴨外周血及肝細(xì)菌數(shù)量的影響

各組雛鴨頸靜脈無菌采血制備抗凝血進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，鴨疫里氏桿菌感染雛鴨后，抗C5a抗體和抗C5aR抗體均能降低外周血細(xì)菌數(shù)量(圖7A)。并且在鴨疫里氏桿菌感染后72 h，各組無菌采集肝進(jìn)行肝組織載菌量測(cè)定。結(jié)果顯示，與組相比，兩個(gè)抗體處理組肝組織細(xì)菌載量也顯著降低(<0.05)(圖7B)。

A. 12～72 h外周血細(xì)菌數(shù)量測(cè)定；B. 72 h肝載菌量測(cè)定。*.P<0.05A. Detection of the number of bacteria in the peripheral blood on 12-72 h; B. Detection of the number of bacteria in the livers on 72 h. *.P<0.05圖7 阻斷C5a-C5aR軸對(duì)鴨疫里氏桿菌感染鴨外周血和肝細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定Fig.7 Detection of the number of bacteria in the peripheral blood and livers of R. anatipestifer infected ducklings after C5a-C5aR blockade

2.5 阻斷C5a-C5aR軸對(duì)鴨疫里氏桿菌感染鴨生化指標(biāo)的影響

外周血ALT和AST水平可以反映肝功能。結(jié)果顯示，鴨疫里氏桿菌感染后，雛鴨外周血ALT和AST水平呈上調(diào)趨勢(shì)，但是與組相比，+ anti-C5a組和+ anti-C5aR組ALT和AST水平顯著降低(<0.05)(圖8)。

A. 血清ALT水平檢測(cè)；B. 血清AST水平檢測(cè)。數(shù)據(jù)采集自3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，*.P<0.05A. Detection of serum ALT levels; B. Serum AST levels were determined at the indicated times after different treatments. Data were collected from three repeated experiments and the results were represented as mean±SEM. *.P<0.05圖8 阻斷C5a-C5aR軸對(duì)鴨疫里氏桿菌感染鴨肝生化指標(biāo)的影響Fig.8 The influence of blocking C5a-C5aR axis on biochemical criterion of liver tissues in R. anatipestifer infected ducklings

2.6 阻斷C5a-C5aR軸對(duì)鴨疫里氏桿菌感染鴨肝主要基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

熒光定量PCR檢測(cè)鴨疫里氏桿菌感染鴨肝主要基因5、1、2、-和-1mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，組5、1、2、-和-1相對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于+ anti-C5a組和+anti-C5aR組(<0.05)(圖9)。

A. C5aR mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量；B. SphK1 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量；C. FGL2 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量；D. TNF-α mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量；E. IL-1β mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量。數(shù)據(jù)采集自3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，*P<0.05A. Relative C5aR mRNA level; B. Relative SphK1 mRNA level; C. Relative FGL2 mRNA level; D. Relative TNF-α mRNA level; E. Relative IL-1β mRNA level. Data were collected from three repeated experiments and the results were represented as mean±SEM. *. P<0.05圖9 熒光定量PCR檢測(cè)鴨疫里氏桿菌感染鴨肝臟主要基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.9 The fluorescence quantitative PCR detection of mRNA transcriptional levels of major genes in the livers of ducklings infected by R. anatipestifer

3 討 論

補(bǔ)體系統(tǒng)作為天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在很多疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，例如敗血癥、創(chuàng)傷、自身免疫性疾病和癌癥等，但是補(bǔ)體系統(tǒng)在鴨疫里氏桿菌感染過程中的作用尚不清楚。一旦識(shí)別病原微生物，宿主補(bǔ)體系統(tǒng)可通過3種途徑立即被激活：CP、LP和AP。3種途徑最終均會(huì)級(jí)聯(lián)激活C5分子，隨后C5裂解為活性片段C5a和C5b以執(zhí)行相關(guān)生物學(xué)功能。C5a是否參與了鴨疫里氏桿菌感染過程以及C5a在鴨疫里氏桿菌感染過程中發(fā)揮的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，鴨疫里氏桿菌感染能夠激活宿主補(bǔ)體系統(tǒng)，強(qiáng)烈刺激C5a和炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6 和 IL-1β)表達(dá)量上調(diào)(圖1～2)。+ anti-C5a組和+ anti-C5aR組全血和動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)阻斷C5a-C5aR軸能夠降低鴨疫里氏桿菌感染對(duì)雛鴨造成的組織損傷和炎癥反應(yīng)(圖3～6)。熒光定量PCR結(jié)果表明，C5a-C5aR軸在鴨疫里氏桿菌感染過程中對(duì)SphK1和FGL2激活也起到重要作用(圖7)。

補(bǔ)體激活產(chǎn)物 C5a與其受體C5aR結(jié)合后能夠介導(dǎo)促炎反應(yīng)和趨化作用。本研究采集雛鴨外周血制備抗凝血，血液與鴨疫里氏桿菌混勻后與分別兔抗C5a抗體和兔抗C5aR抗體進(jìn)行孵育，結(jié)果顯示，C5a抗體和C5aR抗體均能顯著降低鴨疫里氏桿菌孵育后血液中C5a水平。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果也表明，+ anti-C5a組和+ anti-C5aR組雛鴨C5a水平也顯著降低，阻斷C5a-C5aR軸可有效降低鴨疫里氏桿菌感染雛鴨的發(fā)病率和死亡率；另外C5a或C5aR抗體可減輕心、肝和脾等組織的病理?yè)p傷，顯著降低雛鴨外周血細(xì)菌數(shù)量。全血試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，C5a-C5aR軸有助于鴨疫里氏桿菌感染雛鴨，并發(fā)揮了重要作用。

鴨疫里氏桿菌感染可誘發(fā)宿主強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。為驗(yàn)證C5a-C5aR 軸是否參與調(diào)控鴨疫里氏桿菌感染的炎癥反應(yīng)過程，在體內(nèi)水平和體外水平檢測(cè)主要的炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)。在全血試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)中，C5a抗體或C5aR抗體處理組3種細(xì)胞因子表達(dá)水平均顯著降低，表明在鴨疫里氏桿菌感染過程中C5a-C5aR軸可以調(diào)控這3種細(xì)胞因子的表達(dá)。以往研究顯示，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠刺激枯否細(xì)胞表達(dá)釋放IL-1β、TNF-α和其他炎癥因子，進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡。此外，隨著肝星狀細(xì)胞的激活，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，使膠原蛋白、蛋白多糖和黏連蛋白在肝中過度沉積和異常分布，造成嚴(yán)重的肝損傷。LPS已被證實(shí)是鴨疫里氏桿菌最重要的毒力因子之一，同時(shí)鴨疫里氏桿菌也可引起嚴(yán)重的肝損傷。因此，減輕炎癥反應(yīng)可以提高雛鴨存活率。在鴨疫里氏桿菌感染72 h，C5a抗體和C5aR抗體處理的雛鴨存活率均為100%，也證明了這一點(diǎn)。同時(shí)，隨著IL-1β、IL-6和TNF-α的下降，雛鴨組織損傷和主要肝功能指標(biāo)(ALT和AST)也降低，結(jié)果表明阻斷C5a-C5aR軸能夠減輕鴨疫里氏桿菌感染引起的炎癥反應(yīng)。

SphK1是一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)酶，可產(chǎn)生脂質(zhì)介質(zhì)1-磷酸鞘氨醇(S1P)。包括C5a在內(nèi)的幾種促炎刺激物均能激活巨噬細(xì)胞上的SphK1，并且阻斷SphK1會(huì)減弱炎癥反應(yīng)。有研究表明，SphK1在膿毒癥誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，C5a-C5aR軸的激活也在急性肝衰竭中SphK1的活化起重要作用。本研究應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)肝中1 mRNA水平，經(jīng)C5a抗體或C5aR抗體處理后，鴨疫里氏桿菌感染的雛鴨1的轉(zhuǎn)錄量顯著降低，表明C5a-C5aR軸在鴨疫里氏桿菌感染中對(duì)SphK1激活中也起重要作用。已有研究表明，C5a能夠激活包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)炎癥細(xì)胞中的3條主要MAPK通路，C5a-C5aR軸對(duì)于巨噬細(xì)胞p38-MAPK磷酸化所必需的，MAPK激活在C5a 誘導(dǎo)的炎性因子表達(dá)中起著重要作用。因此，鴨疫里氏桿菌感染的機(jī)制可能是C5a抗體或C5aR抗體阻斷C5a-C5aR軸，進(jìn)而導(dǎo)致p38-MAPK未被激活，巨噬細(xì)胞中SphK1的表達(dá)水平下降。除了1，作者還檢測(cè)了2在肝中的轉(zhuǎn)錄。FGL2是纖維蛋白沉積和微血管血栓形成的關(guān)鍵因子。已有研究表明，在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎模型的肝細(xì)胞壞死區(qū)域(特別是在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中)檢測(cè)到大量表達(dá)的FGL2。研究表明，C5aR、TNF-α和FGL2可以形成一個(gè)整合網(wǎng)絡(luò)，有助于病毒性肝炎過程中補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在鴨疫里氏桿菌感染后，各C5a-C5aR阻斷組雛鴨肝2 mRNA水平顯著降低，表明C5a-C5aR軸的激活在鴨疫里氏桿菌感染過程中FGL2活化也發(fā)揮了重要作用。

4 結(jié) 論

本研究成功證實(shí)C5a-C5aR軸激活有助于鴨疫里氏桿菌感染雛鴨，阻斷C5a-C5aR軸可顯著減輕雛鴨組織損傷和炎癥反應(yīng)；SphK1和FGL2的表達(dá)和活化可能有助于C5a-C5aR軸參與鴨疫里氏桿菌感染引起的炎癥反應(yīng)過程。本研究為下一步開發(fā)抗鴨疫里氏桿菌感染藥物提供了新思路。