張燕，鄭梓瑩，陳文，楊鈺斌，黃種心（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院.中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科；.病理科，福建泉州 362000）

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）占所有乳腺癌的比例為10%～20%，具有侵襲性強(qiáng)、早期復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高等特點(diǎn)[1]。目前其治療仍以化療為主，盡管已有抗PD-1/PD-L1單抗藥物被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性或不可切除局晚期TNBC[2-3]，但實(shí)際獲益人群非常有限，多數(shù)TNBC患者仍臨床預(yù)后差，晚期TNBC患者中位OS約12個(gè)月，4年生存率低于20%[1]。故尋找新的預(yù)后生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)成為臨床亟待解決的問(wèn)題。T 細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM 結(jié)構(gòu)域蛋白（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain，TIGIT）是共抑制性免疫受體，其被激活后會(huì)抑制免疫細(xì)胞活化、增殖并誘導(dǎo)免疫抑制性因子的產(chǎn)生[4-5]。CD155是TIGIT的高親和力同源配體，在細(xì)胞黏附和增殖中起重要作用，其在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲，導(dǎo)致預(yù)后不良[6-9]。TIGIT 與其配體CD155結(jié)合后，通過(guò)胞內(nèi)的ITIM結(jié)構(gòu)域傳遞抑制信號(hào)，抑制T細(xì)胞和NK 細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[10]。因此，TIGIT/CD155有望成為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)或預(yù)測(cè)預(yù)后的標(biāo)志物。本研究檢測(cè)TNBC組織中TIGIT和CD155蛋白的表達(dá)并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014 年1 月至2018 年12 月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院通過(guò)手術(shù)切除、術(shù)后病理確診為TNBC的64例女性患者的腫瘤組織。通過(guò)醫(yī)院病歷系統(tǒng)收集入組患者的臨床病理資料，通過(guò)住院、門診及電話隨訪等方式隨訪其生存預(yù)后情況。本研究通過(guò)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，倫理審批號(hào)：[2022]福醫(yī)附二倫理審字（12）號(hào)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）2014年1月至2018年12月，通過(guò)手術(shù)切除、術(shù)后病理確診為TNBC的女性患者；（2）確診前未經(jīng)過(guò)放化療、內(nèi)分泌治療等腫瘤專科治療；（3）病理蠟塊保存完好，病例資料完整可隨訪；（4）患者依從性好，能夠配合研究；（5）患者及家屬知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不符合診斷或入選標(biāo)準(zhǔn)；（2）患有不易控制的神經(jīng)、精神疾病或認(rèn)知障礙、精神障礙；（3）因自身原因無(wú)法完成隨訪及調(diào)查；（4）其他原因不適合入組。

1.2 免疫組化染色法檢測(cè)TIGIT在TNBC組織中的表達(dá)

組織切片脫蠟、水化，PBS沖洗3次，高溫抗原修復(fù)，PBS 洗3 次，3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS 洗3 次，加入一抗（抗TIGIT 單 抗，購(gòu) 自Abcam 公司，貨號(hào)ab243903，稀釋度1∶100；CD155，購(gòu)自Abcam 公司，貨號(hào)ab267389，稀釋度1∶100）室溫下孵育1 h，PBS 洗3 次，滴入增強(qiáng)液，室溫下反應(yīng)20 min，PBS洗3次，加入二抗，室溫下反應(yīng)20 min，PBS洗3次，加入辣根過(guò)氧化物酶DAB顯色。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判讀

每個(gè)組織切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野觀察，綜合切片的陽(yáng)性細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度計(jì)分，行半定量分析[11]。染色強(qiáng)度分為0～3 分：0 分為無(wú)染色，1 分為弱染色，2 分為中等染色，3 分為強(qiáng)染色；陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞數(shù)百分比的評(píng)分分為0～3 分：陽(yáng)性細(xì)胞率（以整數(shù)制計(jì)算）≤5%的為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，≥51%為3 分。以上兩者積分相乘得總分，總分0分為陰性染色，1～2分為弱陽(yáng)性（+），3～4分為陽(yáng)性（?），6～9分為強(qiáng)陽(yáng)性（?）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件處理數(shù)據(jù)。TIGIT、CD155與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's精確檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析；生存分析單因素采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多因素生存分析采用Cox回歸分析法檢驗(yàn)。所有的檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn)法，以P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNBC患者臨床病理特征

本研究總計(jì)入組64例患者，所有病例的臨床病理資料完整，入組患者年齡32～78歲，中位年齡49.5歲；絕經(jīng)前34例、絕經(jīng)后30例；腫瘤長(zhǎng)徑≤2 cm者23例，腫瘤長(zhǎng)徑＞2 cm者41例；基于美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）腫瘤分期手冊(cè)第八版的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)判定腫瘤組織的TNM分期，64例患者中，Ⅰ期15例、Ⅱ期27例、Ⅲ期22例；按照Elston和Ellis標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)：組織學(xué)分級(jí)Ⅱ級(jí)17例、組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)47例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。通過(guò)門診、住院復(fù)查及電話隨訪方式獲得患者的無(wú)病生存期（disease-free survival，DFS），隨訪截止時(shí)間：2021年12月31日?；颊咴敿?xì)資料見(jiàn)表1。

表1 64例患者的臨床病理資料(n=64)

2.2 TNBC中TIGIT表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

免疫組化染色結(jié)果（圖1）顯示，TIGIT 主要定位于TNBC 實(shí)質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜，64 例TNBC 組織中，TIGIT陽(yáng)性表達(dá)率為48.4%（31/64）。TIGIT表達(dá)與腫瘤大?。≒＜0.05）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.01）、腫瘤分期（P＜0.01）有關(guān)（表2），而與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、組織學(xué)分級(jí)、Ki-67均無(wú)關(guān)（均P＞0.05，表2）。

圖1 TNBC組織中TIGIT表達(dá)（免疫組化染色，×200，標(biāo)尺：100 μm）

2.3 TNBC中CD155表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

免疫組化染色結(jié)果（圖2）顯示，CD155主要表達(dá)于TNBC實(shí)質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，64例TNBC組織中，CD155 陽(yáng)性表達(dá)率為79.9%（51/64）。CD155表達(dá)與腫瘤大小（P＜0.05）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.01）、腫瘤分期（P＜0.01）相關(guān)，與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、組織學(xué)分級(jí)、Ki-67無(wú)關(guān)（均P＞0.05，表2）。

圖2 CD155在TNBC組織中的表達(dá)（免疫組化染色，×200，標(biāo)尺：100 μm）

表2 TIGIT和CD155表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

2.4 TIGIT、CD155表達(dá)與患者DFS的關(guān)系

采用Kaplan-Meier 生存曲線和Log-Rank 檢驗(yàn)分析TIGIT（圖3A）、CD155（圖3B）表達(dá)與TNBC 患者DFS 的關(guān)系，結(jié)果顯示，TIGIT 陰性患者平均DFS 為41.627 個(gè)月（95%CI：35.920～47.333），TIGIT 陽(yáng)性患者的平 均DFS 為20.400 個(gè) 月（95%CI：15.289～25.511），TIGIT 陽(yáng)性患者DFS 低于TIGIT 陰性患者（χ2=18.128，P＜0.01）。

圖3 TIGIT（A）、CD155（B）表達(dá)水平與TNBC患者DFS的關(guān)系（生存曲線圖）

生存分析顯示，CD155 陰性患者平均DFS 為48.962 月（95%CI：39.215～58.708），CD155 陽(yáng)性患者的平均DFS 為27.241 月（95%CI：22.484～31.999），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.045，P＜0.01），表明CD155陽(yáng)性患者DFS低于CD155陰性患者。

2.5 影響TNBC患者DFS的單因素及多因素分析

采用Cox 回歸對(duì)TNBC 患者DFS 進(jìn)行單因素和多因素分析。單因素分析發(fā)現(xiàn)，入組患者的DFS 與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期及腫瘤TIGIT 和CD155 的表達(dá)相關(guān)（均P＜0.01，表3）。將以上5 項(xiàng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入Cox 多因素分析，結(jié)果顯示：僅腫瘤TNM 分期為TNBC 患者的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素（HR=4.751，95%CI:1.982～11.388，P＜0.01）。

表3 影響TNBC患者預(yù)后的單因素和多因素分析

3 討論

TIGIT是Ⅰ型穿膜蛋白，由一個(gè)胞外免疫球蛋白可變區(qū)、一個(gè)Ⅰ型穿膜區(qū)和一個(gè)短胞內(nèi)區(qū)組成，其中含有一個(gè)ITIM和一個(gè)ITT樣基序[12]。目前TIGIT對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)包括胞內(nèi)和胞外機(jī)制[13-14]。TIGIT對(duì)NK細(xì)胞有直接抑制作用，主要表現(xiàn)在TIGIT可以降低NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力并抑制CD226的激活和NK細(xì)胞毒性作用[12]。TIGIT與CD226競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CD155，一方面抑制CD226的激活，導(dǎo)致CD226發(fā)生去磷酸化來(lái)抑制T細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)[15]。另一方面，ITT基序被磷酸化并與生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptorbound protein 2，Grb2）結(jié)合，隨后招募含SH2結(jié)構(gòu)域的肌醇磷酸酶-1（SHIP-1）到TIGIT的細(xì)胞質(zhì)尾部，抑制PI3K、MAPK和NF-κB信號(hào)通路，繼而導(dǎo)致NK細(xì)胞毒性減弱和細(xì)胞因子分泌減少[16-17]。TIGIT對(duì)T細(xì)胞也有直接抑制作用，在效應(yīng)性T細(xì)胞中，TIGIT可直接抑制T細(xì)胞的活化和增殖，從而限制效應(yīng)性T細(xì)胞的功能，減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抑制作用。在胞外，TIGIT與DC表面的CD155相互作用會(huì)間接抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)。TIGIT與CD155結(jié)合誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受性DC，其抗原提呈功能受到抑制、共刺激分子表達(dá)減少、免疫抑制因子IL-10分泌增多、促炎細(xì)胞因子IL-12的產(chǎn)生減少，從而抑制T細(xì)胞的激活、增殖與活化[18]。TIGIT還通過(guò)增強(qiáng)和調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的抑制功能來(lái)間接抑制免疫反應(yīng)。TIGIT+Treg細(xì)胞可上調(diào)多個(gè)Treg細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá),包括FOXP3、IKZF2、CTLA-4、PD-1和LAG-3。TIGIT+Treg細(xì)胞也能抑制促炎性Th1和Th17型免疫反應(yīng)的能力，但不能抑制Th2型免疫反應(yīng)，因此TIGIT+Treg有效抑制了效應(yīng)性T細(xì)胞的激活和增殖[19-20]。

研究證實(shí)，TIGIT表達(dá)上調(diào)與多種腫瘤的不良臨床結(jié)局有關(guān)，包括肝癌[7]、黑色素瘤[21]、急性髓細(xì)胞白血病[22]、子宮內(nèi)膜癌[23]、結(jié)直腸癌[24]。王偉杰等[24]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中TIGIT的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，其表達(dá)與腫瘤分化程度、病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性；DUAN[7]等在肝細(xì)胞癌中的研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中TIGIT表達(dá)水平隨著腫瘤分化程度由高到低逐漸上調(diào)，且與AFP 水平呈現(xiàn)正相關(guān)。基于TIGIT在抗腫瘤免疫中的重要作用，已有多項(xiàng)臨床前及臨床研究證實(shí)靶向TIGIT 免疫治療的有效性[14]。Ⅱ期臨床研究CITYSCAPE 的結(jié)果[25]證實(shí)，新型抗TIGIT抗體 tiragolumab聯(lián)合PD-L1 抑制劑atezolizumab 對(duì)比安慰劑聯(lián)合atezolizumab 顯著提高PD-L1 陽(yáng)性NSCLC 患者的ORR 和PFS，而不良反應(yīng)并未加重。晚期實(shí)體腫瘤患者的Ⅰ期研究（NCT02964013）評(píng)估了劑量遞增的抗TIGIT 抗體vibostolimab 單一療法或聯(lián)合PD-1 抑制劑pembrolizumab 的安全性和有效性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接受vibostolimab 聯(lián)合pembrolizumab 治療的人群ORR 為26%、疾病控制率達(dá)到51%，顯示出良好的耐受性和抗腫瘤活性[26]。此外，多個(gè)人源性抗TIGIT單抗正在進(jìn)行單一療法或聯(lián)合抗PD-1/PD-L1/CTLA-4/LAG-3抗體免疫治療的臨床研究，涉及肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、食管癌、黑色素瘤等多個(gè)瘤種，提示抗TIGIT在抗腫瘤治療中的廣闊前景[5]。

近年來(lái)關(guān)于CD155 與腫瘤的研究越來(lái)越多。CD155 可通過(guò)ITIM 結(jié)構(gòu)域募集蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2 以啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、增殖和存活，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。CD155 也參與腫瘤免疫反應(yīng)，其在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)并與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上的CD96、CD226 和TIGIT相互作用，在腫瘤細(xì)胞免疫監(jiān)視、免疫逃逸以及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞等諸多方面中扮演著重要角色[10]。CD155 與TIGIT 的結(jié)合能力最高，與CD96 的結(jié)合能力次之，與CD226 的結(jié)合能力最低。研究[6-9]表明，CD155 在多種人類惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)并與腫瘤的侵襲和遷移能力有關(guān)。目前關(guān)于乳腺癌中CD155 表達(dá)的報(bào)道較少。既有研究[27-29]顯示，乳腺癌患者（所有亞型）的CD155 表達(dá)率從38.1%到52.3%不等，CD155 陽(yáng)性表達(dá)患者可能顯示出以下特征：Ki-67 顯著升高、TIL 豐富、腫瘤分期晚、伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及存在浸潤(rùn)性NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。CD155 表達(dá)對(duì)乳腺癌預(yù)后的影響尚未明確，研究[27,29]發(fā)現(xiàn)，CD155 過(guò)表達(dá)患者具有較差的OS，另一項(xiàng)研究[28]則認(rèn)為乳腺癌胞膜CD155 高表達(dá)和NK-TIL 預(yù)示著較好的預(yù)后。YOSHIKAWA 等[30]則認(rèn)為CD155 表達(dá)與生存預(yù)后無(wú)相關(guān)性。

腫瘤免疫治療是繼手術(shù)、放療、化療之后的重要治療方法。靶向CTLA-4、PD-1、PD-L1 的單克隆抗體在多種惡性腫瘤中顯示出良好的治療效果。盡管TNBC對(duì)免疫治療的反應(yīng)率高于其他亞型，但總體有效率仍較低，未經(jīng)選擇的TNBC患者單藥免疫治療有效率僅5%，PD-L1 陽(yáng)性患者約為23%[3]，仍有相當(dāng)多患者無(wú)法從目前免疫治療中受益，故探索新的免疫檢查點(diǎn)及潛在治療靶點(diǎn)對(duì)于臨床十分必要。本研究發(fā)現(xiàn)，新型免疫檢查點(diǎn)分子TIGIT和CD155在TNBC組織中高表達(dá)，且兩者表達(dá)均與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期顯著相關(guān)。生存分析顯示兩者表達(dá)均與較差的DFS 相關(guān)，提示TIGIT/CD155 在TNBC 微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制作用，可能成為TNBC治療的新靶點(diǎn)。TIGIT/CD155對(duì)TNBC的免疫抑制機(jī)制如何，TIGIT 表達(dá)與PD-L1 表達(dá)是否具有相關(guān)性，抗TIGIT抑制劑聯(lián)合抗PD-L1 抑制劑能否在TNBC 中發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，均需要更多研究進(jìn)一步明確。