鄧幻蘇，劉元斌（.天津醫(yī)科大學(xué)中新生態(tài)城醫(yī)院 婦產(chǎn)科，天津 3 000467；.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 檢驗科，山東濟(jì)南 500）

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率居女性腫瘤第四位[1]。據(jù)統(tǒng)計，每年約有50萬宮頸癌新發(fā)病例，主要發(fā)生在發(fā)展中國家[2]。在中國，每年新增病例數(shù)約占世界總數(shù)的三分之一[3]。雖然近年來人乳頭瘤病毒（HPV）DNA檢測的發(fā)展和放化療技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用在一定程度上降低了宮頸癌的發(fā)病率和病死率，但宮頸癌的復(fù)發(fā)率仍高達(dá)40%，病死率在發(fā)展中國家高達(dá)87%[4-5]。因此，探索宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制并尋找潛在的預(yù)后和靶向治療指標(biāo)是當(dāng)務(wù)之急。長鏈非編碼RNA（lncRNA）通常是指長度超過200個核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物，不具有蛋白質(zhì)編碼功能[6]。MIR17HG 基因是MIR17-92 簇的宿主基因，該基因簇至少包含6 種可能參與細(xì)胞存活、增殖、分化和血管生成的微小RNA（miRNA）[7-8]。MIR17HG 在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，包括結(jié)直腸癌[9]、膠質(zhì)瘤[10]、肝癌[11]和食管癌[12]，起著促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。但MIR17HG 基因在宮頸癌中的作用及分子機(jī)制尚不明確。因此，本研究主要探討MIR17HG基因在宮頸癌中的表達(dá)水平、其對宮頸癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制，分析其與臨床資料的相關(guān)性，旨在為宮頸癌的診斷和治療提供新的參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料標(biāo)本來源

選取2019 年8 月至2020 年12 月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院接受宮頸錐切術(shù)的30例宮頸癌患者的癌組織及其癌旁組織。所用樣本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。所有患者術(shù)前未接受放療、化療及生物治療。本次研究獲得患者及其家屬的知情同意，并報醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[審批號：KYLL-2022(ZM)-127]。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

人正常宮頸上皮End1/E6E7細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞HeLa、C33A、CasKi 和SiHa 均購自天津中原公司（ATCC 一級代理商），TRIM25、PTEN、p-AKT、AKT、p-S6K 和GAPDH 蛋白抗體均購自Abclonal 公司。MIR17HG 過表達(dá)質(zhì)粒和敲降質(zhì)粒shR-MIR17HG 及各自的對照質(zhì)粒均購自銳博生物科技有限公司，TRIzol 試劑購自Thermo 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR相關(guān)緩沖液及CCK-8試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)公司，PCR 引物購自金唯智公司，RPMI 1640 培養(yǎng)基購自Life公司，胎牛血清購自BI公司，Transwell小室購自密理博公司。

1.3 qPCR法檢測宮頸癌組織和細(xì)胞中MIR17HG的表達(dá)水平

采用TRIzol 法提取樣本組織及細(xì)胞中總RNA，按照說明書使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進(jìn)行qPCR 實驗，PCR 反應(yīng)條件：4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s 進(jìn)行32 次循環(huán)，72 ℃延伸5 min，最后4 ℃冷卻。所用qPCR引物序列見表1。

1.4 CCK-8法檢測MIR17HG對HeLa細(xì)胞增殖的影響

取接種有3×103個HeLa 細(xì)胞（100 μL）的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，采用脂質(zhì)體2000將過表達(dá)質(zhì)粒MIR17HG或敲降質(zhì)粒shR-MIR17HG及相應(yīng)的對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，4 h后換為正常培養(yǎng)液，培養(yǎng)48、72 h后向每孔加入10μL CCK-8溶液，37 ℃反應(yīng)1 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀讀取每孔450 nm處光密度（D）值，以D值代表細(xì)胞增殖水平并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5 克隆形成實驗檢測MIR17HG對HeLa細(xì)胞集落形成能力的影響

在接種有HeLa細(xì)胞的12孔板中，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染MIR17HG 或者shR-MIR17HG 及對照質(zhì)粒24 h后，用0.05%胰酶消化細(xì)胞，用移液器將細(xì)胞吹打成單個細(xì)胞懸液并計數(shù)，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿中，每孔300個細(xì)胞，使細(xì)胞均勻分布于板底，放入培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)，每3 d 更換1 次培養(yǎng)液。待兩周左右至出現(xiàn)肉眼可見集落時，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗滌1次后加10%甲醛固定30 min，用PBS洗3次后，用結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗凈后晾干、拍照并計數(shù)集落。

1.6 Transwell實驗檢測MIR17HG對HeLa細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

將MIR17HG 過表達(dá)或敲降質(zhì)粒及對照載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞24 h后，用0.05%的胰酶消化細(xì)胞，于無血清培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞后計數(shù)板計數(shù)，將含4×105/mL HeLa 細(xì)胞的180 μL 細(xì)胞懸液加入鋪有人工基膜（metrigel）（遷移實驗不加人工基膜）的上室中，下室中加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。取出Transwell 小室，用棉簽擦掉人工基膜及上室未穿膜的HeLa細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，用0.1%結(jié)晶紫染色10 min。用顯微鏡隨機(jī)選取5 個視野計數(shù)穿膜細(xì)胞，計算細(xì)胞遷移率、侵襲率。

1.7 WB 法檢測MIR17HG 對HeLa 細(xì)胞中TRIM25及信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

將轉(zhuǎn)染了MIR17HG 過表達(dá)質(zhì)粒及對照Control質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞正常培養(yǎng)48 h，用1 ml PBS清洗后，用RIPA（購自碧云天公司）裂解液裂解細(xì)胞。裂解后的細(xì)胞加入上樣緩沖液煮沸，行WB 實驗檢測TRIM25、PTEN、p-AKT、AKT、p-S6K、GAPDH 蛋白表達(dá)水平。蛋白轉(zhuǎn)膜、顯影后進(jìn)行拍照，GraphPad作圖并分析蛋白的相對表達(dá)量數(shù)據(jù)。

1.8 生物信息學(xué)分析

宮頸癌組織和癌旁組織中MIR17HG及TRIM25的表達(dá)水平及其在臨床資料中的相關(guān)關(guān)系采用UALCAN 在線工具（http://ualcan.path.uab.edu/）進(jìn)行分析；MIR17HG 及TRIM25 的相關(guān)關(guān)系采用ENCORI 工具（http://starbase.sysu.edu.cn/）進(jìn)行分析；患者的預(yù)后分析采用Kaplan-Meier Plotter 工具（http://kmplot.com/analysis/）進(jìn)行分析。

1.9 EGFP報告載體構(gòu)建

退火：兩條寡核苷酸片段在退火緩沖液中95 ℃變性5 min，每min 下降1 ℃直到溫度達(dá)到25 ℃，作為與pMIR-REPORT熒光素酶載體連接的插入片段。退火體系：互補寡核苷酸片段各0.5μL,11.5μL退火B(yǎng)uffer，寡核苷酸終濃度2 ng/μL。目的基因片段保存于4 ℃?zhèn)溆?。pMIR-REPORT 螢光素酶連接載體制備：采用E.coliDH5a 擴(kuò)增EGFP 質(zhì)粒，抽提質(zhì)粒后行限制性內(nèi)切酶HindⅢ和SpeⅠ雙酶切。雙酶切體系：質(zhì)粒30 μL、DDW 4 μL、HindⅢ酶1 μL、SpeⅠ酶1 μL，10×緩沖液4 μL，置于低溫連接儀37 ℃金屬浴中反應(yīng)24 h；靶基因的連接體系：目的基因4μL，連接載體0.2μL，2×連接緩沖液5μL，雙蒸水0.8μL，16 ℃金屬浴中反應(yīng)16 h。

1.10 構(gòu)建HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤

6-8 周齡的BALB/c Nude 鼠（以下簡稱裸鼠），雌性，體質(zhì)量8～12 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)在無特異性病原菌（specific pathogen free，SPF）、恒溫（20～26 ℃）、恒濕（45%～50%）的潔凈環(huán)境中。將裸鼠按照過表達(dá)MIR17HG 和對照組Control 2 個組。常規(guī)培養(yǎng)、傳代的MIR17HG 過表達(dá)組和對照組（Control 組）HeLa 細(xì)胞懸液裸鼠腋窩皮下接種，每只注射1×107/ml細(xì)胞0.1 ml。腫瘤體積，腫瘤生長期內(nèi)每3天測量體積1次，瘤體積近似計算方法：短徑2×長徑/2。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TCGA分析MIR17HG的表達(dá)水平及其臨床意義

TCGA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果（圖1A）發(fā)現(xiàn)，MIR17HG在宮頸癌組織中呈高表達(dá)（P＜0.05）。TCGA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果（圖1B）發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中MIR17HG的表達(dá)水平隨著分期的惡性程度增高而增高（P＜0.05）。TCGA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIR17HG 的表達(dá)水平與患者所在地域（圖1C）、體重（圖1D）、年齡（圖1E）和臨床分型（圖1F）不存在相關(guān)關(guān)系。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析MIR17HG在宮頸癌組織中的表達(dá)水平及其與臨床特征之間的相關(guān)性

2.2 MIR17HG在宮頸癌組織及細(xì)胞中呈高表達(dá)

qPCR 檢測結(jié)果（圖2A）顯示，宮頸癌癌組織中MIR17HG 的表達(dá)水平明顯高于其配對的癌旁組織（P＜0.05）。qPCR 檢測結(jié)果（圖2B）顯示，與End1/E6E7細(xì)胞相比，MIR17HG在宮頸癌細(xì)胞系（CasKi、C33A、SiHa、HeLa）中呈高表達(dá)（P＜0.01 或P＜0.001），且在HeLa 細(xì)胞中具有最高的表達(dá)豐度。因此選取HeLa細(xì)胞作為后續(xù)實驗的工具細(xì)胞。

圖2 MIR17HG在宮頸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.3 過表達(dá)MIR17HG促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖和遷移侵襲能力

CCK-8 實驗和克隆形成實驗結(jié)果（圖3A、B）顯示，MIR17HG過表達(dá)組HeLa的細(xì)胞活性及克隆形成能力均顯著高于對照組，而MIR17HG 敲降組細(xì)胞活性及克隆形成能力均顯著低于對照組（P＜0.05或P＜0.01）。Transwell 遷移和侵襲實驗結(jié)果（圖3C、D）顯示，與相應(yīng)的對照組相比，MIR17HG 過表達(dá)組HeLa 細(xì)胞遷移和侵襲能力均顯著升高，而MIR17HG敲降組細(xì)胞的遷移和侵襲能力則顯著降低（P＜0.05或P＜0.001）。

圖3 MIR17HG促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

2.4 MIR17HG 通 過miR-377 調(diào) 控HeLa 細(xì)胞中TRIM25的表達(dá)

ENCORI 生物信息學(xué)預(yù)測軟件預(yù)測結(jié)果顯示，MIR17HG 與很多個基因存在潛在的相互作用（圖4A），且MIR17HG 的表達(dá)與TRIM25 的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（圖4B）。qPCR 檢測結(jié)果（圖4C）顯示，MIR17HG 過表達(dá)組HeLa 細(xì)胞中TRIM25 mRNA 水平較對照組明顯上調(diào)（P＜0.01），而MIR17HG 敲降組細(xì)胞TRIM25 mRNA 水平較對照組明顯下調(diào)（P＜0.001）。WB 法檢測結(jié)果（圖4D）顯示，過表達(dá)MIR17HG 后TRIM25 蛋白水平上調(diào)，而敲降MIR17HG 后TRIM25 蛋白水平下調(diào)。已有文獻(xiàn)[10]報道MIR17HG能夠在膠質(zhì)瘤中結(jié)合并下調(diào)miR-377的表達(dá)，本課題組采用Targetscan 預(yù)測miR-377 的潛在靶基因是TRIM25（圖4E）。EGFP 報告載體實驗結(jié)果表明miR-377 能夠顯著下調(diào)EGFP 的熒光活性（圖4F）。過表達(dá)MIR17HG 上調(diào)TRIM25 mRNA 水平，而共表達(dá)MIR17HG 和miR-377 可以挽救MIR17HG介導(dǎo)的TRIM25 mRNA水平的上調(diào)（圖4G）。

圖4 MIR17HG通過miR-377上調(diào)TRIM25

2.5 TRIM25在宮頸癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者分期呈正相關(guān)

TCGA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，TRIM25 在宮頸癌組織中呈高表達(dá)（P＜0.05，圖5A），其表達(dá)水平在宮頸癌組織中有隨著分期的惡性程度增高而增高的趨勢（圖5B），TRIM25的表達(dá)水平與患者的地域（圖5C）、體重（圖5D）、年齡（圖5E）和臨床分級（圖5F）不存在相關(guān)關(guān)系。

圖5 TCGA數(shù)據(jù)庫分析TRIM25的宮頸癌患者中的表達(dá)水平

2.6 高表達(dá)MIR17HG 及TRIM25 的宮頸癌患者預(yù)后不良

Kaplan-Meier Plotter 分析發(fā)現(xiàn)，MIR17HG 高表達(dá)組的宮頸癌患者的生存期明顯低于MIR17HG 低表達(dá)組腫瘤患者（P＜0.05，圖6A），TRIM25 高表達(dá)組的宮頸癌患者的生存期明顯低于TRIM25 低表達(dá)組腫瘤患者（P＜0.05，圖6B）。

圖6 Kaplan-Meier Plotter分析MIR17HG和TRIM25表達(dá)水平與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.7 MIR17HG 調(diào)控PTEN-AKT 信號通路及裸鼠移植瘤生長

WB檢測結(jié)果（圖7A）顯示，過表達(dá)MIR17HG組HeLa 細(xì)胞中PTEN 蛋白表達(dá)水平較對照組有所降低，而AKT和S6K蛋白的磷酸化水平有所上調(diào)；敲降MIR17HG 組PTEN 蛋白表達(dá)水平則高于對照組，而AKT和S6K蛋白的磷酸化水平下調(diào)。移植瘤實驗結(jié)果顯示，MIR17HG過表達(dá)組裸鼠移植瘤的大小（7B）和生長能力（7C）均高于對照組（P＜0.05）。

圖7 MIR17HG可能通過調(diào)控PTEN-AKT信號通路促進(jìn)HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長

3 討論

目前，很多研究[13-15]報道，lncRNA參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。MIR17HG的表達(dá)水平在肝轉(zhuǎn)移患者中顯著升高，高M(jìn)IR17HG 表達(dá)預(yù)示著生存率低[9]。MIR17HG 作為ceRNA 通過miR-138-5p 調(diào)節(jié)HK1 表達(dá)，導(dǎo)致CRC 細(xì)胞中的糖酵解并促進(jìn)其侵襲和肝轉(zhuǎn)移。有趣的是，通過糖酵解積累的乳酸激活了p38/Elk-1 信號通路，促進(jìn)了CRC 細(xì)胞中MIR17HG 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，形成了一個正反饋回路，最終導(dǎo)致了持續(xù)的糖酵解和CRC 細(xì)胞的侵襲和肝轉(zhuǎn)移[9]。另外，MIR17HG在膠質(zhì)瘤中上調(diào)，參與促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲。MIR17HG 分別與miR-153 和miR-377結(jié)合，并負(fù)調(diào)控它們介導(dǎo)FOXR2 表達(dá)的能力[10]。MENG等[16]報道稱MIR17HG在體外促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和順鉑耐藥性，而MIR17HG 敲低抑制了體內(nèi)骨肉瘤移植的生長。MIR17HG 通過SP1/MIR17HG/miR-130a-3p/SP1 反饋回路在骨肉瘤進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)作用。

但是，MIR17HG 的異常表達(dá)是否與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)還未可知。本研究發(fā)現(xiàn)，MIR17HG 的表達(dá)水平在宮頸癌組織和細(xì)胞中都是上調(diào)的，其表達(dá)水平與宮頸癌的惡性程度呈正相關(guān)；并且TCGA數(shù)據(jù)庫分析MIR17HG的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，其在宮頸癌中的表達(dá)水平也是上調(diào)的，這與本研究的檢測結(jié)果相一致。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MIR17HG 能夠促進(jìn)HeLa 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。根據(jù)上述已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)內(nèi)容并結(jié)合本實驗結(jié)果，推測HOPX基因能夠作為促癌因子在很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用。

TRIM25 是TRIM 家族的成員之一，是由一個N末端三方基序（或基序RBCC）和C端SPRY結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，在多個依賴于RNA 的通路中起到非常重要的作用[17]。TRIM25在包含結(jié)直腸癌[18]，肺癌[19]和乳腺癌[20]等在內(nèi)的多種癌癥中是高表達(dá)的。本研究發(fā)現(xiàn)，TRIM25在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者腫瘤分期呈正相關(guān)。MIR17HG 能夠上調(diào)TRIM25表達(dá)，高表達(dá)MIR17HG及TRIM25的宮頸癌患者預(yù)后不良。HE等[21]報道，TRIM25通過K63連接的多泛素化抑制非小細(xì)胞肺癌中的PTEN 來激活A(yù)KT/mTOR信號通路。因此，推測MIR17HG可能會調(diào)控AKT信號通路。實驗結(jié)果顯示，MIR17HG能夠顯著抑制PTEN 蛋白表達(dá)水平，并顯著上調(diào)AKT 和S6K蛋白的磷酸化水平。

總之，MIR17HG通過miR-377調(diào)控TRIM25表達(dá)發(fā)揮促癌基因的作用。MIR17HG通過調(diào)控PTEN-AKT信號通路在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。