黃恩厚，李莫寒，李培培，夏琳，馬瑜婷（1.南京醫(yī)科大學(xué) 腫瘤個體化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 211166；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100005；3.蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 蘇州 215123）

乳腺癌、胰腺癌、肺癌、皮膚癌、前列腺癌等多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中均可觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress，ERS）[1]，在晚期或化療抵抗的腫瘤中尤為明顯[2]。未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）是高度保守的ERS 響應(yīng)機(jī)制。在UPR 的3 條分支通路中，活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）的研究進(jìn)展相對緩慢。正常狀態(tài)下，ATF6 與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）結(jié)合。當(dāng)發(fā)生ERS 時，大量錯誤折疊的蛋白可擠占結(jié)合GRP78，釋放出游離的ATF6[3]。ATF6 從ER轉(zhuǎn)移到高爾基體后，可被蛋白酶切割，產(chǎn)生含有堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）的轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)分子伴侶蛋白、折疊酶及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)降解效應(yīng)分子的表達(dá)[4-5]，有利于維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞存活。

ATF6 通路的持續(xù)活化可幫助癌細(xì)胞抵抗ERS 引發(fā)的細(xì)胞死亡[6-8]、支持休眠癌細(xì)胞存活[9]、促進(jìn)化療抵抗[10]、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)化[11]，以及增強(qiáng)血管新生[12]。也有報道[13]顯示，ATF6 是決定C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）表達(dá)的早期轉(zhuǎn)錄因子，因此也具有促凋亡活性。浸潤腫瘤的髓系細(xì)胞也會發(fā)生ERS 和UPR，可造成免疫抑制和免疫耐受，促進(jìn)炎癥，阻礙抗腫瘤免疫應(yīng)答[14-15]。條件性敲除髓系細(xì)胞的Atf6后，腫瘤內(nèi)多核型髓源抑制性細(xì)胞的免疫抑制功能顯著下降，腫瘤進(jìn)展明顯延緩[16]。目前，ATF6 通路對癌細(xì)胞免疫原性（即腫瘤細(xì)胞被免疫系統(tǒng)識別和清除的能力）的影響尚屬未知[17]。本研究擬借助免疫健全和免疫缺陷小鼠模型，探索野生型（WT）和Atf6-/-癌細(xì)胞的免疫原性和體內(nèi)成瘤能力的差異，并初步挖掘相關(guān)調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

C57BL/6N 和nu/nu小鼠（購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：20220107Abzz0619000267、20220107Abzz061900076 5、20201209 Abzz0619000481）與 B6.129S2-Ifnar1tm1Agt/Mmjax 小鼠（Ifnar-/-，Jackson 實(shí)驗(yàn)室）的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院/蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所的SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心完成，實(shí)驗(yàn)方案已獲得蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：ISM-IACUC-0072-R）。小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組，每組小鼠至少5 只，年齡和性別匹配，均為雌性，6～7 周齡，體質(zhì)量為18～20 g。骨肉瘤細(xì)胞MCA205由法國國家健康與醫(yī)學(xué)研究院Guido Kroemer實(shí)驗(yàn)室饋贈。表達(dá)ISRE-熒光素酶的成纖維細(xì)胞L929-ISRE 由北京大學(xué)蔣爭凡實(shí)驗(yàn)室饋贈。293FT 細(xì)胞購自Thermo Fisher 公司。所有細(xì)胞均培養(yǎng)于含有L-谷氨酰胺和HEPES的高糖DMEM 培養(yǎng)基[BL304A 購自Biosharp 公司，額外添加含10% 胎牛血清（FBS-12A，購自Capricorn Scientific 公司）和100 U/mL 的青霉素和鏈霉素雙抗溶液（BL505A，購自Biosharp 公司]。LentiCRISPRv2（52961）、psPAX2（12260）和pMD2.G（12259）質(zhì)粒均購自Addgene公司。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用的FuGENE?HD Transfection Reagent（E2311）購自Promega 公司，聚凝胺（polybrene，107689）購自MERCK 公司，嘌呤霉素（ant-pr）購自InvivoGen 公司，細(xì)胞活力檢測試劑盒CKK-8（BS350A）購自Biosharp 公司，能量代謝檢測試劑盒Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit（103020-100）和Cell Mito Stress Test Kit（103015-100）均購自Agilent Technologies公司，細(xì)胞死亡檢測使用的PE Annexin V（640947）和DAPI（564907）分別購自BioLegend 公司、BD BioScience 公司，衣霉素（tunicamycin，Tm；654380）購自Sigma-Aldrich 公司。離子霉素（ionomycin；ab120116）和Rhod-4 染料（ab112157）均購自Abcam公司，組織消化酶Liberase?TL（05401020001）購自Roche 公司，DNase Ⅰ（260913）購自Millipore 公 司，IFN-γ 的ELISPOT 試劑盒（551083）和ELISA 試劑盒（430801）分別購自 BD Bioscience 和 BioLegend 公司，Dual-Luciferase?Reporter 試劑盒（E1960）、胞內(nèi)ATP 檢測試劑盒（G7571）均購自Promega 公司，胞外ATP 檢測試劑盒（FLAA）購自Sigma-Aldrich公司，組織和細(xì)胞總RNA提取試劑盒（DP419）購自TIANGEN公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）和基于SYBR Green 的qPCR試劑盒（RR820A）均購自TaKaRa 公司，CD90.2 抗體（105310）購自BioLegend 公司，Low-Tox?-M 兔補(bǔ)體（Cl3051）購自Cedarlane公司，IL-2（5 000 U/mL）購自江蘇四環(huán)生物制藥公司，熒光染料eFlour670（65-0840-85）購自eBioscience公司。

1.2 CRISPR-Cas9敲除MCA205細(xì)胞的Atf6基因

靶向Atf6基因的gRNA 序列為5'-TCG ACGTTGTTTGCTGAACT-3'，合成正義和反義寡核苷酸，退火形成雙鏈DNA 片段，連接至線性化的LentiCRISPRv2 載體。上述gRNA 載體質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G按照21∶15∶6的比例共同轉(zhuǎn)染293FT 細(xì)胞。48 h后，收集病毒上清液并添加4 μg/mL聚凝胺后感染MCA205細(xì)胞。感染后48 h，用4 μg/mL嘌呤霉素篩選5 d。從存活的細(xì)胞中分選單克隆并逐一測序鑒定。

1.3 CCK-8法檢測Atf6缺失對MCA205細(xì)胞活力的影響

將WT 或Atf6-/-MCA205 細(xì)胞接種在96 孔板中（每孔2×103個細(xì)胞、100 μL 培養(yǎng)基），用PBS 或12 μmol/L 的Tm 處理細(xì)胞，在指定時間點(diǎn)向培養(yǎng)基中加入CCK-8 試劑（10 μL），借助SpectraMax?i3x 多功能微孔讀板儀檢測450 nm 和600 nm 處的光密度（D）值，繪制細(xì)胞增殖或死亡曲線。

1.4 細(xì)胞能量代謝儀檢測Atf6缺失對MCA205細(xì)胞OCR和ECAR的影響

在XF-24 板中接種細(xì)胞（5×104個/孔）并培養(yǎng)過夜，用12 μmol/L 的Tm 預(yù)處理細(xì)胞8 h，檢測前將培養(yǎng)基更換為Seahorse XF 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1 h。借助Seahorse XFe24 分析儀，按照試劑盒說明，依次注射10 mmol/L 葡萄糖（GLU）、1 μmol/L 寡霉素（Oligo）和100 mmol/L 的2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）后檢測細(xì)胞ECAR。依次注射1.5 μmol/L 寡霉素，1 μmol/L 線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián) 劑（carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenyl hydrazine，F(xiàn)CCP）和0.5 μmol/L 魚藤酮/抗霉素（Rot/AA）后檢測細(xì)胞OCR。檢測完成后立即消化獲取每孔細(xì)胞，嚴(yán)格計數(shù)后用于數(shù)據(jù)的歸一化處理。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測Atf6缺失對MCA205細(xì)胞死亡的影響

在24 孔板中接種WT 或Atf6-/-MCA205 細(xì) 胞（1×105個/孔）。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時，用PBS 或12 μmol/L 的Tm 處理細(xì)胞16 h，Annexin V 和DAPI 染色后用流式細(xì)胞儀（BD LSRFortessa?）分析ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

NK細(xì)胞體外培養(yǎng)與殺傷檢測：收集新鮮骨髓細(xì)胞，借助紅細(xì)胞裂解液、CD90.2 抗體和Low-Tox?-M兔補(bǔ)體去除紅細(xì)胞和T 細(xì)胞。余下的細(xì)胞在含有5 000 U/mL IL-2 和10% FBSR 的PMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，每天半量更換培養(yǎng)基。如此獲得的NK 細(xì)胞分別與eFlour670預(yù)染的WT或Atf6-/-MCA205細(xì)胞按照不同的效靶比混合，共培養(yǎng)4 h 后借助Annexin V和DAPI染色檢測腫瘤細(xì)胞死亡。流式檢測結(jié)果用FlowJo軟件分析。

1.6 構(gòu)建MCA205細(xì)胞小鼠移植瘤模型

在C57BL/6N、nu/nu或Ifnar-/-小鼠背部兩側(cè)皮下標(biāo)注部位同時分別注射1×106個WT或Atf6-/-MCA205細(xì)胞，每隔2～3 d測量并記錄腫瘤的最大直徑及其垂直方向的腫瘤直徑，用兩者的乘積代表腫瘤大小，繪制生長曲線。

1.7 移植瘤組織及腫瘤細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄水平分析

植瘤后7 d 剝離和收集腫瘤組織，獲取PBS或Tm（12 μmol/L）處理16 h的腫瘤細(xì)胞，分別提取樣本總RNA，NanoDrop?2000 分光光度計確定其濃度和純度。腫瘤轉(zhuǎn)錄組測序委托蘇州金唯智生物科技公司，由Illumina HiSeq X Ten 平臺完成。借助R 語言程序包（DESeq2、FactoMineR、ComplexHeatmap 和EnhancedVolcano）分析基因表達(dá)，繪制主成分分析、熱圖和火山圖。Atf6-/-較WT 腫瘤組織中顯著上調(diào)基因的GO富集分析由Metascape在線工具完成。腫瘤細(xì)胞mRNA 被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，可借助如下引物（表1）對特定基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行PCR檢測。

表1 qPCR所用引物序列

1.8 ELISPOT 及ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測Atf6 缺失對效應(yīng)T細(xì)胞活化的影響

小鼠皮下接種癌細(xì)胞7 d后，收集腫瘤組織并剪碎，用Liberase TL（0.4 Wünsch units/mL）和DNaseⅠ（200 U/mL）消化30 min，70 μm濾器濾過后制備單細(xì)胞懸液。在預(yù)先包被了IFN-γ 捕獲抗體的多孔濾膜板中分配細(xì)胞懸液（1×106個/孔），培養(yǎng)16 h，反復(fù)清洗后，借助IFN-γ 檢測抗體、辣根過氧化物酶（HRP）和顯色底物，依托CTL-Immunospot S6酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析儀對腫瘤內(nèi)分泌IFN-γ 的細(xì)胞進(jìn)行定量分析。將Tm 預(yù)處理的WT 或Atf6-/-MCA205 細(xì)胞注射到小鼠后足掌皮下，7 d 后收集腘窩（引流）淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸液，上述細(xì)胞（1×106個）與Tm預(yù)處理的WT型MCA205 細(xì)胞（2×104個）共培養(yǎng)72 h，收集上清液并用ELISA試劑盒檢測IFN-γ豐度。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測Atf6缺失對胞內(nèi)鈣離子動員的影響

將WT和Atf6-/-MCA205細(xì)胞接種于黑色光學(xué)底透微孔板（2×104個/孔），PBS或Tm（12 μmol/L）處理16 h后，用不含Ca2+的HBSS緩沖液制備Rhod-4染料溶液并與待測細(xì)胞混合，室溫下放置1 h。借助SpectraMax?i3x（激發(fā)波長540 nm，發(fā)射波長590 nm），先記錄本底信號30 s，加入離子霉素（10 μmol/L）刺激后每5 s收集一次信號，繪制鈣離子動員曲線。

1.10 化學(xué)發(fā)光法檢測Atf6 缺失對胞內(nèi)外ATP 濃度的影響

Tm 處理WT 或Atf6-/-MCA205 細(xì)胞16 h，收集細(xì)胞上清液，梯度稀釋ATP 標(biāo)準(zhǔn)品，將50 μL 細(xì)胞上清液、標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移到全白96孔板，與等體積的檢測工作液混合后立即用SpectraMax?L定量檢測化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，計算胞外ATP濃度。為檢測胞內(nèi)ATP濃度，保留板孔底部細(xì)胞及100 μL 細(xì)胞上清液，加入等體積檢測工作液，室溫振蕩10 min，吸取100 μL混合液轉(zhuǎn)移至全白96孔板，用SpectraMax?L完成定量分析。

1.11 ISRE-熒光素酶報告細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測Atf6缺失對IFNα/β分泌的影響

將L929-ISRE 細(xì)胞接種于96 孔板中（5×104個/孔）過夜，加入Tm 預(yù)處理的WT 或Atf6-/-MCA205 細(xì)胞（1×105個/孔），共培養(yǎng)4 h 后棄上清液，加入80 μL裂解液充分震蕩30 min，取其中50 μL，采用Dual-Luciferase?Reporter 試劑盒（Promega，E1960）由SpectraMax?L測定IFNα/β分泌水平。

1.12 WB檢測Atf6缺失對腫瘤內(nèi)死亡相關(guān)通路活化的影響

用含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（A32959,購自Thermo Fisher Scientific 公司）的裂解液（P0013,購自Beyotime 公司）提取WT 和Atf6-/-MCA205 腫瘤組織的總蛋白，與上樣緩沖液混合后煮沸變性。用12.5%SDS-PAGE分離蛋白樣本，將蛋白印記電泳條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，與如下抗體（1∶1 000稀釋）4 ℃反應(yīng)過夜：GSDMD（ab209845）和GSDME（ab21519，購于Abcam 公司）、Caspase3（14220）和cleaved caspase3 抗 體（9661，購 自Cell Signaling Technology 公 司）。β-actin（HRP-60008，購 自Proteintech公司）用作內(nèi)參對照。之后，NC膜與HRP標(biāo)記的二抗室溫反應(yīng)2 h，反復(fù)洗滌后用Amersham?ECL?Prime 試劑（RPN2232，GE 公司）在ChemiDoc?成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）中進(jìn)行半定量分析。

1.13 ATF6基因表達(dá)與腫瘤臨床預(yù)后的相關(guān)性分析

借助TCGA 數(shù)據(jù)庫，分析ATF6表達(dá)水平與多種癌癥患者總體生存率的關(guān)聯(lián)，繪制Kaplan-Meier生存曲線，計算風(fēng)險比（HR）、95%置信區(qū)間（CI）和Logrank檢驗(yàn)P值。

1.14 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖和統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)至少有3個平行重復(fù)，所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)2 次，計量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）來表示。對于體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，首先計算每只小鼠腫瘤生長曲線下面積（AUC），之后分析不同組別小鼠AUC間的差異。采用Log-rank檢驗(yàn)分析不同組患者Kaplan-Meier 生存曲線的差異。其他數(shù)據(jù)均采用雙尾非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05則表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Atf6缺失對MCA205細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

借助CRISPR-Cas9 技術(shù)對MCA205 骨肉瘤細(xì)胞的Atf6進(jìn)行基因編輯，通過多輪DNA 測序篩選出基因序列的缺失的細(xì)胞單克?。▓D1A）。CCK-8法檢測結(jié)果（圖1B）顯示，WT 和Atf6-/-細(xì)胞在體外的活力和增殖速度相當(dāng)；Tm預(yù)處理16 h，兩種細(xì)胞的活力均受到明顯抑制，且撤藥后兩者的活力均無法恢復(fù)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果（圖1C）顯示，Tm 處理后，Atf6-/-細(xì)胞死亡比例低于WT 細(xì)胞（P＜0.01）。細(xì)胞能量代謝分析結(jié)果（圖1D、E）顯示，Tm 預(yù)處理后，WT 和Atf6-/-細(xì)胞的糖酵解（用ECAR 表征）和氧化磷酸化（用OCR表征）水平?jīng)]有明顯差異。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+動員是高度靈敏的ERS 標(biāo)志物，且與細(xì)胞死亡密切相關(guān)[18-19]，可借助Rhod-4 對其進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測。本研究發(fā)現(xiàn)，對經(jīng)PBS及Tm預(yù)處理的腫瘤細(xì)胞，離子霉素可快速誘導(dǎo)其胞內(nèi)Ca2+動員，之后逐步恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，而上述過程不受Atf6缺失的影響（圖1F）。上述結(jié)果提示，Atf6缺失不影響PBS和Tm處理后腫瘤細(xì)胞的活力和增殖、能量代謝、以及離子霉素引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+動員，但可降低Tm誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

圖1 Atf6對腫瘤細(xì)胞活力、增殖、死亡、能量代謝和鈣動員的影響

2.2 Atf6缺失可增強(qiáng)MCA205骨肉瘤的免疫原性

在免疫健全的C57BL/6N 小鼠皮下接種WT 或Atf6-/-骨肉瘤細(xì)胞，可觀察到WT 腫瘤迅速生長，而Atf6-/-腫瘤的生長則明顯滯后（圖2A）。出乎意料的是，在免疫缺陷的nu/nu小鼠（T 細(xì)胞發(fā)育受阻）背部兩側(cè)皮下同時接種這兩種癌細(xì)胞時，雖然Atf6-/-腫瘤的生長仍略慢于WT 腫瘤，但是兩者均可快速生長（圖2B）。上述現(xiàn)象提示，免疫健全小鼠體內(nèi)Atf6-/-腫瘤的滯長與T細(xì)胞激活密切相關(guān)。C57BL/6N小鼠接種癌細(xì)胞后第7天，WT與Atf6-/-腫瘤大小剛剛顯示出差異，收集此時的腫瘤組織并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，隨后進(jìn)行主成分分析并繪制差異基因熱圖和火山圖，結(jié)果都顯示，兩者的基因轉(zhuǎn)錄譜圖存在明顯差異（圖2C、E）。GO 富集分析結(jié)果（圖2F）提示，與WT 腫瘤相比，Atf6-/-腫瘤微環(huán)境中免疫防御應(yīng)答、細(xì)胞因子分泌、炎癥反應(yīng)、免疫細(xì)胞活化和遷移、Ⅰ型和Ⅱ型IFN應(yīng)答、細(xì)胞殺傷相關(guān)的基因表達(dá)均顯著增強(qiáng)。ELISPOT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2G）顯示，與WT 腫瘤相比，Atf6-/-腫瘤內(nèi)分泌IFN-γ 的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞顯著增多（P＜0.01）。將經(jīng)Tm 預(yù)處理的WT 與Atf6-/-癌細(xì)胞注射到C57BL/6N小鼠后足掌皮下，可刺激腫瘤抗原特異性T 細(xì)胞，使其在引流淋巴結(jié)（draining lymph node，DLN）中初次活化（prime）。收集上述DLN 并制備混合細(xì)胞懸液，用Tm 預(yù)處理的WT 癌細(xì)胞在體外再次刺激（boost），可誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性T 細(xì)胞的再次活化并分泌IFN-γ。檢測結(jié)果（圖2H）顯示，與對照組相比，被Tm預(yù)處理的Atf6-/-癌細(xì)胞初次活化過的小鼠，其DLN 內(nèi)T 細(xì)胞經(jīng)體外再次刺激后，IFN-γ分泌水平顯著升高（P＜0.001）。在體外按照1∶1 和5∶1 的效靶比將NK 細(xì)胞分別與WT 與Atf6-/-癌細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果（圖2I）顯示，Atf6-/-癌細(xì)胞比WT 癌細(xì)胞更易被NK 細(xì)胞殺傷（均P＜0.05）。上述結(jié)果提示，Atf6缺失可增強(qiáng)腫瘤的免疫原性，促進(jìn)效應(yīng)T 細(xì)胞和NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能，塑造出抗腫瘤的免疫微環(huán)境。

圖2 Atf6缺失可增強(qiáng)MCA205細(xì)胞移植瘤的免疫原性

2.3 影響Atf6-/-MCA205細(xì)胞免疫原性的可能因素

細(xì)胞應(yīng)激后釋放的“危險信號分子”ATP 和IFNα/β 是決定腫瘤免疫原性的重要因素[20-21]。Tm 刺激16 h 可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生ERS。本研究分別檢測了WT與Atf6-/-MCA205 細(xì)胞的胞內(nèi)ATP、釋放至胞外的ATP及IFN-α/β 的分泌水平，均未發(fā)現(xiàn)明顯差異（圖3A～C）。因此，Atf6缺陷并不影響MCA205 細(xì)胞在ERS 狀態(tài)下釋放ATP 和IFN-α/β?；虮磉_(dá)分析結(jié)果（圖3D）顯示，Tm 刺激下Irf7和Irf3轉(zhuǎn)錄本的豐度在Atf6-/-細(xì)胞內(nèi)顯著增加（均P＜0.001）。Irf7和Irf3是決定IFN-α/β 及諸多ISG 表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因。Irf3在IFN-α/β 轉(zhuǎn)錄的啟動階段發(fā)揮了核心作用，但其蛋白可被快速降解。IFN-α/β 與其受體IFNAR 結(jié)合后，可促進(jìn)Irf7的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步增強(qiáng)IFN-α/β 的表達(dá)。因此，Irf7密切參與了IFN-α/β的正反饋調(diào)控[22]。本研究提示，ATF6 可抑制ERS 觸發(fā)的Irf7和Irf3表達(dá)。Tm 刺激后，雖然兩種細(xì)胞內(nèi)Ifnb和Cxcl10轉(zhuǎn)錄本的豐度相當(dāng)（圖3D），但是Irf7和Irf3在Atf6-/-癌細(xì)胞內(nèi)的上調(diào)仍然可能促進(jìn)IFN-α和多種ISG的表達(dá)，而這可能會增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性。此外，本研究還探索了宿主因素對Atf6-/-腫瘤免疫原性的影響，重點(diǎn)關(guān)注抗腫瘤的效應(yīng)T 細(xì)胞和IFNAR 信號通路[23-25]。雖然ATF6 缺陷型腫瘤在免疫健全小鼠體內(nèi)會出現(xiàn)滯長，甚至自發(fā)消退，但其在缺乏T細(xì)胞的nu/nu小鼠體內(nèi)可快速生長。接種于Ifnar-/-小鼠皮下的Atf6-/-腫瘤仍然會出現(xiàn)滯長和自發(fā)消退，但與接種在WT小鼠皮下的Atf6-/-腫瘤相比，其開始消退的“拐點(diǎn)”時間會明顯推遲，腫瘤生長的峰值也會更大（圖3E）。上述結(jié)果提示：機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視和清除Atf6-/-腫瘤的過程中，T 細(xì)胞是關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞，而宿主的IFNAR信號通路也發(fā)揮了一定作用。本研究還借助WB法，比較了WT和Atf6-/-腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞死亡相關(guān)分子的表達(dá)水平和活化程度。Atf6-/-腫瘤組織中的caspase3 總量、切割后活化的caspase3 的豐度都明顯低于WT 腫瘤。作為介導(dǎo)焦亡的關(guān)鍵分子，焦孔素GSDME 和GSDMD 在WT 和Atf6-/-腫瘤組織中的表達(dá)水平相當(dāng)，且兩者N 端片段的切割均未能檢測到（圖3F）。上述結(jié)果提示，Atf6缺失腫瘤的滯長和消退并非由于凋亡或焦亡通路的增強(qiáng)，更可能是因?yàn)榭鼓[瘤免疫應(yīng)答的激活。

圖3 Atf6-/-MCA205細(xì)胞免疫原性的可能影響因素

2.4 ATF6低表達(dá)的腫瘤患者預(yù)后更好

為了驗(yàn)證小鼠腫瘤模型中上述發(fā)現(xiàn)是否具有臨床相關(guān)性，本研究對腫瘤公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了挖掘。在肺鱗癌（495例患者）、頭頸鱗癌（363例患者）、宮頸鱗癌（304例患者）、膀胱癌（404例患者）隊(duì)列中，均發(fā)現(xiàn)ATF6表達(dá)低患者的總體生存期更長（圖4）。

圖4 腫瘤ATF6表達(dá)水平的臨床預(yù)后價值分析

3 討論

腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療過程中，多種不利的微環(huán)境因素可造成癌細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)失衡、激活自噬、UPR、氧化應(yīng)激等高度保守的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，通過降解自身組分產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)、減緩轉(zhuǎn)錄翻譯、降解錯誤折疊蛋白和抑制脂質(zhì)過氧化物生成等，緩解癌細(xì)胞的生存壓力，幫助其存活、擴(kuò)增及產(chǎn)生治療抵抗。當(dāng)不利刺激因素持續(xù)存在，或應(yīng)激反應(yīng)不足以減弱或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞損傷時，凋亡、程序性壞死、焦亡和鐵死亡等信號通路可被激活，啟動細(xì)胞的死亡程序[26]。

近年來，隨著“免疫原性細(xì)胞死亡”（immunogenic cell death，ICD）概念的提出，細(xì)胞應(yīng)激和死亡通路對腫瘤免疫原性的影響成為新興的研究熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究證實(shí)：放化療導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自噬、UPR、凋亡、程序性壞死，上述信號通路的激活可觸發(fā)危險信號分子的釋放，對增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性至關(guān)重要。其中，ATG5、ATG7、caspase、RIP3或MLKL的缺失或阻斷可抑制ATP的釋放，RIP3或MLKL的缺失可降低HMGB1的釋放，均不利于抗腫瘤免疫的啟動[27]?；熯€可促進(jìn)STAT3的磷酸化，該信號通路的活化不僅可以促進(jìn)癌細(xì)胞的存活，還能抑制其Ⅰ型干擾素應(yīng)答，阻礙抗腫瘤免疫的活化[28]。

UPR對腫瘤細(xì)胞免疫原性的影響仍然存在較大的認(rèn)知空白?；熆杉せ畎┘?xì)胞的蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激 酶（protein kinase-like ER-resident kinase，PERK）通路，該UPR 分支可促進(jìn)鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CALR）由ER 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外表面，增強(qiáng)癌細(xì)胞的免疫原性，幫助DC 攝取和提呈腫瘤抗原，激活效應(yīng)T 細(xì)胞[29]。本研究重點(diǎn)關(guān)注ATF6 信號通路對腫瘤細(xì)胞免疫原性的影響，及其對機(jī)體自發(fā)（并非治療引發(fā)）的免疫監(jiān)視功能的調(diào)控作用。雖然敲除Atf6不影響MCA205 細(xì)胞在體外的增殖和能量代謝，但是Atf6-/-MCA205 細(xì)胞在免疫健全小鼠體內(nèi)的成瘤速度顯著降低，可出現(xiàn)滯長甚至自發(fā)消退。Atf6-/-腫瘤MCA205 細(xì)胞在Ifnar-/-小鼠體內(nèi)仍然會出現(xiàn)滯長和自發(fā)消退，但其生長峰值和徹底消退所需時間均高于其在免疫健全小鼠內(nèi)的對應(yīng)參數(shù)。在nu/nu小鼠體內(nèi)，WT 和Atf6-/-MCA205 細(xì)胞均可快速成瘤，兩者生長的差異顯著降低。值得注意的是，與WT 腫瘤相比，Atf6-/-移植瘤組織內(nèi)凋亡、焦亡通路的活化并未增強(qiáng)，甚至還有一定程度的減弱。上述現(xiàn)象提示，Atf6-/-MCA205 細(xì)胞體內(nèi)成瘤減緩并非依賴于凋亡或焦亡通路的活化，其主要原因是效應(yīng)T細(xì)胞的激活，腫瘤宿主的IFNAR 信號通路也發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用。腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄譜圖分析提示，ATF6的缺失引發(fā)了腫瘤免疫微環(huán)境的重塑，IFN-α/β 相關(guān)應(yīng)答、IFN-γ 通路、NK 細(xì)胞殺傷力、免疫細(xì)胞的活化和遷移均顯著增強(qiáng)。ELISPOT實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Atf6-/-腫瘤微環(huán)境中分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞的豐度明顯提升。

借助Tm預(yù)處理模擬不利微環(huán)境因素的刺激，可觀察到Ⅰ型IFN應(yīng)答的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Irf7和Irf3的表達(dá)在Atf6-/-MCA205細(xì)胞中顯著高于WT細(xì)胞。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ERS 后用于prime-boost 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Atf6缺失可促進(jìn)腫瘤抗原特異性T 細(xì)胞的活化，增強(qiáng)其IFN-γ 分泌。此外，Atf6-/-MCA205 細(xì)胞對NK 細(xì)胞的殺傷更敏感。上述現(xiàn)象表明，ATF6是限制腫瘤細(xì)胞免疫原性的重要瓶頸。具體的分子機(jī)制有待在后續(xù)研究中深入挖掘。ATF6 是分子伴侶、折疊酶、ERAD 相關(guān)基因表達(dá)的重要調(diào)控因子[5]，其缺失可能加劇蛋白錯誤折疊，引發(fā)新生抗原表位的暴露。此外，IFN-α/β 和IFN-γ 可促進(jìn)Ⅰ類和Ⅱ類MHC 分子的表達(dá)[30-31]，增強(qiáng)抗原的交叉提呈[32]，有助于增強(qiáng)腫瘤抗原的提呈。在黑色素瘤中，IRE1α-XBP1 和PERK 通路的活化可 能會抑制MICA、MICB、B7H6等應(yīng)激誘導(dǎo)配體分子的表達(dá)，從而抑制NK細(xì)胞的殺傷功能。Atf6是否也能發(fā)揮類似的調(diào)控作用值得進(jìn)一步探索?？傊贸鼳tf6不僅能降低腫瘤細(xì)胞抵御不利環(huán)境的存活能力，還能增強(qiáng)其免疫原性，通過激活抗腫瘤免疫應(yīng)答有效預(yù)防和治療腫瘤。對于多個癌種而言，ATF6低表達(dá)的患者，其總體生存時間更長。因此，針對該靶點(diǎn)開發(fā)抑制劑分子具有較好的應(yīng)用前景。