丁紅梅, 彭 旭, 余喜訊

(1. 四川大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065；2. 四川大學(xué)動物實驗中心，四川 成都 610225)

聚磷酸鈣（CPP）是一種新型的無機(jī)聚合物（化學(xué)式[Ca(PO3)2]n，Ca:P=0.5），由線型聚磷酸根主鏈和抗衡離子組成，具有-34 mV 的高Zeta 電位[1,2]。CPP具有與天然骨相似的無機(jī)成分，被廣泛用于骨修復(fù)領(lǐng)域。以往研究證明，CPP 多孔支架具有良好的骨傳導(dǎo)性、可生物降解性和生物相容性[3,4]。然而，CPP 多孔支架的抗菌性能很差，在植入時面臨嚴(yán)重的細(xì)菌感染問題，有可能導(dǎo)致骨植入手術(shù)的失敗。因此，亟待對CPP 多孔支架進(jìn)行表面修飾，構(gòu)建具有抗菌作用的多功能涂層。

氧化石墨烯（GO）是帶有含氧官能團(tuán)的石墨烯衍生物，其二維平面的表面含有羥基和環(huán)氧基，邊緣含有羧基[5]。GO 具有卓越的力學(xué)性能和較大的比表面積，這些特性賦予GO 優(yōu)異的理化特性、生物活性和抗菌作用，常常被作為抗菌涂層應(yīng)用于骨修復(fù)支架的表面改性[6,7]。Ouyang 等[8]通過簡單的浸涂法將GO 固定在多孔聚醚醚酮骨修復(fù)支架的表面，得到的復(fù)合支架具有良好的抗菌作用。Liu 等[9]通過偶聯(lián)劑硅烷將GO 固定在硅橡膠表面，得到了具有GO 抗菌涂層的改性硅橡膠，抗菌實驗表明，GO涂層顯示出優(yōu)異的抗菌活性。然而，簡單的物理結(jié)合使得GO 與支架表面的作用力較弱，不利于GO 在支架表面的均勻分布，從而影響抗菌涂層的穩(wěn)定性，而中間連接介質(zhì)硅烷的使用會在一定程度上影響支架表面的生物相容性。由于GO 表面豐富的含氧官能團(tuán)能為制備GO 衍生物提供反應(yīng)活性位點，因此，可以進(jìn)一步對GO 進(jìn)行改性以獲得穩(wěn)定和多功能的抗菌涂層。

殼聚糖（CS）是一種天然的陽離子聚合物，具有優(yōu)異的抗菌活性、良好的生物降解性、突出的生物相容性和優(yōu)良的理化性能，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)植入物、支架、藥物輸送系統(tǒng)、生物傳感器和其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[10]。CS 最初來源于幾丁質(zhì)，是幾丁質(zhì)的衍生物，具有優(yōu)異的成膜性能[11]。殼聚糖與其他多糖的區(qū)別在于，其在酸性pH 值下的陽離子性質(zhì)，在溫和的酸性條件下，其氨基被質(zhì)子化，能促進(jìn)與其他分子的相互作用。利用這一特性，可以對其結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)和生物學(xué)特性進(jìn)行調(diào)整。

因此，本文將CS 接枝在GO 表面，制備了CSrGO，并首次將其作為涂層用于CPP 多孔支架的表面改性，得到一系列CPP/CS-rGO 復(fù)合支架。其中，在酸性條件下，CS-rGO 上的氨基發(fā)生質(zhì)子化，使CS-rGO 帶有正電荷，可以通過自組裝方式涂覆在帶有負(fù)電荷的CPP 多孔支架表面上。同時，CS-rGO 上的氨基和羥基與CPP 分子鏈的磷酸基團(tuán)產(chǎn)生氫鍵作用，進(jìn)一步增強了GO 與CPP 多孔支架的界面結(jié)合力，形成了穩(wěn)定的抗菌涂層。另外，GO 與CS 的協(xié)同抗菌作用可以賦予CPP 多孔支架顯著的抗菌性能，使其在骨修復(fù)領(lǐng)域展現(xiàn)出更大的應(yīng)用潛力。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

聚乙烯醇、碳酸鈣、硬脂酸、磷酸、乙酸：分析純，成都科龍化工試劑；氧化石墨烯：中科院成都有機(jī)研究所；殼聚糖：脫乙酰度大于90%，酷而化學(xué)；實驗用水：去離子水。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：HEIZDAB，德國Heidolph 公司；馬弗爐：SRJX-4-13，天津市泰斯特儀器有限公司；球磨儀：MM400，德國RETSCH（萊馳）公司。

1.2 樣品制備

1.2.1 CS-rGO 的制備：通過酰胺反應(yīng)成功地合成了CS-rGO（Scheme 1）。將均勻分散的GO（1 mg/mL，100 mL）水懸浮液緩慢地添加到殼聚糖醋酸水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，pH 為5.5～6, 100 mL）中。超聲處理10 min 后立即轉(zhuǎn)移到水浴溫度為90 ℃的水浴鍋中，并在磁力攪拌下反應(yīng)6 h。反應(yīng)每隔1 h 取樣1 次，在紫外分光光度計上獲得取樣產(chǎn)物的紫外光譜。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)產(chǎn)物高速離心（12000 r/min）10 min，并用大量醋酸水溶液（0.1 mol/L）徹底清洗，以去除未反應(yīng)完全的CS。然后將洗滌后的CS-rGO 溶液凍干，獲得干燥的CS-rGO，用于后續(xù)的表征和實驗。

Scheme 1 (a) Chemical structure of CS-rGO; (b) ball and stick structure of CS-rGO

1.2.2 CPP 多孔支架的制備：將碳酸鈣加入濃度為2 mol/L 的磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中得到磷酸二氫鈣溶液，其中碳酸鈣與磷酸的摩爾比為1∶2.5。然后將磷酸二氫鈣溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干水分，得到磷酸二氫鈣沉淀。收集沉淀，并用無水乙醇反復(fù)洗滌，直到沉淀濾液的pH 值約為7。然后將上述沉淀用紅外燈干燥。將干燥的磷酸二氫鈣粉末放入坩堝中，在馬弗爐中進(jìn)行聚合反應(yīng)，縮聚反應(yīng)溫度為500 ℃、時間為10 h。

聚合完成后，將溫度升到1100 ℃，獲得CPP 的高溫熔體。然后將熔融、黏稠的熔體從馬弗爐中取出，迅速倒在冰塊上，得到塊狀、透明的非晶態(tài)CPP。將所得非晶態(tài)CPP 研磨并過篩。

使用的致孔劑為硬脂酸，黏結(jié)劑為4%的聚乙烯醇。將CPP 粉末和硬脂酸按照質(zhì)量比3∶2 的比例進(jìn)行混合，加入少量黏結(jié)劑，在壓樣機(jī)上壓制成型，將獲得的型坯放入馬弗爐中進(jìn)行燒結(jié)。燒結(jié)時，先以5 ℃/min 的升溫速率從室溫升到300 ℃，保溫3 h，揮發(fā)硬脂酸，形成多孔結(jié)構(gòu)，然后再以5 ℃/min 的升溫速率升到850 ℃，保溫1.5 h，得到具有β晶相結(jié)構(gòu)的多孔CPP 支架。

待爐溫降至室溫后，將支架取出，用360#的砂紙打磨支架，將支架表面的致密層打磨掉，露出孔隙，以方便進(jìn)一步的表面改性。

1.2.3 CS-rGO 在CPP 多孔支架上的構(gòu)建：通過在乙酸水溶液（pH=4）中超聲CS-rGO，獲得特定質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.1%，0.3%和0.5%）的CS-rGO 懸浮液。將CPP多孔支架浸入上述不同濃度的CS-rGO 懸浮液（pH=4）中，10 min 后取出支架，用蒸餾水輕輕清洗，再60 ℃干燥3 h。由于氨基質(zhì)子化，帶正電荷的CSrGO 會與帶負(fù)電荷的CPP 分子鏈產(chǎn)生強靜電作用，同時，CS-rGO 的含氫官能團(tuán)會與CPP 上的磷酸基團(tuán)產(chǎn)生氫鍵作用。由于兩者之間的強靜電作用和氫鍵作用，CS-rGO 會自組裝到CPP 支架表面并形成穩(wěn)定的涂層(Scheme 2)。將制備的不同CPP/CS-rGO 復(fù)合支架命名為CPP/CS-rGO/X（X是CS-rGO 在乙酸水溶液中的濃度），例如CPP/CSrGO/0.1，CPP/CS-rGO/0.3 和CPP/CS-rGO/0.5。

Scheme 2 Interaction between CS-rGO and CPP

1.3 測試與表征

1.3.1 Zeta 電位分析：使用Zetasizer Nano ZS（英國馬爾文）在25 ℃測量GO 和CS-rGO 的Zeta 電位。檢測樣品的制備：對于GO，將GO 溶解在中性的蒸餾水中，超聲分散2 h；對于CS-rGO，以相同的濃度分別溶解在pH=4，5，6 和7 的醋酸水溶液中。另外，使用固體/薄膜表面Zeta 電位儀（SurPASS 3，奧地利安東帕）測定CPP，CPP/CS-rGO/0.1，CPP/CS-rGO/0.3和CPP/CS-rGO/0.5 支架的表面電位。

1.3.2 電鏡觀察和Mapping 分析：使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，美國FEI，）觀察支架的表觀形貌。將多孔支架噴金，在8 kV 加速電壓下，使用SEM 觀察支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和CS-rGO 在CPP 多孔支架表面的分布情況。為了進(jìn)一步分析支架上CSrGO 的分布情況，進(jìn)行了Mapping 分析。

1.3.3 熱重分析：使用熱重分析儀（TG，瑞士METTLER）測定復(fù)合支架中CS-rGO 的含量。升溫速度為10 ℃/min，從50 ℃到800 ℃，空氣氣流流速為10 mL/min。

1.3.4 紫外光譜分析：使用UV-1750（日本島津）光譜儀檢測GO 和CS-rGO 在200～800 nm 的紫外-可見吸收光譜。吸收強度范圍為0～1.5 A，掃描速度為快速。

1.3.5 紅外光譜分析：為了評估支架材料的物理化學(xué)特性，進(jìn)行了傅里葉變換紅外光譜（FT-IR，美國Nicolet）分析。將所有樣品充分干燥后置于紅外燈下碾碎，然后按質(zhì)量比1∶20 與KBr 混合研磨，用壓片機(jī)壓成均勻透明的薄片，測試范圍為400～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.6 X 射線光電子能譜分析：通過X射線光電子能譜儀（XPS，AXIS Ultra DLD，英國Kratos）分析CS和CS-rGO 的元素全譜和氮元素的分峰譜。

1.3.7 X 射線衍射分析：為了評估GO 的還原情況和支架材料的晶相結(jié)構(gòu)，使用X 射線衍射儀（XRD，X‘Pert Pro MPD，荷蘭）進(jìn)行測量。首先使用瑪瑙杵將所有樣品研磨成細(xì)粉末，均勻地鋪于載玻片的表面，然后放在XRD 的載物臺上，設(shè)置測試正極電壓為40 kV，燈絲電流為35 mA，以2(°)/min 的掃描速度從5°到80°收集數(shù)據(jù)。測試完成后將CPP 的XRD光譜與β-CPP 的索引光譜（JCPDS#01-0771953）進(jìn)行比較。

1.3.8 拉曼分析：用激發(fā)波長為532 nm 的激光，采用LabRAM HR 拉曼光譜儀（HORIBA Jobin Yvon，法國）得到拉曼光譜。

1.3.9 力學(xué)性能測試：使用萬能測試機(jī)（5567 型，美國Instron）在圓柱形支架上（Ф5 mm×5 mm）單軸壓縮試驗。在室溫以0.5 mm/min 的壓縮速率進(jìn)行壓縮，直到支架崩塌。

1.3.10 體外礦化：將支架（Ф5 mm×1 mm）浸入20 mL 的標(biāo)準(zhǔn)模擬體液(SBF)中，每2 d 更換1 次SBF。在37 ℃孵育14 d 后，取出支架，用去離子水沖洗3次，在60 ℃干燥12 h，使用SEM 和mapping 研究支架表面磷灰石的生長情況，進(jìn)而評估支架材料的體外生物活性。

1.3.11 抗菌率測定：抗菌試驗前將細(xì)菌菌液的濃度調(diào)為1×106CFU。以CPP 和CPP/CS-rGO/0.3 支架為例來探究CS-rGO 涂層的抗菌作用。將大腸桿菌(革蘭氏陰性，E.coli)和金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性，S.aureus)的菌懸液分別與CPP 和CPP/CS-rGO/0.3支架一起孵育24 h。菌液與支架材料共培養(yǎng)后，吸取60μL菌液并稀釋至特定濃度，取稀釋后的菌液30μL 均勻涂抹在瓊脂板上繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后取出瓊脂板并對板內(nèi)菌落進(jìn)行拍照，使用IMAGEJ 軟件測量瓊脂板上的菌落數(shù)?？咕拾词剑?）計算

式中：R——抗菌率；B——空白對照組瓊脂板的菌落數(shù)；C——實驗組瓊脂板中的菌落數(shù)

1.3.12 細(xì)菌形態(tài)觀察：通過SEM 觀察細(xì)菌的形態(tài)變化。通常，將共培養(yǎng)后的支架-細(xì)菌結(jié)合物樣品用PBS 洗滌，并在4 ℃用2.5%戊二醛固定過夜。之后，使用一系列乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)30%，50%，75%，90%，95%和100%）依次將樣品脫水20 min。脫水完成后，用金濺射涂有細(xì)菌的干燥樣品用于SEM 觀察。

1.3.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析：實驗數(shù)據(jù)采用Origin 9.0 數(shù)據(jù)處理軟件。本研究相關(guān)數(shù)據(jù)都通過平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差的形式給出。

2 結(jié)果與討論

2.1 Zeta 電位

Fig.1 中 顯 示 了GO 和 不 同pH 下CS-rGO 的Zeta電位。GO 的Zeta 電位為-31 mV，而CS-rGO 的Zeta電位在2.4～25 mV（pH=7～4），并且隨著酸性的增加，CS-rGO 的Zeta 電位逐漸增加，這種現(xiàn)象是因為在酸性條件下，CS-rGO 上的氨基發(fā)生質(zhì)子化，并且酸性越強，質(zhì)子化程度越大，電位也就越大。以上結(jié)果表明，CS-rGO 上存在氨基，從而說明了CS 在GO 上的成功接枝。

Fig.1 Zeta potential of GO and CS-rGO

CPP 和CPP/CS-rGO 復(fù)合支架的表面Zeta 電位如Fig.2 所示。CPP 的Zeta 電位為-27 mV，因此，在酸性條件下，帶正電荷的CS-rGO 可以通過自組裝的方式涂覆到帶負(fù)電荷的CPP 多孔支架上。對于CPP/CS-rGO 復(fù)合支架，隨著CS-rGO 含量的增加，電位逐漸接近正值，這也說明CS-rGO 在CPP 多孔支架上的成功涂覆。

Fig.2 Zeta potential of CPP scaffold and CPP/CS-rGO composite scaffolds

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

研究表明，多孔支架需要具有相互連接的孔結(jié)構(gòu)，以允許細(xì)胞和液體侵入支架并激活骨形成過程。如Fig.3 所示，CPP 多孔支架具有相互連通的孔結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的黏附和增值提供了空間環(huán)境。同時，在高倍數(shù)下觀察到，在支架大孔隙的表面還存在大量很小的微孔結(jié)構(gòu)，其尺寸在幾微米左右，使整個支架內(nèi)部呈現(xiàn)出與骨組織相似的疏松多孔結(jié)構(gòu)。其中，這種很小的微孔結(jié)構(gòu)有利于營養(yǎng)物質(zhì)的運輸以及細(xì)胞代謝廢物的排出。

Fig.3 Morphology of CPP porous scaffolds (Ф10 mm×10 mm)

Fig.4(a)是CPP 和CPP/CS-rGO 支架的光學(xué)照片，其中，從里圈到外圈依次代表CPP，CPP/CS-rGO/0.1，CPP/CS-rGO/0.3 和CPP/CS-rGO/0.5 多 孔 支 架。從圖中可以看到，CPP 多孔支架呈現(xiàn)白色的外觀，而CPP/CS-rGO 復(fù)合支架由于表面涂覆了CS-rGO 而呈現(xiàn)黑色的外觀，并且隨著CS-rGO 含量的增加，顏色變得越深。此外，為了計算支架表面分布的CS-rGO的精確含量，進(jìn)行了TG 分析，F(xiàn)ig.4(b)是復(fù)合支架的熱失重率。隨著CS-rGO 含量的增加，復(fù)合支架的熱失重率逐漸增加，其中，具有最高CS-rGO 含量的CPP/CS-rGO/0.5 的熱重?fù)p失率僅為0.76%，這說明復(fù)合支架的大部分都可以在體內(nèi)降解，而少量的CSrGO 可以通過胞吞的方式進(jìn)行代謝。

Fig.4 (a) Digital photo of CPP and CPP/CS-rGO scaffolds, the scaffolds from inner ring to outer ring represent CPP,CPP/CS-rGO/0.1, CPP/CS-rGO/0.3 and CPP/CS-rGO/0.5(Ф10 mmx1 mm), respectively; (b) TG loss rate of CPP, CPP/CS-rGO/0.1, CPP/CS-rGO/0.3 and CPP/CS-rGO/0.5 scaffolds

以CPP/CS-rGO/0.3 多孔支架為例，通過SEM 和Mapping 評估了CS-rGO 的分布情況。從Fig.5(b～e)可以看到，CS-rGO 涂層均勻穩(wěn)固地分布在CPP 多孔支架的孔壁上。另外，從Fig.5(d)觀察到，一些CSrGO 納米片進(jìn)入到小尺寸的微孔中，一方面可以起到支撐支架的作用，進(jìn)而增加多孔支架的壓縮強度，同時，在多孔支架的體內(nèi)降解過程中，這些納米片的支撐作用可以防止支架的突然崩塌。另一方面，可以為細(xì)胞提供額外的黏附點。為了更大范圍地評估CS-rGO 的分布情況，對復(fù)合支架進(jìn)行了Mapping 分析。Fig.5(i)和Fig.5(j)中C 和N 元素的均勻分布，進(jìn)一步說明了CS-rGO 在CPP 多孔支架上的均勻分布。

Fig.5 (a～f) SEM images of microstructures of CPP/CS-rO/0.3 scaffolds; (g)Ca, (h) P, (i) C and (j) N mapping images of (f)

2.3 紫外光譜分析

為了監(jiān)測整個反應(yīng)，反應(yīng)過程中每隔1 h 取樣1次，然后用紫外分光光度計獲得取樣產(chǎn)物的紫外光譜。取樣產(chǎn)物的光學(xué)照片如Fig.6(A)所示，GO 的顏色是金黃色的，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物顏色逐漸變?yōu)楹谏簿褪沁€原氧化石墨烯的顏色，這說明在反應(yīng)過程中，GO 逐漸被還原了。Fig.6(B)是GO 和取樣產(chǎn)物的紫外光譜，231.3 nm 的特征吸收峰是GO 的特征吸收峰，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，GO 的吸收峰從231.3 nm慢慢偏移到249.4 nm，證明GO 的成功還原[6]。

Fig.6 (A) Photographs and (B) UV spectra of reaction products at different time（a: GO;b:1 h;c:2 h:d:3 h;e:4 h;f:5 h;g:6 h）

2.4 紅外光譜分析

Fig.7 顯示了CPP，GO，rGO，CS 和CPP/CS-rGO/0.3 的FT-IR 光譜。GO 曲線中1794 cm-1處是羧基C=O 的 伸 縮 振 動，在CS-rGO 曲 線 中，GO 的C=O 伸 縮振動的特征峰消失，表明GO 的羧基已被CS 的氨基消 耗。此 外，在719 cm-1，748 cm-1，和790 cm-1是CPP 分子鏈中P—O—P 的振動峰，942 cm-1和1060 cm-1分別是PO32-的對稱伸縮和不對稱伸縮振動峰，1260 cm-1是PO2-的對稱伸縮振動特征峰，證明了CPP 的成功制備[12]。另外，同樣的特征吸收峰出現(xiàn)在CPP/CS-rGO/0.3 的曲線中，說明在整個復(fù)合支架制備的過程中，CS-rGO 的引入并沒有改變CPP 的分子鏈結(jié)構(gòu)。

Fig.7 FT-IR spectra of CS,GO,CS-rGO,CPP and CPP/CS-rGO/0.3

2.5 XPS 分析

通過XPS 全譜分析GO，CS 和CS-rGO 中C、O和N 元素的含量，結(jié)果如Fig.8(a)所示，在CS-rGO 中出現(xiàn)了CS 的特有N 元素，表明CS 已成功接枝到GO 上。Fig.8(b)和Fig.8(c)分別是CS 和CS-rGO 的氮元素分峰譜圖，CS 存在2 個典型的特征峰399.0 eV和401.1 eV ，分別對應(yīng)C—NH2和C—NH3+。相比于CS，CS-rGO 的C—NH2和C—NH3+發(fā)生少許偏移，并且在400.3 eV 出現(xiàn)了C—NHCO 的特征峰，這表明CS 的氨基與GO 的羧基形成了酰胺鍵。

Fig.8 (a)Atomic contents of C, O, and N elements in CS, GO and CS-rGO; XPS spectra of (b) CS and (c) CS-rGO

2.6 拉曼光譜分析

石墨烯材料的拉曼光譜中存在典型的D 峰和G峰，D 峰代表石墨烯的缺陷及無定形結(jié)構(gòu)，反映石墨烯材料中的無序程度，而G 峰則代表有序的SP2結(jié)構(gòu)。通過拉曼光譜中D 峰與G 峰的強度之比，可以定性表征石墨烯材料的石墨化程度，比值越大，石墨化程度越低[13]。GO 和CS-rGO 的拉曼光譜如Fig.9 所示，GO 和CS-rGO 典型的D 峰和G 峰大約在1346 cm-1和1595 cm-1附 近，其 中GO 的ID/IG為0.91，CS-rGO 的ID/IG為1.01，CS-rGO 的ID/IG明顯高于GO 的ID/IG，說明了GO 的成功還原。

Fig.9 Raman spectra of GO and rGO

2.7 XRD 分析

從Fig.10 可以看出，GO 的XRD 圖譜在9.8°處顯示出典型的特征峰。這個典型的特征峰是GO 表面含氧基團(tuán)導(dǎo)致的特征峰，而在CS-rGO 的XRD 圖譜中，這個特征峰消失，說明了GO 含氧基團(tuán)的去除，從而進(jìn)一步證實了GO 的還原。

Fig.10 XRD patterns of GO, CS-rGO, CPP/CS-rGO/0.3 and β-CPP

另外，之前的研究表明，根據(jù)樣品制備過程中的工藝條件，CPP 可以形成不同的相結(jié)構(gòu)（無定形，α，β，γ，可能還有δ）。在CPP 這些不同的相結(jié)構(gòu)中，只有β-CPP 適合作為骨替代材料[14]。CPP/CSrGO/0.3 的XRD 光譜與β-CPP 的標(biāo)準(zhǔn)索引XRD 圖譜在對應(yīng)的相同位置顯示出峰值，證實CPP/CS-rGO/0.3 多孔支架中β-CPP 是主導(dǎo)相，說明CPP/CS-rGO/0.3 多孔支架適合作為骨替代材料。

2.8 壓縮強度

一定的力學(xué)強度對骨修復(fù)材料來說是非常重要的，尤其當(dāng)材料應(yīng)用于負(fù)重部位時。Fig.11 是各種支架的壓縮強度，從圖中可以看出，隨著CS-rGO 含量的增加，復(fù)合支架的壓縮強度也在增加，說明CSrGO 可以提高CPP 多孔支架的壓縮強度。一方面是因為一些CS-rGO 嵌入小微孔中，起到一定的支撐作用；另一方面，CS-rGO 與CPP 多孔支架之間的強靜電作用和氫鍵作用也提高了CPP 多孔支架的壓縮強度。另外，所有的支架都滿足松質(zhì)骨的力學(xué)要求（2～20 MPa）[15]。

Fig.11 Compression strength of CPP, CPP/CS-rGO/0.1, CPP/CSrGO/0.3 and CPP/CS-rGO/0.5 scaffolds

2.9 體外礦化

體外成骨生物活性通常通過模擬體液(SBF)中的生物材料表面形成磷灰石的能力來評估。本文以CPP 和CPP/CS-rGO/0.3 支架為例，評估了CS-rGO對支架表面磷灰石形成的影響。在用1.5×SBF 中孵育14 d 后，CPP/CS-rGO/0.3 支架表面的礦化沉積物明顯多于CPP 支架表面的礦化沉積物（Fig.12(a)），這表明CS-rGO 可以促進(jìn)磷灰石在其表面的沉積，同時，在CS-rGO 涂層上也觀察到許多類似于羥基磷灰石晶核的物質(zhì)。上述礦化沉積和羥基磷灰石的成核晶體可歸因于CS-rGO 上豐富的官能團(tuán)與SBF 中Ca2+和PO43-之間的強相互作用。此外，CPP/CS-rGO/0.3 支架上的磷灰石樣沉積物通過EDS 圖譜測試得到了進(jìn)一步證實（Fig.12(b)）。CPP 的鈣磷比為0.51，而磷灰石沉積物的鈣磷比約為2.31，與羥基磷灰石相似（Fig.12(c)），證明了沉積物確實為磷灰石沉積物。

2.10 抗菌性能

本文以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌來2 種模型細(xì)菌來評估CS-rGO 涂層的抗菌性能。如Fig.13 所示，在支架與細(xì)菌共培養(yǎng)24 h 后，CPP/CS-rGO/0.3 組中約71%的金黃色葡萄球菌和66%的大腸桿菌受到抑制，這說明CS-rGO 涂層對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抗菌作用。

Fig.13 (a) Bacterial growth images on agar plates; (b) antibacterial activity (against S. aureus and E. coli) after incubating bacterias with scaffolds for 24 h

用SEM 觀察細(xì)菌與CS-rGO 涂層接觸后的形貌變化。從Fig.14 的電鏡圖中可以看到，CPP/CS-rGO/0.3 支架表面的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌明顯少于CPP 組，并且部分細(xì)菌輪廓邊緣破裂，這說明CS-rGO 涂層對細(xì)菌的生長具有顯著的抑制作用。此外，在CPP 和CPP/CS rGO/0.3 支架表面均未觀察到細(xì)菌生物膜的形成。CS-rGO 涂層可能的抗菌機(jī)理如下：一方面，在細(xì)菌感染的酸性環(huán)境下，CSrGO 上的氨基質(zhì)子化而帶有正電荷，正是這些正電荷可以與帶負(fù)電荷的細(xì)菌膜作用，從而殺死細(xì)菌；另一方面，CS-rGO 與細(xì)菌接觸后能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而加大細(xì)菌細(xì)胞膜壓力，達(dá)到破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)的作用。

Fig.14 SEM images of bacteria attached on scaffolds

3 結(jié)論

本文通過酰胺反應(yīng)成功制備了CS-rGO，并首次將其用于CPP 多孔支架的表面改性，在CPP 多孔支架的表面成功構(gòu)建了具有抗菌作用的多功能CSrGO 涂層。結(jié)果表明，CS-rGO 能夠均勻穩(wěn)定地分布在CPP 多孔支架的表面，CS-rGO 表面豐富的官能團(tuán)促進(jìn)了Ca2+和PO43-的沉積，提高了CPP 多孔支架的體外礦化能力。同時，CS-rGO 涂層賦予了CPP 多孔支架優(yōu)異的抗菌性能，大大降低了骨修復(fù)過程中的細(xì)菌感染風(fēng)險?？傊?，本文在CPP 多孔支架上成功構(gòu)建了多功能性的CS-rGO 涂層，顯著改善了CPP 多孔支架的理化性能和抗菌性，制備的CPP/CS-rGO 復(fù)合支架在骨修復(fù)和再生中顯示出強大的應(yīng)用前景。