王冬梅 高曉旭 徐景秀 賈 俊

（1 北京華耐農業(yè)發(fā)展有限公司研究中心，北京 102200；2 北京市密云區(qū)農業(yè)技術推廣站，北京 101500）

結球甘藍（L.var.L.）簡稱甘藍，是十字花科蕓薹屬甘藍種中能形成葉球的一個變種，頂芽成球，生長周期短，產量高，質地脆嫩，營養(yǎng)豐富，耐貯運，在我國種植非常廣泛。甘藍為兩年生草本植物，需經(jīng)冬季2～3 個月的綠體低溫春化才能開花結實，繁殖1 代至少需要1 年的時間，育種周期長，一個品種的育成一般需要10 年以上，對甘藍種業(yè)發(fā)展極為不利。由于甘藍的胞質不育轉育簡單，不育性容易保持，故此項技術在甘藍雄性不育系的轉育上得到廣泛應用（季家磊 等，2016），育成了多個優(yōu)良甘藍品種（方智遠 等，2003；莊木 等，2010；楊麗梅 等，2011）。純合的高代自交系材料轉育成雄性不育系又需6～8年的時間，致使甘藍品種的育成時間幾乎增加了一倍（Perez-Prat &van Lookeren Campagne，2002），時間過長，亟待尋找可以縮短育種時間的方法。前人對蕓薹屬植物通過春化階段所需要的植株營養(yǎng)體大小、光照、溫度以及感應低溫的時間已有了較明確的研究結果（日本農山漁村文化協(xié)會，1985；許蕊仙，1986；張雪梅和許蕊仙，1989；余陽俊 等，2007），但是缺少綜合考慮甘藍世代繁殖所需要的條件，獲得甘藍世代繁殖所需最短時間的研究。本試驗將甘藍世代繁殖分為3 個主要階段：綠體階段（發(fā)芽到植株生長到合適大?。?、春化到開花階段（進入春化室到授粉）、成苗階段（授粉到種子發(fā)芽）。探尋每個階段所需要的最短時間，以期獲得一種可以實現(xiàn)甘藍一年繁殖兩代的方法，縮短甘藍的育種周期。由于整個繁殖世代的甘藍植株均處于幼苗期，不能進行成株期的性狀選擇，因此利用SSR 引物在甘藍幼苗期進行背景選擇（劉基生 等，2014；于海龍，2015），獲取遺傳背景更接近保持系的不育系，作為下一個世代的回交母本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在北京華耐農業(yè)發(fā)展有限公司研究中心昌平基地進行，參試甘藍材料亦由該公司提供，4份高代自交系G158、G694、G639、G680；G158胞質不育的BC單株15 株，編號G158MS-1～G158MS-15；G639 胞質不育的BC單株9 株，編號G639MS-1～G639MS-9。其中G158 和G694 耐抽薹性弱，G639 耐抽薹性中等，G680 耐抽薹性強。

1.2 試驗方法

以種子成苗為節(jié)點，一年分為兩個周期：夏秋周期，6—11 月；冬春周期，12 月至翌年5 月。對可縮短生殖周期的2 個關鍵因素，即授粉到種子發(fā)芽時間、春化+開花時間進行篩選試驗。

1.2.1 篩選適宜的胚珠剝取時間 為了縮短種子成熟所用的時間，在種莢中的種子成熟之前，剝取胚珠置于鋪有滅菌濾紙（使用無菌水噴濕）的培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中催芽，溫度控制在25 ℃，光照16 h/黑暗8 h，噴灑無菌水保濕；待子葉展開，根系長度為1.5 cm 左右時，移栽到基質中。2020年5 月（冬春周期）選擇4 份材料G158、G694、G639、G680，剝取胚珠時間分別為蕾期人工授粉后30、35、40、45、50 d；2020 年11 月中旬（夏秋周期）選擇2 份材料G158、G639，剝取胚珠時間分別為蕾期人工授粉后45、50 d。不設重復，冬春周期每份材料剝取胚珠30～66 個，夏秋周期每份材料剝取胚珠100 個。調查記錄發(fā)芽數(shù)、授粉至成苗天數(shù)、幼苗生長情況等，計算發(fā)芽率。

1.2.2 篩選適宜的植株大小和春化時間 夏秋周期，以耐抽薹性不同的G158、G639、G680 為試材，植株大小設置2 個水平：7～9 片真葉的小苗和13～15 片真葉的大苗。春化時間設置3 個梯度：50、60、70 d。不設重復，每處理10 株。2020 年7月中旬放入春化室，最低春化溫度為7 ℃，紅藍光比例為3∶1 的LED 燈24 h 光照；春化完成后定植于溫室，前期為了降溫，防止脫春化，溫室溫度白天控制在25 ℃左右，夜間15 ℃左右，并利用日光燈補充光照；10 月中下旬授粉結籽后，為了保溫，在溫室中搭建拱棚并覆蓋保溫被。

冬春周期，以G158、G639 為試材，植株大小為7～9 片真葉的小苗，春化時間設置5 個梯度：50、55、60、65、70 d；不設重復，每處理10 株。2021 年1 月中旬放入春化室，最低春化溫度為4℃，紅藍光比例為3∶1 的LED 燈24 h 光照；春化完成后定植于大棚，正常水肥管理。

調查記錄抽薹開花株數(shù)、抽薹開花天數(shù)、植株生長情況等，計算抽薹開花率、春化+開花天數(shù)。

1.2.3 利用SSR 標記選擇回交后代 參試材料 為G158 胞質不育的BC單株G158MS-1～G158MS-15，以G158 的相應保持系作為對照；G639 胞質不育的BC單 株G639MS-1～G639MS-9，以G639 的相應保持系作為對照。分別取植株的幼嫩葉片，采用改良CTAB 法（Yan et al.，2008）提取DNA，-20 ℃保存。

選用均勻分布在甘藍9 條染色體上的擴增穩(wěn)定、條帶清晰、擴增差異明顯、多態(tài)性好的27 對EST-SSR 引物，包括NT/Y 2473—2013《結球甘藍品種鑒定技術規(guī)程SSR 分子標記法》公布的20對甘藍核心引物，劉基生等（2014）公布的7 對EST-SSR 引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應體系10 μL，包含DNA模 板4 μL，10× PCR Buffer（含MgCl）1 μL，10 μmol·L上、下游引物各0.4 μL，dNTP（10 μmol·L）0.2 μL，DNA 聚合酶0.1 μL，ddHO 3.9 μL。PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，32 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR 產物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，快速銀染法染色后拍照。

確定每對引物在24 個不育系單株和2 個保持系中擴增的等位變異數(shù)，統(tǒng)計每份樣品等位變異的有無，有記為“1”，無記為“0”，建立數(shù)據(jù)庫。利用NTSYSPC 2.10e 軟件，計算保持系與不育系之間的親緣關系，采用非加權平均法（UPGMA）進行聚類分析，構建聚類樹。

2 結果與分析

2.1 不同胚珠剝取時間對甘藍成苗的影響

2.1.1 冬春周期 從表1 可以看出，隨著授粉至剝取胚珠天數(shù)的增加，4 份甘藍材料的發(fā)芽率均呈增加趨勢；但不同材料的胚珠適宜剝取時間有一定差異，G158 授粉后40 d 的胚珠發(fā)芽率達到72.73%，G694 授粉后45 d 的胚珠發(fā)芽率為70.00%，而G639 和G680 授粉后50 d 的胚珠發(fā)芽率才超過60%。授粉后30～35 d 的胚珠軟嫩，幼胚很小，未發(fā)育完全，基本不出芽，胚珠很快就褐化死亡，極個別成苗也發(fā)育畸形；授粉后45～50 d 的胚珠成苗大部分正常，授粉至成苗時間為50～57 d。表明，冬春周期剝取胚珠的最佳時間為授粉后45～50 d。

表1 冬春周期不同胚珠剝取時間對甘藍發(fā)芽率及成苗情況的影響

2.1.2 夏秋周期 此周期種子成熟時溫度較低，胚珠發(fā)育需要較長時間，G639 授粉后45 d 的胚珠發(fā)芽率較低，幼苗長勢慢，部分畸形；G158 授粉后45 d 的胚珠發(fā)芽率雖然達到60.00%，但也明顯低于冬春周期，幼苗長勢慢（表2）。表明，夏秋周期剝取胚珠的最佳時間為授粉后50 d，幼苗發(fā)育正常，授粉至成苗時間為56～58 d。

表2 夏秋周期不同胚珠剝取時間對甘藍發(fā)芽率及成苗情況的影響

2.2 不同植株大小和春化時間對甘藍開花的影響

2.2.1 春化植株大小 從表3 可以看出，春化時間為50 d 時，由于春化時間較短，G158 兩種大小的幼苗都表現(xiàn)為春化不完全，前期死蕾，抽薹開花時間長；而G639、G680 未通過春化。春化時間為60 d 時，G158 兩種大小的幼苗都通過了春化，且抽薹開花天數(shù)相近；G639 大苗開花情況較小苗好，但是都可以正常授粉得到種子，抽薹開花天數(shù)接近；G680 基本未通過春化。春化時間為70 d 時，G158和G639 兩種大小的幼苗都通過了春化，抽薹開花時間較春化60 d 處理縮短了4～6 d；而G680 兩種大小的幼苗都表現(xiàn)為春化不完全。總體上講，營養(yǎng)體較大的植株并未明顯縮短春化時間，并且所需抽薹開花天數(shù)也與小苗接近，而7～9 片真葉小苗營養(yǎng)體生長需要40 d 左右，13～15 片真葉大苗營養(yǎng)體生長需要50 d 左右，所以在以縮短生殖周期為目標的宗旨下，宜選擇7～9 片真葉的小苗進行春化。

2.2.2 夏秋周期的春化時間 從表3 還可以看出，3 種不同耐抽薹類型的甘藍材料存在一個共同的特點：春化的天數(shù)越短，抽薹開花所需要的天數(shù)越長，而春化+開花的總天數(shù)相差不大，但是春化時間短，正常抽薹開花率低，所以在保證正常抽薹開花總時間最短的情況下，應選擇春化時間較長的組合。G158 小苗的最佳春化時間為60 d，春化+開花天數(shù)為90 d；G639 小苗的最佳春化時間亦為60 d，雖然抽薹枝條少，但可以正常授粉結籽，春化 +開花天數(shù)為92 d；而G680 由于冬性強，春化時間50、60 d 處理的小苗均未通過春化，春化60 d 處理的大苗僅1 株頂端開了幾朵花，春化時間延長到70 d 時，小苗30%抽薹，但開花少，死蕾嚴重，大苗80%抽薹，但是枝條少，死蕾嚴重，所以后期試驗中剔除了G680。

表3 夏秋周期不同植株大小與春化時間對甘藍開花的影響

2.2.3 冬春周期的春化時間 本周期甘藍材料的開花時間集中在春季的4 月，相同的春化時間條件下抽薹開花時間較秋季短，所以春化+開花的總時長較秋季短，G158 最佳春化時間為55 d，抽薹開花率達到80%，春化+開花天數(shù)為80 d；G639 最佳春化時間為60 d，抽薹開花率70%，可以正常開花授粉，春化+開花天數(shù)為85 d（表4）。

表4 冬春周期不同春化時間對甘藍開花的影響

2.3 甘藍一年繁殖兩代所需時長

由于秋季在綠體階段進行了加溫和補光處理，所以兩個周期中綠體生長所需時間無明顯差別。統(tǒng)計不同甘藍材料一年繁殖兩代需要的時長可知（表5），G158 夏秋周期完成世代需要186 d，冬春周期需要170 d，總計356 d，可以實現(xiàn)一年繁殖兩代；G639 夏秋周期完成世代需要190 d，冬春周期需要181 d，總計371 d，略長于1 年的時間，原因是G639 所需的春化時間和種子成熟時間都比較長。

表5 不同甘藍材料不同周期繁殖所需時間

2.4 利用SSR 標記選擇回交后代

27 對SSR 多態(tài)性引物在24 個不育系單株和2個保持系中共擴增得到63 個等位變異，每對引物產生2～5 個。27 對引物的多態(tài)性信息含量變化范圍為0.23～0.57，具有較好的鑒別能力，圖1 為部分引物的PCR 擴增結果。

圖1 部分引物對甘藍不育系的PCR 擴增結果

由圖2 可知，26 份材料被明顯分為兩個類群，類群Ⅰ中，G158MS-3 和G158MS-8 與G158 相應保持系的親緣關系最近；類群Ⅱ中，G639MS-6 和G639MS-7 與G639 相應保持系的親緣關系較近。所以，下一世代中可采用G158MS-3、G158MS-8 和G639MS-6、G639MS-7作為各自保持系的回交母本。

圖2 甘藍不育系與回交父本的聚類結果

3 討論與結論

甘藍通過春化的最適溫度為0～4 ℃，通過春化的時間因品種耐抽薹性不同而差異較大，一般為40～90 d，幼苗越大通過春化的時間越短（李文平，2010；王鳳嬌 等，2012）。本試驗中進行春化的溫度是4～7 ℃，并采用紅藍光比例為3∶1 的LED燈24 h 補光，除冬性強的甘藍材料外，基本都能在60 d 之內通過春化；春化時間對甘藍抽薹開花的影響要大于幼苗大小的影響，可能是因為在春化過程中進行了補光處理，幼苗處于持續(xù)生長的狀態(tài)，部分抵消了幼苗大小的影響程度。

為了縮短種子成熟所需要的時間，本試驗借鑒了胚挽救的方法。前人研究多將胚挽救應用于遠緣雜交獲得種間雜交種中（Zhang et al.，2004；Wen et al.，2008，于海龍，2015）；并且在遠緣雜交中，為了趕在胚珠敗育之前進行胚挽救，通常剝取胚珠的時間都比較早，一般在授粉后10～15 d，10 d 后有胚萌發(fā)，但成活率非常低（于海龍，2015；姜嬌，2018）。此類試驗中的胚挽救從萌發(fā)到成苗需要經(jīng)過愈傷階段，而從剝取胚珠到成苗所需要的時間未見報道。本試驗所用材料非遠緣雜交，胚珠在子房中不會敗育，為了提高胚珠的成活率，延長了取胚的時間，結果發(fā)現(xiàn)授粉后35 d 之前剝取的胚珠成活率很低，絕大部分敗育死亡，結合胚珠發(fā)芽率和縮短成苗時間兩項因素，最終確定合適的胚珠剝取時間為授粉后45～50 d。

應用本試驗方法，冬性不是很強的甘藍材料基本上可以實現(xiàn)1 年繁殖2 代，但是對于冬性強的甘藍材料還需要進一步探索可以縮短時間的步驟，比如采用更低的春化溫度、使用生長激素等來縮短春化時間，采用增加光照強度、延長光照時間等來縮短抽薹開花時間，采用更好的辦法縮短種子成熟所需的時間等。由于整個試驗過程中甘藍植株均處于幼苗期，不能進行成株期的性狀選擇，所以本試驗方法僅適用于甘藍雄性不育轉育，利用SSR 標記選擇時有明確的選擇方向，并不適用于一般材料的分離純化。如果有條件，可以通過增加標記甚至采取測序的方法對幼苗進行篩選，對某些需要加快純化的材料進行幼苗期的選擇，獲得所需要的特定材料。