梅 靜，喇宏玲，徐桂萍

隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步，越來越多老齡患者選擇手術(shù)治療。雖然不少老人原發(fā)疾病成功治愈，但術(shù)后認(rèn)知功能障礙發(fā)生率正不斷增加[1]。嚴(yán)重影響了老年患者生存狀態(tài)和生活質(zhì)量。丙泊酚是一種臨床常用的鎮(zhèn)靜、麻醉藥物，具有起效快、易于控制劑量、無明顯蓄積等優(yōu)點(diǎn)。但已有不少文獻(xiàn)[2-3]報(bào)道丙泊酚在老齡患者的應(yīng)用中常引起術(shù)后認(rèn)知功能障礙，其涉及機(jī)制主要為海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡。

神經(jīng)元凋亡是細(xì)胞程序性死亡方式，神經(jīng)元自噬是細(xì)胞自我分解代謝過程。凋亡與自噬信號調(diào)控之間存在復(fù)雜的交織，自噬過度激活或抑制都可能造成細(xì)胞凋亡[4]。已有研究[5-6]顯示，神經(jīng)元自噬與凋亡都分別參與了丙泊酚誘導(dǎo)的大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙的過程。因此，該研究探討自噬的激活與抑制對丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器丙泊酚乳狀注射液(100 mg/10 ml，批號：2019050901，西安立邦制藥有限公司)；丙泊酚原料藥(10 mmol/L，批號：HY-294057，純度≥99.0%，美國MCE公司)；雷帕霉素(10 mmol/L，批號：HY-3501-2196，純度≥99.0%，美國MCE公司)；氯喹(25 g，批號：018J5342，純度≥99.0%，美國Sigma公司)；PI/Annexin V染色試劑盒(美國Thermo公司)；TUNEL染色試劑盒(德國Roche公司)；鼠源單克隆Anti-mTOR抗體、兔源多克隆Anti-Beclin-1、鼠源單克隆Anti-Bcl-2抗體、兔源多克隆Anti-Bax(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；兔源單克隆重組Anti-LC3抗體、兔源單克隆重組Cleaved-caspase-3抗體(美國Abcam公司)；鼠源單克隆Anti-β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠/兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。流式細(xì)胞儀(型號：Cyto Flex，貝克曼庫爾特生命科學(xué)公司)；生物顯微鏡(型號：BX53，日本Olympus公司)；電子透射顯微鏡(型號：CX7 Pro，美國Thermo公司)；顯影儀(型號：5100R，上海天能生物技術(shù)公司)。

1.2 試驗(yàn)方案

1.2.1離體試驗(yàn) 取2×106個原代神經(jīng)元接種于96孔板中，分為對照組、丙泊酚組、雷帕霉素組、氯喹組。二甲氧唑黃比色法[2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide,XTT]檢測不同濃度丙泊酚對細(xì)胞活力的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測100 μmol/L雷帕霉素與20 μmol/L氯喹干預(yù)對丙泊酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的改善作用，Western blot檢測自噬與凋亡蛋白表達(dá)。

1.2.2在體試驗(yàn) 32只老齡大鼠，雄性，SPF級，12月齡，體質(zhì)量500～600 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物試驗(yàn)中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對照組、丙泊酚組、雷帕霉素組與氯喹組。取非對照組大鼠，腹腔注射丙泊酚乳狀注射液，劑量100 mg/kg，持續(xù)1周。大鼠麻醉期間，雷帕霉素組大鼠連續(xù)1周注射雷帕霉素，劑量50 mg/kg，氯喹組大鼠連續(xù)1周注射氯喹，劑量10 mg/kg。接下來，Morris水迷宮檢測大鼠認(rèn)知功能，TUNEL 染色檢測大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，電子透射顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量，Western blot檢測自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.3 原代神經(jīng)元提取與給藥取E16～18孕鼠，解剖后獲得胎鼠，解剖出完整大腦，分離去除軟膜、血管。取海馬組織，用眼科剪反復(fù)剪切成碎塊，消化，以培養(yǎng)基混懸，取40 μm篩網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液。離心收集沉淀，加入培養(yǎng)基，取6孔板每孔接種約1×107細(xì)胞。培養(yǎng)3～4 d后，0.25%胰酶消化后用于后續(xù)檢測。

1.4 XTT檢測取加藥處理完成的細(xì)胞，每孔加入100 μl 含PMS的XTT染色液，37 ℃避光孵育2 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度值(absorbance value, A)。細(xì)胞凋亡比例=(A對照孔-A試驗(yàn)孔)/(A對照孔-A背景孔)×100%

1.5 流式細(xì)胞術(shù)取加藥處理完成的細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS洗滌，加入PI與Annexin V染色液，避光孵育5 min。流式細(xì)胞儀檢測PI與Annexin V陽性細(xì)胞表達(dá)比例。

1.6 Morris水迷宮試驗(yàn)Morris水迷宮試驗(yàn)分為訓(xùn)練期與測試期。訓(xùn)練期將大鼠自各個象限依次放入水中，自由游泳尋找逃生平臺(位于第Ⅲ象限)，共90 s。若大鼠登上站臺，則記錄這段時間為逃避潛伏期。若大鼠90 s內(nèi)無法登上平臺則引導(dǎo)至平臺，記逃避潛伏期為90 s，連續(xù)訓(xùn)練4 d。第5天開展測試，撤去逃生平臺，將大鼠放入水中，自由探索90 s，記錄大鼠游泳速率，首次穿越逃生平臺象限時間，穿越逃生平臺次數(shù)及90 s內(nèi)在第Ⅲ象限中停留時間占比。

1.7 TUNEL 染色取大鼠心臟灌流，取腦組織，4%多聚甲醛固定，4 ℃儲存?zhèn)溆谩Ｈ∧X組織梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切成厚度3～5 μm切片，PBS清洗，加入含0.5% Triton X-100的PBS孵育5 min。取切片滴加蛋白酶K孵育15 min，PBS清洗。滴加TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃避光孵育60 min。PBS清洗，滴加streptavidin-HRP工作液，避光孵育30 min。PBS清洗，滴加DAB顯色液，室溫孵育3 min終止。生物顯微鏡下觀察，深棕色染色細(xì)胞為TUNEL陽性細(xì)胞。

1.8 高爾基染色取大鼠海馬組織，在齒狀回區(qū)截取約1 mm3組織，固定在預(yù)冷的2.5%戊二醛中，4 ℃儲存。次日，PBS洗滌，以預(yù)冷的1%鋨酸固定2 h，再以PBS洗滌，梯度丙酮脫水。以丙酮/環(huán)氧樹脂復(fù)合物浸透包埋組織，37 ℃下過夜。修塊后使用超薄切片機(jī)將組織切成60～80 nm超薄切片，最后應(yīng)用5%醋酸鈾浸潤0.5～1 h，枸櫞酸鉛染色5～10 min，雙蒸水清洗后封片。利用電子透射顯微鏡觀察各組細(xì)胞內(nèi)溶酶體與自噬小體數(shù)量。

1.9 Western blot收集細(xì)胞與大鼠腦組織樣本，勻漿后裂解收集蛋白，煮沸變性后冷凍保存。制備SDS-PAGE電泳凝膠，等量樣品上樣。電泳條件設(shè)為4 ℃、30 V / 30 min，100 V / 60 min，當(dāng)上樣緩沖液達(dá)到凝膠底部則終止。通過濕法將凝膠上目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件設(shè)為4 ℃、2 mA / 60 min。取PVDF膜放入封閉液中封閉2 h，4 ℃孵育一抗抗體稀釋液(1 μg/ml)過夜。次日PBST清洗條帶，以二抗稀釋液(0.5 μg/ml)室溫孵育2 h。PBST清洗PVDF膜，PVDF膜上滴加ECL超敏發(fā)光液，通過顯影儀顯影獲得目的蛋白發(fā)光條帶。

2 結(jié)果

2.1 自噬激活改善丙泊酚誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡隨著丙泊酚濃度增加，原代神經(jīng)元細(xì)胞活力不斷下降。由于丙泊酚濃度為50 μmol/L時，細(xì)胞活力降低至(82.85±2.97)%，而當(dāng)濃度達(dá)到100 μmol/L時，細(xì)胞活力降低至(65.94±3.36)%。本研究接下來細(xì)胞試驗(yàn)中選擇丙泊酚劑量為50 μmol/L。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，對照組神經(jīng)元Annexin V+/ PI+(Q1)區(qū)幾乎沒有凋亡細(xì)胞。在丙泊酚干預(yù)下，與對照組相比，神經(jīng)元Q1區(qū)凋亡細(xì)胞占比增加(P<0.001)。然而，在雷帕霉素干預(yù)下，Q1區(qū)凋亡細(xì)胞比例降低(P<0.001)。與此同時，氯喹干預(yù)雖然提高了丙泊酚誘導(dǎo)原代神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 原代神經(jīng)元中細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果A：XTT檢測不同濃度丙泊酚對原代神經(jīng)元的影響；B：Annexin V+/ PI+(Q1)區(qū)量化統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測自噬對丙泊酚誘導(dǎo)原代神經(jīng)元的影響；與對照組比較：###P<0.001；與丙泊酚組比較：***P<0.001

2.2 自噬激活減少了原代神經(jīng)元中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)與對照組相比，丙泊酚干預(yù)造成細(xì)胞凋亡，適應(yīng)性調(diào)節(jié)了自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，其中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ與Beclin-1表達(dá)增加(P<0.001)。但是，這無法逆轉(zhuǎn)丙泊酚造成的神經(jīng)元凋亡。因此，丙泊酚組中Cleaved-caspase-3、Bax表達(dá)增加(P<0.001)，且Bcl-2表達(dá)減少(P<0.001)。此外，與丙泊酚組相比，雷帕霉素干預(yù)進(jìn)一步提高了LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ (P<0.001)與Beclin-1表達(dá)(P<0.01)，且凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3、Bax表達(dá)減少(P<0.001)，且Bcl-2表達(dá)增加(P<0.01)。與此同時，丙泊酚、氯喹對p-mTOR蛋白表達(dá)的影響很小，且與丙泊酚組相比，氯喹的干預(yù)降低了LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ (P<0.05)與Beclin-1表達(dá)(P<0.001)，但對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)沒有影響。見圖2。

圖2 原代神經(jīng)元中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、p-mTOR、Beclin-1、Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)與對照組比較：##P<0.01, ###P<0.001；與丙泊酚組比較：*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

2.3 自噬激活改善丙泊酚誘導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙Morris水迷宮訓(xùn)練中，隨著大鼠訓(xùn)練次數(shù)增加，各組逃避潛伏期都出現(xiàn)了降低。自第3天起，與對照組相比，丙泊酚組大鼠逃避潛伏期增加(P<0.05)，且在第4天，與丙泊酚組相比，雷帕霉素組大鼠逃避潛伏期減少(P<0.05)。然而，與丙泊酚組相比，氯喹組大鼠逃避潛伏期相似。在測試中，各組大鼠游泳速率沒有改變，與對照組相比，丙泊酚組大鼠首次到達(dá)平臺時間增加(P<0.01)，在第Ⅲ象限停留時間(P<0.01)與穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)。與丙泊酚組相比，雷帕霉素組大鼠首次到達(dá)平臺時間減少(P<0.01)，且第Ⅲ象限停留時間占比增加(P<0.05)。與此同時，氯喹對大鼠水迷宮測試相關(guān)指標(biāo)沒有影響。見表1、2。

表1 各組大鼠水迷宮訓(xùn)練期間逃避潛伏期時長比較

表2 各組大鼠水迷宮測試期間游泳速率、首次到達(dá)平臺時間、第Ⅲ象限停留時間占比與穿越平臺次數(shù)比較

2.4 自噬激活的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞中自噬小體數(shù)量增加大鼠海馬神經(jīng)元高爾基染色顯示，與對照組相比，丙泊酚組中自噬小體數(shù)量沒有變化。與丙泊酚組相比，雷帕霉素組自噬小體數(shù)量增加，且氯喹組自噬小體數(shù)量減少。見圖3。

圖3 各組大鼠腦組織海馬神經(jīng)元中自噬小體數(shù)量 ×10 000A：對照組；B：丙泊酚組；C：雷帕霉素組；D：氯喹組；紅色箭頭：自噬小體

2.5 自噬激活改善丙泊酚誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡大鼠海馬神經(jīng)元TUNEL染色顯示，與對照組相比，丙泊酚組與氯喹組中TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)量增加(P<0.001)，與丙泊酚組相比，雷帕霉素組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.01)，且氯喹組陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元TUNEL染色與量化統(tǒng)計(jì) ×200A：對照組；B：丙泊酚組；C：雷帕霉素組；D：氯喹組；SO：定向?qū)?；SP：錐體層；SR：輻射層；與對照組比較：###P<0.001；與丙泊酚組比較：**P<0.01

2.6 自噬激活減少丙泊酚誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)與對照組相比，丙泊酚和氯喹對p-mTOR表達(dá)沒有影響，但雷帕霉素降低了p-mTOR表達(dá)水平(P<0.001)。與對照組相比，丙泊酚組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ與Beclin-1表達(dá)沒有變化，且丙泊酚組中Cleaved-caspase-3、Bax表達(dá)增加(P<0.001)，Bcl-2表達(dá)減少(P<0.001)。與丙泊酚組相比，雷帕霉素干預(yù)提高了LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ (P<0.001)與Beclin-1表達(dá)(P<0.01)，而凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3、Bax表達(dá)減少(P<0.001)，且Bcl-2表達(dá)增加(P<0.001)。此外，與丙泊酚組相比，氯喹干預(yù)后的細(xì)胞內(nèi)LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin-1與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)沒有改變。見圖5。

圖5 各組大鼠腦組織中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、p-mTOR、Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax 表達(dá)與對照組比較：###P<0.001；與丙泊酚組比較：**P<0.01, ***P<0.001

3 討論

術(shù)后認(rèn)知功能障礙是一種老齡患者常見的全麻手術(shù)并發(fā)癥，老齡患者中，全麻手術(shù)后1周內(nèi)術(shù)后認(rèn)知功能障礙發(fā)生率高達(dá)25%，部分患者癥狀會持續(xù)到術(shù)后3個月[7]。丙泊酚是一類臨床常用的麻醉誘導(dǎo)劑，具有誘導(dǎo)迅速、蘇醒迅速、劑量易控制且對血液循環(huán)影響低的優(yōu)點(diǎn)[8]。然而，不少研究[2-3]顯示丙泊酚會引起患者或試驗(yàn)動物認(rèn)知功能障礙。本研究以丙泊酚多次麻醉大鼠，通過Morris水迷宮分析大鼠認(rèn)知功能，評價大鼠行為學(xué)習(xí)與空間記憶能力。結(jié)果顯示，訓(xùn)練期間，丙泊酚組大鼠逃避潛伏期比對照組延長，且在第5天測試中，丙泊酚組大鼠在第Ⅲ象限停留時間占比與穿越平臺次數(shù)減少。因此，本研究中大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙模型構(gòu)建成功。與此同時，本研究顯示，自噬激動劑雷帕霉素治療后降低了丙泊酚麻醉小鼠逃避潛伏期。此外，相關(guān)研究[9-10]顯示丙泊酚可以通過減少氧化應(yīng)激反應(yīng)改善大鼠認(rèn)知功能，本研究與之相悖，其原因可能是文獻(xiàn)中丙泊酚作為治療藥物使用，劑量較低，發(fā)揮了中樞神經(jīng)保護(hù)作用。與本研究中低劑量丙泊酚正向調(diào)節(jié)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的結(jié)果相一致。

海馬是哺乳動物學(xué)習(xí)與記憶的重要區(qū)域，海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡是大鼠認(rèn)知功能損傷的主要原因[11]。Li et al[12]研究在20月齡老年大鼠中，以100 mg/kg丙泊酚麻醉誘導(dǎo)，再以50 mg/kg麻醉維持3 h，造成大鼠術(shù)后1～2周內(nèi)出現(xiàn)了明顯的認(rèn)知功能障礙。屠海軍 等[13]研究也有顯示，在2月齡成年大鼠中，300 mg/kg丙泊酚麻醉會降低大鼠海馬組織內(nèi)谷氨酸含量，并升高γ-氨基丁酸水平，導(dǎo)致大腦神經(jīng)元正常興奮難以維繼，最終造成神經(jīng)元凋亡，出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。這些研究證實(shí)了丙泊酚會損傷大鼠海馬神經(jīng)元。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚可使離體原代神經(jīng)元細(xì)胞活力降低。大鼠海馬神經(jīng)元中，TUNEL染色結(jié)果顯示，丙泊酚組大鼠海馬出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡。在此過程中，無論是離體原代神經(jīng)元還是海馬區(qū)神經(jīng)元，都伴隨著凋亡蛋白Cleaved-caspase-3與Bax表達(dá)增加，且抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少。然而，在自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素的干預(yù)下，凋亡蛋白Cleaved-caspase-3與Bax表達(dá)減少，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加。

自噬是通過形成自噬小體將細(xì)胞內(nèi)異常蛋白或受損細(xì)胞器包裹，與溶酶體融合，最終通過溶酶體將自噬底物降解，以獲得能量循環(huán)，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種生理活動。LC3本是自由散布于細(xì)胞質(zhì)中，在一系列酶促作用下定位于自噬體膜上，并向LC3 Ⅱ轉(zhuǎn)變，調(diào)節(jié)自噬小體的形成。由于LC3 Ⅱ是特異性分布的自噬體泡膜上的蛋白，所以LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ 比值可作為自噬體形成數(shù)量多少的指標(biāo)[14]。Beclin-1是自噬的正向調(diào)節(jié)因子，與Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)結(jié)合后可促進(jìn)自噬的發(fā)生[15]。雷帕霉素是一種自噬激動劑，通過抑制mTOR蛋白磷酸化誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[16]。而自噬抑制劑氯喹則是通過抑制PI3K表達(dá)，減少PI3K與Beclin-1形成復(fù)合物，從而阻斷自噬的發(fā)生[17]。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚雖然造成神經(jīng)元凋亡，但自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增加，這可能是機(jī)體出現(xiàn)損傷后的適應(yīng)性保護(hù)行為。雷帕霉素治療則誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ與Beclin-1表達(dá)增加，自噬小體數(shù)量增加，抑制了神經(jīng)元凋亡。然而，氯喹對丙泊酚誘導(dǎo)后神經(jīng)元凋亡沒有影響，甚至存在部分加劇的情況。這提示激活自噬都能夠有效減少神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，丙泊酚不僅誘導(dǎo)了神經(jīng)元凋亡，還啟動了機(jī)體代償性的自噬功能。雖然丙泊酚激活自噬的原因仍有待探討，但抑制mTOR信號則是激活自噬的最有效途徑。因此，以mTOR抑制劑雷帕霉素干預(yù)抑制了mTOR信號活化，提高了細(xì)胞自噬水平，并改善了神經(jīng)元凋亡。