薛黎萍，胡 敏，李亞娣，張曉帆，張潔瑩，周 園，梁佳芮，張傳宏，丁 鵬

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是最常見、最嚴(yán)重的糖尿病微毛細(xì)血管并發(fā)癥之一，DR的基本病理特征是新生血管的生成[1]。有研究[2]表明內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)代謝在血管生成中的關(guān)鍵作用，ECs的增殖和遷移依賴于糖酵解產(chǎn)生的能量，因此，抑制ECs中的糖酵解可能會抑制DR中新血管形成。丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2, PKM2)是糖酵解末端步驟的限速酶，它促進(jìn)磷酸烯醇式丙酮酸釋放能量，為細(xì)胞生長提供有利條件[3]。Liu et al[4]報道，高葡萄糖(high glucose，HG)可誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs)中PKM2表達(dá)增加，而抑制PKM2后可逆轉(zhuǎn)HG誘導(dǎo)的HRMECs損傷和凋亡。人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，GRg1)是人參中的一種主要皂苷，在糖尿病中具有抗血管生成和抗凋亡活性[5]，但在DR中，鮮有關(guān)于GRg1是否通過調(diào)控糖酵解過程影響血管形成的報道。因此，該研究旨在探討GRg1通過調(diào)控PKM2的表達(dá)對HRMECs糖酵解的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞HRMECs(上海澤葉生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol試劑、Western blot試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；Qiagen RNeasy mini 試劑盒(廣州健侖生物科技有限公司)；PrimeScript RT試劑盒(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司)；葡萄糖檢測試劑盒和ATP檢測試劑盒(生工生物工程股份有限公司)；乳酸含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)、血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)、成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor2，F(xiàn)GF2)和GAPDH(英國Abcam公司)；ECs專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HRMECs在含有5%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1%青霉素/鏈霉素和1% ECs生長因子的HRMECs特異性ECs培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換一次培養(yǎng)基。正常葡萄糖條件下的葡萄糖濃度為5 mmol/L，HG條件下的葡萄糖濃度為25 mmol/L，細(xì)胞在HG條件下培養(yǎng)48 h后加入10 μmol/L GRg1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明將陰性對照物(NC)、靶向PKM2的小干擾RNA(si-PKM2)和過表達(dá)PKM2(OE-PKM2)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HRMECs。

1.3 qRT-PCR檢測HRMECs中PKM2 mRNA的表達(dá)情況收集各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)PrimeScript RT試劑盒說明將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：ddH2O 7 μl，SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，cDNA 2 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，總體系共20 μl。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，然后3步反應(yīng)，95 ℃變性15 s，60 ℃ 退火30 s，共45個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 Western blot檢測HRMECs中相關(guān)蛋白表達(dá)量使用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，BCA蛋白檢測試劑盒分析蛋白質(zhì)濃度，然后加載到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳微型凝膠上并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液中封閉，并在4 ℃下加入提前稀釋好的一抗(VEGF，1 ∶10 000；Ang-1，1 ∶10 000；Ang-2，1 ∶5 000；FGF2，1 ∶1 000；GAPDH，1 ∶2 500)，室溫孵育2 h。然后在室溫下將膜與HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像分析，使用ImageJ軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的定量。

1.5 血管形成實(shí)驗檢測HRMECs血管形成能力將Matrigel(90 μl)涂到24孔板中，在37 ℃下硬化30 min，將HRMECs以每孔1.2×105個細(xì)胞的密度接種到Matrigel包被的孔頂部，于100%濕度、37 ℃、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，然后在倒置顯微鏡下觀察體外管腔生成結(jié)果并拍照，使用Image Pro Plus軟件分析計算視野內(nèi)Matrigel小管形成的數(shù)量，以此量化血管形成能力。

1.6 HRMECs中葡萄糖攝取量和乳酸產(chǎn)量收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清液，每組收集5×105個細(xì)胞，加入100 μl蒸餾水，超聲波破碎細(xì)胞(冰浴，功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次)，95 ℃水浴10 min，冷卻后，25 ℃、10 600 r/min離心10 min，取上清液備用；酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，按照試劑盒說明書加入各試劑，根據(jù)公式計算葡萄糖攝取量。同樣，按照乳酸含量檢測試劑盒說明書檢測乳酸產(chǎn)量。

1.7 HRMECs中ATP含量收集各組細(xì)胞，每組收集5×105個細(xì)胞，加入100 μl提取液，冰浴下超聲波破碎1 min，4 ℃、11 818 r/min離心10 min，取上清液至另一離心管，加入500 μl的氯仿充分震蕩混勻，4 ℃、11 818 r/min離心3 min，取上清液，置冰上待測。根據(jù)試劑盒說明加入反應(yīng)液，檢測酶標(biāo)儀340 nm波長處的光密度(optical density，OD)值，根據(jù)公式計算腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)含量。

2 結(jié)果

2.1 GRg1抑制HRMECs血管形成Western blot檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組細(xì)胞的VEGF、Ang-1、Ang-2、FGF2的表達(dá)水平增強(qiáng)，經(jīng)GRg1處理后，VEGF、Ang-1、Ang-2、FGF2的表達(dá)下降(P<0.05)，見圖1A；同時分析視野內(nèi)Matrigel小管形成的數(shù)量，結(jié)果顯示，與NC組細(xì)胞相比，HG組細(xì)胞血管形成數(shù)量增多(P<0.01)，而GRg1處理HG誘導(dǎo)的HRMECs后，其血管形成數(shù)量減少(P<0.05)，見圖1B。

圖1 GRg1抑制HRMECs血管形成A：GRg1處理后HRMECs的相關(guān)蛋白表達(dá)情況；B：GRg1處理后HRMECs的血管生成情況×200；與NC組比較：*P<0.05，**P<0.01；與HG組比較：△P<0.05

2.2 GRg1抑制HG誘導(dǎo)的HRMECs糖酵解在HG的處理下，HRMECs對葡萄糖的攝取量高于NC組(P<0.001)，其乳酸和ATP產(chǎn)量也高于NC組(P<0.001)；用GRg1處理HG組細(xì)胞后，與HG組相比，細(xì)胞對葡萄糖的攝取減少(P<0.01)，乳酸及ATP產(chǎn)量與HG組相比也降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 GRg1抑制HG誘導(dǎo)的HRMECs糖酵解A：GRg1處理后HRMECs的葡萄糖攝取量；B：GRg1處理后HRMECs的乳酸產(chǎn)量；C：GRg1處理后HRMECs的乳酸產(chǎn)量；與NC組比較：***P<0.001；與HG組比較：△△P<0.01

2.3 GRg1調(diào)控HRMECs中PKM2表達(dá)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，HG組細(xì)胞PKM2 mRNA的表達(dá)增加(P<0.001)，在GRg1處理后，PKM2 mRNA的表達(dá)有所下調(diào)(P<0.01)，見圖3A；Western blot檢測HRMECs中表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，PKM2在HG組中的表達(dá)高于NC組(P<0.01)，而經(jīng)GRg1處理后，其在HRMECs中的表達(dá)降低(P<0.05)，見圖3B。

圖3 GRg1調(diào)控HRMECs中表達(dá)A：GRg1處理對HRMECs中PKM2 mRNA表達(dá)的影響；B：Western blot檢測HRMECs中PKM2的表達(dá)；與NC組比較：**P<0.01，***P<0.001；與HG組比較：△P<0.05，△△P<0.01

2.4 GRg1通過調(diào)控PKM2的表達(dá)減少HRMECs糖酵解抑制血管形成qRT-PCR檢測si-PKM2和OE-PKM2的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-PKM2后，其表達(dá)量降低(P<0.001)，見圖4A。轉(zhuǎn)染OE-PKM2后，其表達(dá)量升高(P<0.001)，見圖4B。表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率佳。對每組細(xì)胞的糖酵解過程檢測發(fā)現(xiàn)，與HG+GRg1組相比，HG+GRg1+OE-PKM2組細(xì)胞的葡萄糖攝取量、乳酸和ATP產(chǎn)量均升高(P<0.05或P<0.01)，而HG+GRg1+si-PKM2組細(xì)胞的葡萄糖攝取量、乳酸和ATP產(chǎn)量均降低(P<0.01)，見圖4C-4E。檢測HRMECs中相關(guān)蛋白表達(dá)量，結(jié)果如圖4F，在HG+GRg1+OE-PKM2組細(xì)胞中，VEGF、Ang-1、Ang-2、FGF2的表達(dá)量高于HG+GRg1組(P<0.05)，HG+GRg1+si-PKM2組的蛋白表達(dá)量則降低(P<0.05或P<0.01)。最后，通過血管形成實(shí)驗進(jìn)一步驗證，HG+GRg1+OE-PKM2組細(xì)胞的血管生成數(shù)量多于HG+GRg1組(P<0.01)，而HG+GRg1+si-PKM2組的血管形成數(shù)量比HG+GRg1組減少(P<0.05)，見圖4G。

圖4 GRg1通過調(diào)控PKM2的表達(dá)減少HRMECs糖酵解抑制血管形成A：qRT-PCR檢測si-PKM2的轉(zhuǎn)染效率；B：qRT-PCR檢測OE-PKM2的轉(zhuǎn)染效率；C：各組HRMECs的葡萄糖攝取量；D：各組HRMECsHRMECs的乳酸生成量；E：各組HRMECs的ATP產(chǎn)量；F：各組HRMECs的蛋白表達(dá)；G：各組HRMECs的血管生成情況×200；a：NC組；b：HG組；c：HG+RGg1組；d：HG+RGg1+OE-PKM2組；e：HG+RGg1+si-PKM2組；與si-NC組比較：▲▲▲P<0.001；與OE-NC組比較：▼▼▼P<0.001；與NC組比較：**P<0.01，***P<0.001；與HG組比較：△P<0.05，△△P<0.01；與HG+RGg1組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

DR的發(fā)展與高血糖相關(guān)，長期的高血糖環(huán)境可損傷視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮，引起一系列眼底病變，如微血管瘤、新生血管、玻璃體增生甚至視網(wǎng)膜脫離[6]，視網(wǎng)膜新生血管被認(rèn)為是DR中不可逆失明的主要原因。通過對高糖誘導(dǎo)下的HRMECs進(jìn)行研究，可以發(fā)現(xiàn)HG環(huán)境可以誘導(dǎo)HRMECs的血管生成。

GRg1是人參中的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性[7]。Zhu et al[8]報道GRg1可以減輕HG誘導(dǎo)的人臍靜脈ECs屏障功能障礙；Ying et al[9]報道GRg1通過激活I(lǐng)RS-1/Akt/GSK3β信號傳導(dǎo)，保護(hù)過度磷酸化Tau誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)變性，阻止DR 的進(jìn)展。由此可知，GRg1可能在DR的血管病變中發(fā)揮作用。PKM2在所有核酸合成率高的細(xì)胞中均有表達(dá)，如胚胎細(xì)胞、正常增殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞[10]。PKM2的四聚體通常與正常細(xì)胞中ATP的產(chǎn)生和糖酵解中間體的分解代謝增加有關(guān)[11]。目前已有研究[12]表明PKM2在腫瘤發(fā)生和傷口愈合過程中具有調(diào)節(jié)血管生成的作用。此外，PKM2也已經(jīng)被證實(shí)參與調(diào)控DR中HRMECs的炎癥、凋亡和功能障礙[4]。本研究結(jié)果顯示，HG處理HRMECs后可上調(diào)PKM2表達(dá)，PKM2表達(dá)被抑制后可減少HG誘導(dǎo)的糖酵解和血管形成。GRg1可抑制HG誘導(dǎo)的PKM2表達(dá)升高，抑制PKM2誘導(dǎo)的糖酵解過程，進(jìn)而抑制HG誘導(dǎo)的血管形成。

DR的發(fā)病機(jī)制不僅受多種因素通過整合的分子信號通路和細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，ECs的葡萄糖代謝通過控制ECs增殖、遷移和新血管形成在DR的眼部新生血管疾病中也發(fā)揮重要作用[13]。Feng et al[14]的研究表明，通過在視網(wǎng)膜病變小鼠玻璃體內(nèi)注射PFKFB3的小干擾RNA可以減少糖酵解，并且抑制了脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜ECs新生血管形成。Pedro et al[15]發(fā)現(xiàn)糖原合成、戊糖循環(huán)和糖酵解途徑對VEGF和FGF刺激下的ECs增殖至關(guān)重要。由此可知，ECs糖酵解在DR新血管形成中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜ECs糖酵解途徑的分子或藥物對DR的治療有重要意義。對HRMECs的葡萄糖、乳酸和ATP生成量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在HG的影響下，三者的生成量均顯著升高，而在加入GRg1后，降低了葡萄糖、乳酸和ATP生成量；但如圖4內(nèi)容所示，HG+GRg1組導(dǎo)致的效應(yīng)改變應(yīng)該可以通過HG+GRg1+OE-PKM2組來逆轉(zhuǎn)，但本研究結(jié)果并未完全逆轉(zhuǎn)，因此GRg1對視網(wǎng)膜血管生成的影響是否仍有其他機(jī)制和分子參與還有待進(jìn)一步研究。