王 崇，蔡亦紅

剛地弓形蟲是一種頂復(fù)門胞內(nèi)寄生原蟲，具有廣泛的中間宿主(包括人類)，其終宿主為貓科動物，在世界各地約有三分之一的人口感染[1]，弓形蟲感染可對宿主腦部功能產(chǎn)生嚴(yán)重的不良影響，如神經(jīng)退行性疾病、弓形蟲腦炎和先天性弓形蟲腦病等[1-3]。海馬體對生命機(jī)體至關(guān)重要，其功能異常與癲癇發(fā)作[4]、精神分裂癥、阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)[5]、帕金森病[6]、抑郁癥[5]等多種疾病相關(guān)。小鼠慢性感染ME49蟲株模型初步形態(tài)學(xué)研究[7]顯示，海馬體中存在弓形蟲包囊，并伴有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生和壞死。因此，課題組選擇海馬體作為Chinese 1優(yōu)勢基因型蟲株導(dǎo)致的弓形蟲腦病伴精神障礙致病機(jī)制的研究靶點(diǎn)。該研究利用透射電鏡技術(shù)觀察弓形蟲Chinese 1優(yōu)勢基因型中TgCtwh3和TgCtwh6這兩種不同毒力蟲株對小鼠海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，有助于分析其致病機(jī)制，并為弓形蟲急性和慢性階段的腦損傷機(jī)制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蟲株 Chinese 1優(yōu)勢基因型蟲株(TgCtwh3、TgCtwh6)，前者為強(qiáng)毒株；后者為成囊株。兩種蟲株均在安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中通過小鼠體內(nèi)保種。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動物 18只6周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠(15～17 g，無特定病原體)購于杭州子源實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司(生產(chǎn)許可證號：SCXK2019-004)。實(shí)驗(yàn)動物按照安徽醫(yī)科大學(xué)《研究動物護(hù)理和使用指導(dǎo)原則》進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度保持在20～25 ℃，相對濕度為40%～70%。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)動物倫理委員會許可(No. AMU26-081108)。

1.1.3主要試劑和儀器 4%多聚甲醛通用型組織固定液、磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.3)購自Biosharp生物技術(shù)有限公司；用PBS配制的2.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定液購自上海麥克林生化科技有限公司；水合三氯乙醛購自上海麥克林生化科技有限公司。Leica EM UC7超薄切片機(jī)購自德國Leica公司；120 kV透射電鏡(Talo L120C G2)購自美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1蟲體獲取 抽取感染TgCtwh3蟲株的保種小鼠腹水，光鏡下觀察TgCtwh3蟲株速殖子運(yùn)動活躍，狀態(tài)良好；用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在400倍光鏡下計(jì)數(shù)，再以無菌PBS稀釋腹水直至含蟲密度為2×104個/ml。取TgCtwh6蟲株保種小鼠腦組織，用5 ml PBS通過200目無菌濾網(wǎng)對腦組織進(jìn)行研磨勻漿，在光鏡下觀察計(jì)數(shù)，再以無菌PBS稀釋勻漿直至含包囊密度為100個/ml。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及處理 將18只小鼠隨機(jī)均分為3組： 對照組、TgCtwh3感染組和TgCtwh6感染組。對照組：每只小鼠腹腔注射無菌PBS 0.2 ml。TgCtwh3感染組：每只小鼠腹腔注射4 000個速殖子[8]，飼養(yǎng)6 d，小鼠出現(xiàn)畏光、弓背豎毛、體質(zhì)量下降。TgCtwh6感染組：每只小鼠灌胃20個包囊[7-8]，飼養(yǎng)約1周，小鼠出現(xiàn)畏光、弓背豎毛、體質(zhì)量下降，繼續(xù)飼養(yǎng)5周，小鼠體質(zhì)量逐漸恢復(fù)，毛發(fā)恢復(fù)順滑。

1.2.3標(biāo)本的取材、制備和海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 小鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛溶液0.1 ml/20 g進(jìn)行麻醉；開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插入靜脈輸液針(0.45 mm×16RW SB)，然后剪開右心房，快速灌注PBS至心臟、肝臟等褪去血色，改灌注4%多聚甲醛通用型組織固定液，固定至小鼠全身僵直，取出腦組織，用PBS配制的2.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定液在4 ℃條件下預(yù)固定；于冰上鈍性剝離右側(cè)海馬體并置于載玻片上，在海馬體上滴加用PBS配制的2.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定液，取海馬體組織1 mm3，將海馬體置于含有1.3 ml PBS配制的2.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定液的1.5 ml EP管中，在4 ℃避光條件下繼續(xù)固定。按透射電鏡標(biāo)本要求常規(guī)制備樣品，Leica EM UC7超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在120 kV透射電鏡下觀察海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化并拍照。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察小鼠腦組織中的弓形蟲蟲體取TgCtwh3感染組和TgCtwh6感染組小鼠腦組織，勻漿后涂片，TgCtwh3感染組用吉姆薩染色后在光鏡下觀察(圖1A)，TgCtwh6感染組直接用光鏡觀察(圖1B)，可見兩組均可從小鼠腦組織中分離出蟲體。

圖1 TgCtwh3感染組和TgCtwh6感染組腦組織蟲體分離A：TgCtwh3感染組小鼠腦組織勻漿涂片光鏡圖 ×1 000；B：TgCtwh6感染組小鼠腦組織勻漿涂片光鏡圖 ×400；黑色三角箭頭：弓形蟲蟲體

2.2 對照組海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察對照組小鼠腦組織進(jìn)行電鏡標(biāo)本制備和觀察，結(jié)果顯示正常神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞膜和核膜完整，可見雙層膜，核呈卵圓形，核液中散在分布有常染色質(zhì)和異染色質(zhì)，密度較為均一，可見核仁(圖2A、2C)。核旁可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體基本正常；線粒體嵴清晰可見，雙層膜結(jié)構(gòu)完整(圖2B、2D)。

圖2 對照組的海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)A、C：對照組正常神經(jīng)細(xì)胞電鏡圖；B：圖A中的局部放大；D：圖C中的局部放大；N：細(xì)胞核；ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Mi：線粒體；藍(lán)色雙箭頭：細(xì)胞膜；黑色單箭頭：脂褐素

2.3 TgCtwh3感染組海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)TgCtwh3感染組小鼠腦組織進(jìn)行電鏡標(biāo)本制備和觀察，細(xì)胞發(fā)生核皺縮壞死(圖3A、3D)。圖3A中細(xì)胞核居中，核呈不規(guī)則狀，核膜不完整，細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器少，細(xì)胞邊界不清楚，樹突和胞質(zhì)空泡化。圖3B中細(xì)胞外出現(xiàn)淺亮空泡。圖3C可見軸索斷裂。圖3D中細(xì)胞的核質(zhì)比小于1/4，核皺縮，核雙層膜結(jié)構(gòu)模糊不清；胞質(zhì)腫脹且電子密度低，大量細(xì)胞器消失，僅可見一些線粒體結(jié)構(gòu)。

圖3 TgCtwh3感染組的海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)A-D：TgCtwh3感染組海馬體細(xì)胞電鏡圖；N：細(xì)胞核；黑色雙箭頭：細(xì)胞核異常；橙色單箭頭：胞質(zhì)腫脹；藍(lán)色單箭頭：髓鞘斷裂

2.4 TgCtwh6感染組海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖4A中細(xì)胞核呈卵圓形，核仁大而明顯，位置居中，核膜完整，細(xì)胞核基本正常；細(xì)胞器豐富，胞質(zhì)中可見溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等；胞質(zhì)中有多處脂褐素沉積；部分線粒體出現(xiàn)嵴斷裂消失；高爾基體出現(xiàn)輕微擴(kuò)張。圖4C中線粒體出現(xiàn)嵴斷裂消失；高爾基體出現(xiàn)輕微擴(kuò)張；胞質(zhì)中顆粒物較多。圖4D可見胞質(zhì)中顆粒物較多；線粒體出現(xiàn)腫脹，嵴斷裂消失，線粒體膜破裂；胞外出現(xiàn)空泡。圖4E中細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整；胞質(zhì)中可見髓樣小體、脂褐素、線粒體；線粒體出現(xiàn)嵴斷裂消失和膜破裂。圖4F中線粒體嵴消失，可見自噬小體(標(biāo)尺:1 μm)

圖4 TgCtwh6感染組的海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)A-F：TgCtwh6感染組海馬體細(xì)胞電鏡圖；B：圖A的局部放大；N：細(xì)胞核；Ly：溶酶體；白色單箭頭：線粒體損傷；白色雙箭頭：高爾基體擴(kuò)張；橙色單箭頭：胞質(zhì)腫脹；黑色單箭頭：脂褐素；紅色單箭頭：自噬小體；紅色雙箭頭：髓樣小體

2.5 三組海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)表型匯總?cè)绫?所示：與TgCtwh6感染組相比，TgCtwh3感染組海馬體細(xì)胞形態(tài)改變更加嚴(yán)重，如核皺縮、細(xì)胞器消失、樹突和胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞壞死等，這些病理改變多為不可恢復(fù)的。而TgCtwh6感染組更多的出現(xiàn)線粒體嵴斷裂溶解、高爾基體輕微擴(kuò)張等可逆轉(zhuǎn)的病理改變，以及溶酶體殘?bào)w沉積等累積性的形態(tài)學(xué)變化。

表1 三組海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變匯總(例，n=6)

3 討論

近年來，世界各地人和動物體內(nèi)分離蟲株的基因分型結(jié)果顯示，世界各地弓形蟲具有豐富的遺傳多樣性[9]。本課題組分離到來自我國多個省份的51株貓?jiān)葱院腿嗽葱怨蜗x蟲株，基因分析發(fā)現(xiàn)不同于歐美地區(qū)原型克隆譜系，結(jié)合國內(nèi)其他學(xué)者對動物源蟲株的分析結(jié)果，命名為Chinese 1型(即ToxoDB#9)。該基因型包含同一基因型、毒力不同的蟲株[10]。TgCtwh3蟲株(強(qiáng)毒株)對于小鼠的毒力介于Ⅰ型和Ⅱ型之間；TgCtwh6蟲株(弱毒株)毒力與Ⅱ型相仿，能在腦組織中形成包囊，具有與TgCtwh3相似的宿主細(xì)胞侵入能力，但復(fù)制率低于TgCtwh3蟲株[11]。兩種相同基因型毒力不同的蟲株所造成的機(jī)體損傷存在差異，如對于不良妊娠機(jī)制的誘導(dǎo)，然而其腦損傷的機(jī)制仍不清楚，但是根據(jù)TgCtwh3和TgCtwh6的表型特征，推測這兩種蟲株具有迥異的致病機(jī)制[11]。弓形蟲對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響在超微水平的研究還未見報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)利用透射電鏡技術(shù)觀察TgCtwh3和TgCtwh6這兩種蟲株感染對海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，為兩種蟲株的腦損傷機(jī)制研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，TgCtwh3和TgCtwh6對小鼠海馬體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響不盡相同。TgCtwh3感染組細(xì)胞出現(xiàn)核皺縮壞死、軸突空泡化、細(xì)胞器消失等一系列不可恢復(fù)的病理變化；此外可觀察到明顯的軸索斷裂，由于軸索恢復(fù)能力較差，其斷裂將影響細(xì)胞的興奮傳遞功能。TgCtwh3蟲株的急性感染使海馬體細(xì)胞發(fā)生壞死、溶酶體裂解和細(xì)胞自溶，因此壞死細(xì)胞中大量細(xì)胞器消失，軸突和胞質(zhì)空泡化，同時，壞死細(xì)胞內(nèi)容物的外溢將進(jìn)一步促進(jìn)壞死的發(fā)生和實(shí)質(zhì)細(xì)胞溶解，給海馬體細(xì)胞帶來不可逆?zhèn)Α：ｑR體細(xì)胞的損傷將對機(jī)體的認(rèn)知能力、學(xué)習(xí)能力以及情感控制產(chǎn)生不良影響，有利于癲癇和精神分裂癥等疾病的發(fā)展[4]。而免疫低下患者的弓形蟲急性發(fā)作期間可觀察到意識障礙和癲癇發(fā)作，提示海馬體細(xì)胞壞死可能是TgCtwh3蟲株急性感染階段的致病機(jī)制之一。

相較之下，TgCtwh6感染組對于腦組織海馬體細(xì)胞的影響多表現(xiàn)為慢性的累積性損傷。TgCtwh6感染組小鼠海馬體細(xì)胞出現(xiàn)了線粒體嵴斷裂、高爾基體輕微擴(kuò)張等可逆性改變，胞質(zhì)中存在脂褐素、髓樣小體和自噬溶酶體等，表明細(xì)胞在TgCtwh6包囊存在下一直存在慢性損傷和自我修復(fù)。TgCtwh6感染組細(xì)胞中脂褐素的累積會導(dǎo)致細(xì)胞代謝緩慢，活性下降，常常在神經(jīng)退變以及衰老機(jī)體中出現(xiàn)，可造成多種不良影響，如記憶力下降、睡眠質(zhì)量下降等。比較不同感染組整體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的超微變化顯示，TgCtwh6感染組對于線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響尤為明顯。線粒體是細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵細(xì)胞器，是細(xì)胞的能量中心，不僅涉及細(xì)胞的代謝狀態(tài)，還涉及多種細(xì)胞功能，如增殖、鈣信號、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、活性氧產(chǎn)生和凋亡等[12]。與疾病相關(guān)的一般線粒體異常包括線粒體電子傳輸鏈損傷、線粒體形態(tài)和動力學(xué)的改變、mtDNA突變和鈣平衡異常。在TgCtwh6感染組中，細(xì)胞中可觀察到大量的線粒體腫脹，嵴斷裂消失，線粒體膜破裂等線粒體損傷。線粒體膜破裂使得線粒體中的mtDNA 和活性氧泄漏到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的mtDNA可以激活各種炎癥通路[13]，包括cGAS-STING信號、NLRP3 和炎性小體等，導(dǎo)致炎癥激活；此外，線粒體活性氧釋放到胞質(zhì)中可導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷。線粒體腫脹，嵴斷裂消失將影響其功能的發(fā)揮，其功能障礙會導(dǎo)致一系列疾病，特別是影響神經(jīng)系統(tǒng)[14]。同時，在神經(jīng)退行性疾病又會嚴(yán)重影響線粒體動力學(xué)，線粒體功能障礙與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相輔相成。綜上，TgCtwh6潛伏感染與一些神經(jīng)和精神疾病相關(guān)的致病原因可能為海馬體細(xì)胞的線粒體損傷、脂褐素累積以及慢性炎癥。另外，近年來有研究[15]證明，線粒體功能異常是鐵死亡的主要機(jī)制之一，而鐵死亡參與多種神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)程。這再次印證線粒體功能在退行性疾病中的關(guān)鍵作用，也為研究弓形蟲腦病致病機(jī)制研究提供新的思路。

本研究利用透射電鏡技術(shù)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，探討弓形蟲感染對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響及其規(guī)律，結(jié)果表明我國優(yōu)勢基因型蟲株TgCtwh3和TgCtwh6對于小鼠海馬體細(xì)胞的主要損傷機(jī)制不同，為研究TgCtwh3和TgCtwh6蟲株感染所致腦損傷機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為急性和慢性弓形蟲感染的腦損傷機(jī)制研究提供線索。