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SECTM1表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系及對細胞功能的影響

2022-11-03 05:45林穎倪樂藝余河杰胡婷婷蔡振寨林李淼
關(guān)鍵詞:細胞系細胞周期腫瘤

林穎,倪樂藝,余河杰,胡婷婷,蔡振寨,林李淼

1.臺州市第一人民醫(yī)院 消化內(nèi)科,浙江 臺州 318020;2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 消化內(nèi)科,浙江 溫州 325088;3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科,浙江 溫州 325015

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是最常見的實體瘤之一。根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計報告,肺癌和乳腺癌是最常見的癌癥(11.6%),其次是CRC(10.2%),而病死率最高的癌癥是肺癌(18.4%)、CRC(9.2%)和胃癌(8.2%)[1]。WHO估計,到2030年,新診斷的CRC病例和與CRC相關(guān)的死亡人數(shù)將分別增加到77%和80%[2]。目前,手術(shù)聯(lián)合術(shù)后化療被認(rèn)為是CRC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。然而,不良反應(yīng)和耐藥性限制了CRC患者化療的使用[3-4]。癌基因的激活或抑癌基因的失活引發(fā)或加速惡性腫瘤的進程[5]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展,CRC的靶向藥物治療越來越受到研究者的關(guān)注[6-7]。然而,到目前為止,尚未在CRC中發(fā)現(xiàn)成熟、明確的分子機制或預(yù)后指標(biāo)。

K12基因位于染色體17q25上CD7基因上游,經(jīng)人類基因圖譜研討會(Human Gene Mapping Workshops, HGMW)批準(zhǔn)命名為分泌型跨膜蛋白1(secreted and transmembrane 1, SECTM1)[8-10]。該基因全長14 kb,編碼在外周血白細胞和乳腺癌細胞系中檢測到的最顯著的1.8 kb mRNA[10]。轉(zhuǎn)染SECTM1基因的細胞表面可以檢測到SECTM1,未轉(zhuǎn)染的細胞中尚未發(fā)現(xiàn)[10-11]。SECTM1是一種廣泛表達的INF誘導(dǎo)分子,作為T細胞激活的有效共刺激配體,與抗CD28抗體協(xié)同作用[12]。例如,SECTM1可作為T細胞的共刺激因子,受干擾素α(interferon-α,IFN-α)和IFN-γ的調(diào)控,在黑色素瘤細胞中表達顯著上調(diào)[12]。SECTM1也與腫瘤進展和轉(zhuǎn)移有關(guān),在乳腺癌、前列腺癌細胞系和部分髓系白血病細胞中高表達[10-12]。然而,SECTM1表達在CRC中的生物學(xué)意義尚不清楚。本研究擬分析SECTM1表達與CRC的相關(guān)性以及SECTM1的生物學(xué)功能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料和儀器:CEA-RIA試劑盒購自上海起發(fā)實驗試劑有限公司;抗SECTM1抗體(AB106377)購自美國Abcam公司;山羊抗兔IgG、3,5-二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)購自北京中山生物有限公司;6種人CRC細胞系(HCT116、RKO、Caco-2、HT-29、DLD-1和HCT-8)和正常人結(jié)腸上皮細胞系(NCM460)購自中國科學(xué)院上海細胞庫;RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher Scientific公司;10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國Atlanta Biologicals Lawrenceville公司;GV367慢病毒載體購自上海吉凱基因化工科技有限公司;特異性慢病毒和陰性對照(negative control, NC)慢病毒包裝質(zhì)粒購自上海捷恩生物科技有限公司;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司;TRIzol購自上海普菲生物科技有限公司;Promega M-MLV試劑盒購自北京普羅梅加生物有限公司;SYBR Master Mixture購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;qRTPCR儀購自上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司;Western blot曝光儀購自廣州博鷺騰生物科技有限公司;流式細胞儀分析購自北京安諾倫生物科技有限公司。

1.1.2 臨床資料:收集2011年至2017年溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院370份CRC和癌旁組織樣本。納入標(biāo)準(zhǔn):均接受手術(shù),經(jīng)活檢及病理診斷CRC。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前接受化療和放療或患有其他相關(guān)腫瘤的患者。腫瘤分期按照美國癌癥聯(lián)合委員會/國際抗癌聯(lián)盟(2016)共同發(fā)布的腫瘤TNM分期第8版。組織學(xué)分級由2名病理科醫(yī)師分別根據(jù)WHO分級標(biāo)準(zhǔn)確定。CEA水平采用放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)測定,使用CEA-RIA試劑盒。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(LCKY2019-223)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)分析:采用免疫組織化學(xué)檢測CRC及癌旁組織中SECTM1的表達。將石蠟包埋切片在二甲苯中脫蠟,并在乙醇溶液中水化。切片在室溫下用過氧化氫浸泡,清水沖洗后,浸入枸櫞酸鹽緩沖液中,然后在正常山羊血清中浸泡30 min。最后,將切片與抗SECTM1抗體(稀釋1∶20 000)在濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,然后加入山羊抗兔IgG在室溫下培養(yǎng)30 min。使用3,5-DAB進行檢測,并用蘇木精對切片進行復(fù)染。2名病理科醫(yī)師獨立分析結(jié)果。如果結(jié)果不一致,則使用雙頭顯微鏡重新評估,以獲得最終結(jié)果。SECTM1蛋白表達的組織化學(xué)評估包括染色強度(無染色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕色為3分)和陽性細胞百分比(<5%陽性CRC細胞為0分,5%~25%為1分,>25%~50%為2分,>50%~75%為3分,>75%為4分)。將染色強度和百分比評分相加,0~3分為陰性表達,4~7分為陽性表達。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和細胞系構(gòu)建:選取6種人CRC細胞系(HCT116、RKO、Caco-2、HT-29、DLD-1和HCT-8)和正常人結(jié)腸上皮細胞系(NCM460),均接種于RPMI1640和FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用AgeI/NheI酶切SECTM1序列(NM_003004),并克隆到GV367慢病毒載體中感染HCT116 CRC細胞系。將HCT116細胞系分2組,第1組為SECTM1過表達(overexpression,OE)組(OE組),第2組未處理為正常對照組(NC組)。根據(jù)制造商的說明,使用Lipofectamine 2000將siRNA-SECTM1(CACCAGAGAAATAACAGACAA)和siRNANC(TTCTCCGAACGTGTCACGT)轉(zhuǎn)染DLD-1細胞系。將DLD-1細胞系分3組,其中敲除組(knocked down,KD)分為2組分別為KD1組和KD2組,1組為NC組。熒光顯微鏡(Olympus-BX53)用于確認(rèn)是否轉(zhuǎn)染了靶細胞,確保感染率約80%。

1.2.3 qRT-PCR:根據(jù)試劑盒的說明,使用TRIzol從CRC細胞系中提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。GAPDH作為內(nèi)參。SECTM1目的基因序列引物為5’-GTC ACTGCTGTCTTCATCCTCT-3’和5’-GACCTTCATCTGGGGTTC TAG-3’,擴增片段大小為117 bp。采用SYBR Master Mixture和qRT-PCR儀進行實時定量PCR。相對轉(zhuǎn)錄水平通過2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 Western blot實驗:從細胞中分離蛋白質(zhì),并進行蛋白質(zhì)濃度測定。蛋白質(zhì)樣品加到凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉封閉30 min。一抗4 ℃孵育過夜。洗去多余一抗后,將PVDF膜浸泡于HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)中,37 ℃搖床孵育2 h。洗去二抗后顯色曝光。

1.2.5 細胞增殖實驗:細胞培養(yǎng)1~5 d,每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2~4 h。用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)讀板儀測定450 nm處的吸光度,以反映細胞增殖情況。

1.2.6 細胞凋亡實驗:用胰酶消化并收集細胞。在黑暗中加入10 μL膜聯(lián)蛋白V-APC。在測試前5 min加入碘化丙啶(propidium iodide, PI)。采用流式細胞儀分析細胞凋亡。膜聯(lián)蛋白V-APC陽性細胞被認(rèn)為是凋亡細胞。

1.2.7 細胞周期實驗:用胰酶消化并收集細胞。處理后,將細胞固定在4 ℃預(yù)冷的乙醇中至少1 h。加入一定體積的細胞染色液和RNA酶。采用流式細胞儀檢測PI濃度,反映各期細胞的DNA分布情況,并計算各期細胞的百分比。

1.2.8 侵襲小室實驗:在內(nèi)室和外室之間覆蓋基底膜。將面向內(nèi)室的基底膜置于外室,向外室添加趨化劑。在趨化劑的誘導(dǎo)下,細胞開始穿透基底膜。培養(yǎng)48 h后,用棉簽去除小室的非侵入性細胞,在膜的下表面滴入2~3滴Giemsa染色液染色轉(zhuǎn)移細胞并固定3~5 min。將細胞浸泡、洗滌多次,風(fēng)干,顯微鏡成像,進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS22.0進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用±s表示,2組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料用頻數(shù)表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織中SECTM1的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系 免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示,370例CRC組織樣本中,有277例SECTM1高表達(277/370,74.86%),高于配對癌旁組織(93/370,25.14%),見圖1。此外,SECTM1的表達與CRC分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),而與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、UICC分期和CEA水平無關(guān)(P>0.05),見表1。

圖1 免疫組織化學(xué)染色法檢測CRC組織和配對癌旁組織中SECTM1的表達(×400)

表1 CRC患者SECTM1表達與臨床病理特征的關(guān)系(n=370,例)

2.2 慢病毒介導(dǎo)的CRC細胞中SECTM1 mRNA過表達或下調(diào) 采用qRT-PCR法檢測6種CRC細胞系(HCT116、HT29、Caco-2、RKO、DLD-1和HCT-8)和正常人結(jié)腸上皮細胞系(NCW460)中SECTM1 mRNA的相對表達情況。qRT-PCR結(jié)果顯示,HCT116細胞系中SECTM1低表達,DLD-1細胞系中SECTM1高表達,我們選擇以上2種細胞系進行下一步實驗。設(shè)計siRNASECTM1和過表達SECTM1的慢病毒,然后轉(zhuǎn)染到CRC細胞中。根據(jù)熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn),慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染HCT116細胞系(見圖2a)和DLD-1細胞系(見圖2b)。在慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后,相對于NC組,OE組HCT116細胞中SECTM1表達顯著上調(diào)(P<0.05),見圖2c。同樣,相對于NC組,KD1組和KD2組DLD-1細胞SECTM1的表達下調(diào)(P<0.05),見圖2d。

圖2 慢病毒介導(dǎo)的SECTM1過表達或敲除

2.3 慢病毒介導(dǎo)的CRC細胞中SECTM1蛋白表達

Western blot檢測結(jié)果表明,在慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后,與NC組比,OE組HCT116細胞系中SECTM1蛋白表達上調(diào)(P<0.01),KD組DLD-1細胞系中SECTM1的蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.01),見圖3。

圖3 SECTM1蛋白在HCT116細胞系和DLD1細胞系中的表達

2.4 SECTM1對CRC細胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染5 d后,CCK-8檢測結(jié)果表明,與NC組相比,OE組HCT116細胞增殖能力增強(P<0.05),表明該基因過表達促進細胞增殖;與NC組相比,KD組DLD-1細胞的增殖能力顯著降低(P<0.05),說明敲除該基因可以抑制細胞增殖。見圖4。

圖4 SECTM1對CRC細胞增殖的影響

2.5 SECTM1對CRC細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示,與NC組比,OE組HCT116細胞的凋亡率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);KD組DLD-1細胞凋亡率升高(P<0.01)。這些結(jié)果表明敲除SECTM1可促進細胞凋亡。見圖5。

圖5 SECTM1對CRC細胞凋亡的影響

2.6 SECTM1對CRC細胞周期的影響 為了驗證靶基因?qū)毎芷诘挠绊?,在轉(zhuǎn)染后第6天使用流式細胞術(shù)檢測PI熒光強度,該熒光強度直接反映DNA在細胞不同階段的分布情況。結(jié)果表明,與NC組比,OE組HCT116細胞G1期細胞的比例顯著下降,S期細胞比例和G2/M期的比例增加(P<0.05),見圖6a、圖6b,這表明細胞周期進程加快。與NC組比,KD組DLD-1細胞G1期細胞比例顯著增加(P<0.05),而S期和G2/M期的細胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖6c、圖6d,這表明,SECTM1基因敲除導(dǎo)致細胞周期停滯在G1期。

圖6 SECTM1對CRC細胞周期的影響

2.7 SECTM1對CRC細胞侵襲的影響 轉(zhuǎn)染48 h后,侵襲小室實驗結(jié)果表明,相對于NC組,OE組HCT116細胞每個區(qū)域的侵襲細胞數(shù)增加(P<0.01),這表明,SECTM1的過度表達增強了細胞入侵。相對于NC組,KD組DLD-1細胞每個區(qū)域的侵襲細胞數(shù)減少(P<0.01),表明SECTM1下調(diào)抑制細胞侵襲。見圖7。

圖7 SECTM1對CRC細胞侵襲的影響(×200)

3 討論

SECTM1以一種可溶性跨膜蛋白形式存在于高爾基體中,與受體CD7結(jié)合誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細胞產(chǎn)生IFN,并激活抗原提呈細胞(antigen-presenting cell, APCs),在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[12]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)SECTM1在CRC中高表達,這與乳腺癌[10]和黑色素瘤[13]中觀察到的結(jié)果相似,提示SECTM1可能參與癌癥的發(fā)生。本研究進一步分析了SECTM1在CRC組織中的表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)SECTM1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CRC分化程度有關(guān)。KAMATA等[14]認(rèn)為SECTM1是一種上皮產(chǎn)物;然而,他們沒有提到成熟的腺上皮細胞中是否有一種物質(zhì)可以促進SECTM1的高表達。許多研究稱,SECTM1能促進免疫細胞的增殖,如T細胞與CD28的結(jié)合[11-12],因此SECTM1與細胞免疫有關(guān),是編碼與免疫信號通路相關(guān)的基因[15]。然而,還需要進一步的研究來驗證。

我們進一步分析SECTM1對CRC細胞的影響后發(fā)現(xiàn),與NC組相比,上調(diào)SECTM1后CRC細胞的生存能力和侵襲能力明顯增強,細胞周期加快,凋亡減少;下調(diào)SECTM1的表達則相反。WANG等[16]表明在黑色素瘤細胞系WM3899中SECTM1的過表達顯著增加了細胞侵襲,并促進了腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。在黑色素瘤細胞系WM9中降低SECTM1的表達,可以抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,這與我們的結(jié)果一致。然而,涉及SECTM1的致癌機制可能有不同的聲音:它部分依賴于CD7介導(dǎo)通路的激活來吸引單核細胞改變微環(huán)境[13];另一部分依賴于調(diào)節(jié)因子的表達,如SECTM1上調(diào)整合素β3的表達,從而促進其自身在黑素瘤中的表達[15]。SECTM1在癌癥患者中似乎沒有體細胞突變[17],但在癌癥[18]和其他疾病如腸易激綜合征[19]和黑素瘤[20]中經(jīng)常過表達,強調(diào)了對SECTM1基因表達的操縱也可能在癌細胞和腸黏膜上皮屏障細胞的免疫耐受中發(fā)揮作用?;蛘呤峭ㄟ^與CD4+T、CD8+T、抗原呈遞細胞等免疫相關(guān)細胞的相互作用,SECTM1可以削弱機體的免疫防御,促進腫瘤細胞的侵襲和遷移,引起淋巴轉(zhuǎn)移。因此,SECTM1的表達可能是先天免疫反應(yīng)和癌細胞免疫耐受的關(guān)鍵因素[21]。

本研究有一些局限性,需要在動物實驗中進一步證實。本研究也沒有探討SECTM1在CRC中的致癌機制。GU等[22]利用腫瘤基因組中的基因表達數(shù)據(jù)篩選出免疫相關(guān)預(yù)后基因SECTM1。下一步的研究方向是研究SECTM1對CRC微環(huán)境的免疫相關(guān)作用,明確免疫相關(guān)通路、上下游因素。進一步研究SECTM1靶向藥物通過共抑制或共刺激信號等一系列途徑調(diào)控免疫細胞活性,從而殺死腫瘤細胞的治療方法。

綜上所述,本研究結(jié)果表明SECTM1是一個潛在的治療靶點,為未來CRC的靶向治療提供了重要的線索。

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