曾婧欣，蘇舒文，冼高鵬，曾慶春，許頂立

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科器官衰竭防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510515

鈣化性主動脈瓣疾?。–AVD）是如今發(fā)病率最高的心臟瓣膜疾病，并隨人口老齡化進(jìn)展持續(xù)升高［1,2］。鈣化性主動脈瓣膜病是一種與年齡有關(guān)的非感染性退行性病變，病程初期主要表現(xiàn)為主動脈瓣硬化，即主動脈瓣膜的纖維化增厚伴輕度鈣化，無明顯的血流動力學(xué)改變及臨床表現(xiàn)。病程后期瓣膜鈣化加重，瓣口面積減小，導(dǎo)致明顯的主動脈狹窄，主動脈與左心室之間收縮期的壓力階差明顯，主動脈峰值流速升高，且大多數(shù)退行性病變造成主動脈瓣狹窄的患者同時(shí)具有主動脈關(guān)閉不全的臨床表現(xiàn)［3］，主要可能因?yàn)榘昴も}化造成瓣膜功能不全，無法正常關(guān)閉，表現(xiàn)為主動脈瓣處出現(xiàn)返流，左室射血時(shí)間延長、左室舒張末壓進(jìn)行性升高，臨床癥狀表現(xiàn)為勞力性呼吸困難、胸痛甚至心力衰竭［4］。由于鈣化性主動脈瓣疾病目前尚無有效藥物治療，出現(xiàn)癥狀后主要靠手術(shù)或介入治療更換主動脈瓣膜作為治療手段［5］，因此尋找可以模擬鈣化性主動脈瓣疾病發(fā)病過程的動物模型并從中探討其發(fā)病機(jī)制、尋找可能具有緩解甚至治療的手段是研究這一疾病的重要手段［6］。

目前模擬鈣化性主動脈瓣模病發(fā)病機(jī)制的小鼠模型主要包括高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠、高脂喂養(yǎng)LDLR-/-小鼠、老年鼠、基因編輯鼠、機(jī)械損傷模型等［7-9］。但高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠、高脂喂養(yǎng)LDLR-/-小鼠存在血脂譜與鈣化性主動脈瓣膜病患者差別大、價(jià)格昂貴等問題［10-12］，且臨床試驗(yàn)表明他汀類藥物雖然可以改善動脈粥樣硬化預(yù)后，但不能逆轉(zhuǎn)或治療鈣化性主動脈瓣膜病；老年鼠存在喂養(yǎng)需1～1.5年，購買費(fèi)用昂貴等問題［13］；基因編輯鼠存在價(jià)格昂貴、造模時(shí)間長、單獨(dú)的基因編輯并不能完全代表鈣化性主動脈瓣膜疾病病理生理過程等問題［14,15］。因此，尋找一種相對短時(shí)間內(nèi)造成主動脈瓣鈣化的動物模型尤為重要。

研究證明，在主動脈瓣不斷開合的過程中，血流動力學(xué)應(yīng)力引起的機(jī)械損傷是主動脈瓣鈣化的重要危險(xiǎn)因素之一［16,17］。Honda等［18］構(gòu)建了一種通過向小鼠右頸總動脈插入導(dǎo)管，在超聲引導(dǎo)下用其中的導(dǎo)絲損傷主動脈瓣膜造成小鼠主動脈瓣增厚與鈣化，用于模擬鈣化性主動脈瓣膜病患者疾病發(fā)生發(fā)展的動物模型。他們發(fā)現(xiàn)小鼠在造模16后出現(xiàn)主動脈峰值流速明顯升高，瓣膜明顯增厚，相關(guān)炎癥因子、成骨因子、細(xì)胞衰老蛋白表達(dá)明顯升高，鈣鹽沉積及鈣結(jié)節(jié)明顯增多的現(xiàn)象，與鈣化性主動脈瓣膜病患者的心功能改變以及主動脈瓣膜鈣化過程較為重合。但該模型同樣存在造模時(shí)間長的問題（16周），且Honda等的結(jié)果顯示，小鼠主動脈瓣膜在損傷1周后即出現(xiàn)炎癥因子表達(dá)量升高，4周后即出現(xiàn)主動脈瓣口狹窄等變化。因此我們推測小鼠在損傷早期即出現(xiàn)主動脈瓣處血流動力學(xué)改變、主動脈瓣膜增厚等病理生理改變。

與Honda等［18］的結(jié)論不同，我們發(fā)現(xiàn)在導(dǎo)管損傷小鼠瓣膜后，主動脈處立即出現(xiàn)血流動力學(xué)改變，且鈣化性主動脈瓣膜病初期出現(xiàn)的瓣膜增厚、代表骨形成的鈣鹽沉積、成骨蛋白ALP表達(dá)升高均在4周出現(xiàn)并與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并維持至16周。另外，我們發(fā)現(xiàn)造模成功小鼠在造模后8周～16周時(shí)容易出現(xiàn)心力衰竭而死亡。鑒于我們發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管損傷模型小鼠心功能在短軸縮短率逐漸下降的情況下不伴有心悸肥厚，因此該模型可以進(jìn)一步用于模擬主動脈瓣狹窄伴關(guān)閉不全造成的心力衰竭。

1 材料和方法

1.1 動物模型的制備

1.1.1 設(shè)計(jì) 隨機(jī)對照動物實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2021年8月～2022年3月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院器官衰竭防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1.3 材料

1.1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性C57/BL6小鼠24只，體質(zhì)量20 g左右，8周齡[廣東志遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司，SYXK（粵）2021-0057]。本研究動物實(shí)驗(yàn)在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號NFYY-2020-06045）。室內(nèi)保持良好通風(fēng)，室內(nèi)溫度為25±2 ℃，濕度（50±10）%，12 h循環(huán)光照下普通飼料分籠（4籠）飼養(yǎng)，48 h/次更換墊料和飼料，自由飲水。

1.1.3.2 實(shí)驗(yàn)用主要試劑、材料 FST血管穿刺引導(dǎo)系統(tǒng)；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（Solarbio）；茜素紅S染色液（0.2%，pH4.2，北京雷根DS0058）；兔抗人ALP抗體（Abclonal）；Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG H&L（Bioss）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.1.4.1 模型構(gòu)建及分組 將24只C57/BL6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組，6只/組：假手術(shù)組、造模4周組、造模8周組、造模16周組。小鼠造模前禁食禁水8 h，以0.1 mL/g的濃度向小鼠腹腔注射0.2%戊巴比妥鈉，脫掉頸部、胸前區(qū)毛發(fā)，并用碘伏擦拭常規(guī)消毒，于頸正中稍偏右縱向剪約1 cm切口，用鑷子鈍性分離頸前區(qū)筋膜并分離出右側(cè)頸總動脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端打活結(jié)，在中間剪口并插入導(dǎo)管，超聲引導(dǎo)導(dǎo)絲損傷主動脈瓣，在超聲下確認(rèn)導(dǎo)絲通過每只鼠的瓣膜并來回?fù)p傷100次，超聲多普勒血流顯示返流達(dá)到1000 mm/s左右，如未達(dá)到1000 mm/s，則繼續(xù)損傷20次，查看超聲多普勒血流直至返流達(dá)到1000 mm/s左右。假手術(shù)組僅插入導(dǎo)管，不進(jìn)行瓣膜損傷（圖1）。

圖1 超聲引導(dǎo)下將導(dǎo)管送至主動脈瓣膜處損傷瓣膜Fig.1 Ultrasound-guided catheter injury of aortic valve in mice.A: The catheter was inserted in the ascending aorta via the common carotid artery.B: The guide wire was pulled out of the catheter repeatedly to induced aortic valve injury.

1.1.4.2 主動脈瓣膜組織的制備 造模達(dá)相應(yīng)時(shí)間后麻醉下頸椎脫臼法處死各小鼠，注射器吸取10 mL生理鹽水緩慢沖洗左心室及右心室，將心臟同升主動脈一起取下，固定于4%多聚甲醛，經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行5 μm連續(xù)切片，65 ℃烤箱烘烤2 h后存放。

1.2 主要觀察指標(biāo)

1.2.1 超聲心動圖 小鼠在造模4周、8周、16周時(shí)進(jìn)行超聲心動圖檢測。以1%～2%濃度異氟烷進(jìn)行氣體麻醉，分別在左室長軸、短軸、流出道平面檢測小鼠各項(xiàng)心臟指標(biāo)。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色 取小鼠瓣膜組織切片進(jìn)行脫蠟、水化，按照蘇木精-伊紅試劑盒進(jìn)行染色，透明后干燥，中性樹膠封片后在倒置熒光顯微鏡下觀察組織形態(tài)并拍攝。

1.2.3 茜素紅染色 取小鼠瓣膜組織切片進(jìn)行脫蠟、水化，完全干燥后用茜素紅染液（0.2%，pH 4.2）染色兩分鐘，透明后干燥，中性樹膠封片后在倒置熒光顯微鏡下觀察組織形態(tài)并拍攝。

1.2.4 免疫熒光 取小鼠瓣膜組織切片進(jìn)行脫蠟、水化，檸檬酸鈉抗原修復(fù)后，4%多聚甲醛固定后0.4%TritonX破膜，5%BSA封閉后一抗低溫敷育過夜，PBS清洗后敷育熒光二抗、DAPI并用抗熒光淬滅劑封片，避光低溫保存。共聚焦顯微鏡拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表達(dá)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用Shapiro-Wilk法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)性，多組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，使用單因素方差分析（one way ANOVA），并選擇Tukey HSD法進(jìn)行兩兩比較；多組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但方差不齊，使用Brown-Forsythe檢驗(yàn)，并選擇Games-Howell法進(jìn)行兩兩比較。當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心臟功能變化

超聲結(jié)果顯示，小鼠在造模時(shí)即出現(xiàn)主動脈峰值流速升高以及瓣口返流（圖2、3），1周后出現(xiàn)主動脈瓣峰值流速以及主動脈瓣峰值壓力升高，直至2周上升至最高流速與最高壓力，與對照組比較差異有顯著性差異，之后主動脈瓣峰值流速略微降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；左心室射血分?jǐn)?shù)緩慢降低，直至造模12周出現(xiàn)心力衰竭；主動脈瓣口面積在造模1周后減小，之后主動脈瓣口面積略微上升但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。小鼠生存率造模后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠生存曲線顯示不同組之間生存率無明顯區(qū)別（圖4）。

圖4 不同組小鼠生存率曲線Fig.4 Survival curves of the mice in different groups.A:Comparison of survival rates among Sham,4-week,8-week,and 16-week groups.B:Comparison of survival rates between Sham group and the injured group.

表1 小鼠不同周數(shù)各種指標(biāo)數(shù)值Tab.1 Heart rate,body weight,FS,AV peak velocity,aortic valve orifice area (AVA) and aortic valve thickness in C57BL6 mice at different weeks

圖2 主動脈瓣膜損傷前后多普勒超聲顯示主動脈瓣口處血流Fig.2 Blood flow at the aortic valve before(A)and after(B)valve injury.

圖3 主動脈瓣膜損傷前后多普勒超聲顯示主動脈瓣峰值流速Fig.3 AV peak velocity before(A)and after(B)valve injury.

3.2 主動脈瓣膜組織形態(tài)學(xué)變化

小鼠在造模4 周、8 周、16 周后都出現(xiàn)瓣膜增厚（圖5，表1）。造模4周后瓣膜增厚，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異且維持至16周，其中4周與8周（P＞0.9）、8周與16周的瓣膜厚度相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.86）。損傷后4周的瓣膜中出現(xiàn)粉色的膠原沉積，并在之后的周數(shù)中增多，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。茜素紅染色示在造模4、8、16周后出現(xiàn)瓣膜鈣鹽沉積明顯增多（圖6），與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.0001）。

圖5 造模后不同周數(shù)小鼠瓣膜厚度Fig.5 Aortic valve thickness in C57BL6 mice at different weeks after injury(Original magnification:×100,Grain-Eosin staining).

圖6 造模后不同周數(shù)小鼠瓣膜鈣鹽沉積Fig.6 Aortic valve calcium deposition at different weeks after injury(×400,Alizarin red staining).

3.3 主動脈瓣膜成骨指標(biāo)變化

免疫熒光顯示，對照組成骨蛋白ALP表達(dá)量低，造模4周、8周、16周后ALP表達(dá)量升高（圖7），與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0016）。4周、8周、16周比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.3138）。

圖7 造模后不同周數(shù)小鼠瓣膜ALP表達(dá)量Fig.7 Expression ofALP in the aortic valves at different weeks after injury(×200,Immunofluorescence).

3 討論

研究表明，由于主動脈瓣膜的結(jié)構(gòu)與位置的特殊性，其機(jī)械損傷是鈣化性主動脈瓣疾病的主要原因之一［16,19］。而局部血流動力學(xué)改變是造成主動脈瓣膜機(jī)械損傷的重要因素［20］：局部湍流造成瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷，出現(xiàn)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，瓣膜成纖維細(xì)胞開始增生，并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞［20-22］。Panizzi等［23］報(bào)道了一種小鼠血漿凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌心內(nèi)膜炎模型，該模型不依賴超聲引導(dǎo)將特殊材料插入心臟引起心內(nèi)膜炎。雖然他們的方法與Honda等［18］的導(dǎo)管損傷模型相似，但他們的模型不會發(fā)展成AVS。Honda等［18］構(gòu)建的種通過直接向野生型C57/BL6小鼠右頸總動脈插入導(dǎo)管至升主動脈損傷主動脈瓣，喂養(yǎng)小鼠普通飲食，在16周內(nèi)即可造成主動脈瓣膜增厚、鈣化的小鼠主動脈瓣膜損傷模型。但我們發(fā)現(xiàn)，造模成功小鼠在造模后8周～16周時(shí)容易出現(xiàn)心力衰竭而死亡，造成實(shí)驗(yàn)過程中動物脫失，需要持續(xù)補(bǔ)加模型數(shù)量，而且在實(shí)驗(yàn)過程中施加刺激如病毒、藥物等干預(yù)的持續(xù)時(shí)間較短，因此在保證動物存活率的基礎(chǔ)上探討主動脈瓣膜損傷模型成功率的時(shí)間尤為重要。

鈣化性主動脈疾病患者往往因?yàn)闅舛?、心悸等原因就診，行心臟彩超檢查發(fā)現(xiàn)主動脈瓣處存在返流與流速增快而確診［24］。我們發(fā)現(xiàn)在導(dǎo)管損傷小鼠瓣膜后，主動脈處立即出現(xiàn)血流動力學(xué)改變，包括主動脈瓣處返流以及主動脈峰值流速與峰值壓力升高，小鼠在導(dǎo)管損傷1周后即出現(xiàn)主動脈峰值流速與峰值壓力升高等血流動力學(xué)升高改變，至2周達(dá)到最高，并維持至16周。主動脈瓣口面積在損傷2周后縮小，4周即開始出現(xiàn)主動脈瓣膜增厚及鈣鹽沉積。高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠及其他模型在以往的研究中被用于模擬主動脈瓣膜鈣化性疾病，但這些小鼠往往不出現(xiàn)明顯的血流動力學(xué)改變，瓣膜增厚的同時(shí)伴隨心室肥大、冠脈粥樣硬化等改變［25,26］。與其他模型相比，代表骨形成的鈣鹽沉積也在4周即出現(xiàn)［27,28］。鈣化性主動脈瓣膜疾病中，主動脈瓣膜形態(tài)改變主要表現(xiàn)為瓣膜的增厚與鈣結(jié)節(jié)形成［29］。我們發(fā)現(xiàn)造模4周后瓣膜增厚，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異且維持至16周，其中4周以后的周數(shù)中，瓣膜厚度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。需要特別注意的是，我們在造模后4周小鼠的瓣膜HE染色切片中發(fā)現(xiàn)粉紅色的膠原沉積，推測可能是損傷后壞死并由瘢痕組織修復(fù)的產(chǎn)物，在之后的周數(shù)中膠原沉積不斷增多，這與鈣化性主動脈瓣膜病發(fā)病過程中的營養(yǎng)不良性鈣化有共同之處：主動脈瓣鈣化時(shí)瓣膜發(fā)生內(nèi)皮損傷、基底膜破壞、瓣膜內(nèi)異常膠原沉積等多種改變，細(xì)胞發(fā)生凋亡，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞被降解，作為鈣和磷酸鹽沉積的底物聚集成為鈣結(jié)節(jié)［28,30-32］。茜素紅染色示在造模4、8、16周后出現(xiàn)瓣膜鈣鹽沉積明顯增多，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在人鈣化的主動脈瓣膜中能觀察到表達(dá)升高的成骨因子，與瓣膜軟骨細(xì)胞增多、骨形成及鈣鹽沉積有關(guān)［32］。我們的結(jié)果表明，對照組成骨蛋白ALP表達(dá)量低，造模4周、8周、16周后ALP表達(dá)量升高（圖6），與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4周、8周、16周比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。造模過程中我們觀察到小鼠體質(zhì)量上升有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但通過與高脂飲食誘導(dǎo)的APOE-/-小鼠對比［33］，導(dǎo)管損傷的C57BL6小鼠體質(zhì)量只輕微增長，原因可能是小鼠的正常生長造成的體質(zhì)量增加，因此我們認(rèn)為該模型對小鼠體質(zhì)量無影響。以上結(jié)果均顯示，小鼠瓣膜在導(dǎo)管損傷4周后即出現(xiàn)增厚、鈣鹽沉積與成骨蛋白表達(dá)升高，并維持至16周。

與Honda等［18］的研究結(jié)論不同的是，我們發(fā)現(xiàn)在導(dǎo)管損傷小鼠瓣膜后，主動脈處立即出現(xiàn)血流動力學(xué)改變，且鈣化性主動脈瓣膜病初期出現(xiàn)的瓣膜增厚、代表骨形成的鈣鹽沉積、成骨蛋白ALP表達(dá)升高均在4周出現(xiàn)并與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并維持至16周。另外，我們發(fā)現(xiàn)造模成功小鼠在造模后8周～16周時(shí)容易出現(xiàn)心力衰竭而死亡，可以為后續(xù)因主動脈瓣返流出現(xiàn)心力衰竭的動物模型提供選擇。

綜上所述，我們認(rèn)為在保證小鼠生存率的情況下，導(dǎo)管損傷主動脈瓣膜4周后的小鼠模型即可模擬鈣化性主動脈瓣膜疾病病理生理改變，該動物模型對分析鈣化性主動脈瓣膜疾病發(fā)病機(jī)制和制定治療策略有一定參考價(jià)值。另外，鑒于我們發(fā)現(xiàn)在導(dǎo)管損傷過程中小鼠的短軸縮短率是逐漸下降的趨勢，且過程中左心室無明顯肥厚，因此該模型可以進(jìn)一步用于模擬主動脈瓣狹窄伴關(guān)閉不全造成的心力衰竭。