高 鵬，朱海濤，裴文浩，許培海，丁勇興

1蚌埠醫(yī)學院附屬蚌埠市第三人民醫(yī)院普外科，安徽 蚌埠 233099；2蚌埠醫(yī)學院癌癥轉化醫(yī)學安徽省重點實驗室，安徽 蚌埠233030

2020年全球女性乳腺癌發(fā)病人數(shù)226.1萬例，占全部惡性腫瘤的24.5%，致死率也高達15.5%，均位列首位［1］。臨床上乳腺癌首選手術治療，跟據(jù)個體差異選擇增加內分泌治療及放化療等。但部分患者發(fā)現(xiàn)不及時，導致復發(fā)和轉移，預后較差［2］。因此，早發(fā)現(xiàn)并及時給予臨床干預是改善預后的積極手段。

miRNA是一種內生性、非編碼的小分子RNA，長約19～25個nt［3］。miRNA可通過靶基因的表達，從而影響細胞增殖、凋亡和侵襲等生物學活性［4］。研究發(fā)現(xiàn)miR-4324通過靶向抑制RacGTP酶激活蛋白1基因在RCC細胞（腎細胞癌）中的表達，從而抑制RCC細胞的增殖［5］；通過調控靶基因瓣膜特異性核酸內切酶1（FEN1），抑制卵巢癌細胞生長，增加其凋亡率［6］。經(jīng)Targetscan 分析發(fā)現(xiàn)，Talin2 與miR-4324 存在結合位點，可能為其潛在的靶基因之一。踝蛋白（Talin）是一類大的、多結構域的胞膜蛋白，參與合成粘著斑［7］。Talin2表達的上調可以顯著增加乳腺癌細胞的轉移與侵襲力［8］。

目前對于miR-4324及Talin2在乳腺癌組織中的表達以及與乳腺癌臨床病理之間的相關性尚無報道。本研究通過分析miR-4324和Talin2在乳腺癌組織和癌旁乳腺組織中的表達情況，結合病理資料分析臨床意義，為乳腺癌的早期診斷及預后評估提供相關標志物。

1 資料和方法

1.1 標本來源

本研究所選標本均來自蚌埠醫(yī)學院附屬蚌埠第三人民醫(yī)院普外科及蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院甲乳外科2020年10月～2021年12月通過手術治療的15例乳腺浸潤性導管癌的癌組織（BCT）及其癌旁組織（PCBT）的新鮮標本（PCBT需距離腫瘤組織邊緣＞5 cm）。納入標準：經(jīng)病理學檢查確診為乳腺癌的患者。排除標準：有其他惡性腫瘤史；有長期服用相關抗腫瘤藥物史；有遠處轉移；有任何放化療等相關治療史?；颊咄獗狙芯糠桨覆⒑炇鹬橥鈺?，并經(jīng)蚌埠醫(yī)學院倫理委員會審批（倫科批字：2020第69號）。

1.2 標本處理

術中摘除組織后，用0.9%的生理鹽水沖凈血漬，于無菌操作下剖開組織，仔細確認后切取部分腫瘤組織及癌旁乳腺組織，兩者大小1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm；放入10 mL無酶離心管中，并注入能沒過組織的RNA保護液；將離心管放入液氮罐或冰盒中運輸，后在-80 ℃的條件下保存。收集的手術標本分成兩份，其中15例樣本用于術后的病理及免疫組化檢查，符合樣本要求的13例用于qRT-PCR檢測miR-4324的表達。

1.3 一般資料與臨床病理特征

收集的乳腺浸潤癌患者均為女性，年齡43～87歲。標本的病理結果已被兩所醫(yī)院的病理科確認。根據(jù)美國腫瘤聯(lián)合會第8版乳腺癌分期標準（TNM法），其中臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者共13人，Ⅲ期共2人。淋巴結（+）5人，淋巴結（-）10人。

1.4 實驗材料

SKBR-3（中科院細胞研究所）；miR-4324 mimics（上海吉瑪）；新生胎牛血清（FBS）購自LONSA；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；TRIzol試劑（Invitrogen）；PCR試劑盒（Vazyme）；Transwell 小室（Corning）；pmirGLO 載體（GenePharma）；焦碳酸二乙酯（DEPC）購自Sigma；兔抗人Talin2一抗（abclonal）。

1.5 實驗步驟

1.5.1 免疫組化 將取到15例的乳腺組織進行石蠟包埋，后用機器切成約4 μm厚的石蠟切片；將切片脫蠟至水化，加入3%的H2O2，室溫孵育20 min；用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍，修復抗原；37 ℃條件下孵育一抗2 h，PBS沖洗3遍；相同條件孵育二抗1 h，清洗3遍；使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進行顯色處理，鏡下觀察并拍照。Talin2染色結果的判定：當細胞膜、胞漿出現(xiàn)黃褐色、棕黃色顆粒時為判定依據(jù)，未著色、低于10%的細胞著色者記0分，高于10%則代表Talin2染色陽性，其中著色弱且無連續(xù)性記1分，著色中等、著色部分不連續(xù)記2分，著色強且連續(xù)性佳記3分。0～1分視為Talin2低表達，2～3分視為Talin2高表達。

1.5.2 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞SKBR-3置于10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2和37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細胞融合度在90%左右時進行傳代處理；根據(jù)具體生長情況予以換液或消化。

1.5.3 細胞轉染 人乳腺癌細胞株（SKBR-3）體外培養(yǎng)，分為Control對照組（正常培養(yǎng))及相關轉染組（轉染相關片段）：miR-4324 mimics組；miR-4324 inhibitor組；miR-4324 NC組；si-Talin2組；miR-4324 inhibitor+si-Talin2組。在六孔板中接種SKBR-3細胞；配比轉染試劑：A液為250 μL 無血清培養(yǎng)基+5 μL Lipo 2000，B液為250 μL 無血清培養(yǎng)基+5 μL mimics，A、B液混合均勻后靜置一段時間即可；細胞融合度達在50%～60%時，根據(jù)分組，加入轉染試劑和1.5 mL無血清培養(yǎng)基，輕輕搖勻后放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；6 h后，予以換液，加入10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2 mL。

1.5.4 RNA的提取 細胞處理：采用0.25%-EDTA胰酶進行細胞消化，將得到的懸液于1500 g離心5 min，得到細胞沉淀；加入苯酚試劑（TRIzol）1 mL，靜置20 min。組織處理：取出裝有組織的離心管，解凍后將組織剪成適宜大小，將其與2～4顆鋼珠球一起加入1.5 mL的無酶Ep管中，加入苯酚試劑1 mL，研磨，冰上10 min。提取RNA：將制備好裝有細胞和組織的Ep管加入0.2 mL的三氯甲烷，震蕩直至乳狀，冰上5 min；12 000g，4 ℃離心15 min；上清吸至新的Ep管中，加入0.5 mL異丙醇，相同條件下離心10 min，得到RNA沉淀；加入1.0 mL 75%乙醇洗滌沉淀，7600 g，4 ℃離心5 min；沉淀中加入DEPC水溶解，-80 ℃保存。

1.5.5 qRT-PCR檢測 利用SYBR熒光染料法檢測miR-4324的表達，miR-4324 RQ（相對表達量）的計算公式為：RQ=2-ΔΔCT，其中ΔΔCT=（CTmiR-4324-CTU6RNA）BCT-（CTmiR-4324-CTU6RNA）PCBT的均值。qRT-PCR檢測Talin2 表達量。根據(jù)試劑盒指示進行逆轉錄合成cDNA后進行PCR擴增。

1.5.6 細胞增殖實驗 胰酶消化對數(shù)生長期的SKBR-3細胞，接種在96孔板，密度為2×103/孔；細胞融合達60%左右時予以轉染，繼續(xù)培養(yǎng)；分別與24、48、72、96 h時加入10 μL的CCK-8溶液，孵育1 h；酶標儀測定細胞的吸光度值A450nm。

1.5.7 細胞凋亡檢測 將處于對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化，接種于6孔板內，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；當細胞生長至60%～70%左右時按分組處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入無EDTA胰酶消化5～10 min，終止消化；1500 r/min離心3～5 min，棄上清，1%FBS調整細胞濃度；加入異硫氰酸熒光素（FITC）和藻紅蛋白（PE），避光孵育30 min；上機檢測。

1.5.8 細胞遷移實驗（劃痕實驗）對數(shù)生長期的SKBR-3細胞調整至適宜濃度；培養(yǎng)24 h后移液槍頭垂直劃痕，顯微鏡觀察并拍照；繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察并記錄SKBR-3細胞的遷移活動情況。

1.5.9 Transwell細胞侵襲、遷移實驗 帶有基質膠預涂的24孔Transwell小室（遷移實驗不鋪膠）下室加入無血清含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL；消化各組SKBR-3細胞，無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，調整細胞濃度，取細胞懸液100 μL加入transwell上室；培養(yǎng)箱中孵育24 h后，取出小室棄上清液，用棉簽擦去小室內殘余細胞；4%的多聚甲醛溶液固定；吉姆薩染色，倒置顯微鏡下（100×）隨機計數(shù)5個視野中穿膜細胞數(shù)并拍照。

1.5.10 熒光素酶活性檢測 合成含有miR-4324 靶點的Talin2 野生型（WT）或突變型（MUT）片段，并克隆入pmirGLO載體，構建pmir-GLO-Talin2-WT和pmir-GLO-Talin2-MUT 熒光素酶報告載體；用Lipofectamine 2000將熒光素酶報告載體和miR-4324模擬物/miR-4324 陰性對照組（NC）共轉染SKBR-3細胞；轉染48 h后，用雙熒光素酶檢測試劑盒分別檢測螢火蟲酶活性和海腎熒光活性。

1.5.11 Western blot檢測蛋白表達 將對數(shù)生長期的細胞消化、離心、洗滌后加入蛋白裂解液（裂解液∶PMSF=100∶1），置于冰面50 min 4 ℃，12 000g離心15 min，取上清檢測蛋白濃度；配置BCA工作液（A液∶B液=50∶1）；將0、1、2、4、8、12、16、20 μL的蛋白標準品與2 μL的待測樣品分別加到96孔板中，并用PBS液補足至20 μL，再加入200 μL的BCA工作液，37 ℃孵育30 min；酶標儀測A562nm值，做蛋白標準曲線，計算待測蛋白濃度；SDSPAGE電泳、轉膜后，一抗孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，20 min/次；二抗（稀釋度1∶5000）37 ℃孵育2 h，洗膜，凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄。

1.6 統(tǒng)計學分析

SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析，使用Fisher確切概率法、配對t檢驗，Graphpad 8.3.0軟件作圖，均數(shù)±標準差表示計量資料，t檢驗表示兩樣本均數(shù)間差異，P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。所有相關實驗均獨立進行3次。

2 結果

2.1 Talin2在乳腺癌組織中高表達

用石蠟包埋的BCT及PCBT行免疫組化法來測定Talin2的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，Talin2在BCT中主要表達呈陽性，PCBT中表達為陰性（圖1）。

圖1 免疫組化檢測BCT及其PCBT中Talin2的表達Fig.1 Immunohistochemical detection of Talin2 expression in breast cancer tissues(A,B)and adjacent tissues(C,D)(Original magnification:A,C:×10;B,D:×40).

2.2 乳腺癌患者中Talin2表達與臨床病理特征的相關性分析

結合相關病理資料，用統(tǒng)計學方法分析相關性，結果發(fā)現(xiàn)Talin2的表達在年齡、組織學分級、臨床分期、ER和PR 表達差異等病理參數(shù)中的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而在淋巴結轉移、HER-2的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 Talin2表達與乳腺癌患者臨床病理間的關聯(lián)

2.3 miR-4324在乳腺癌組織中表達下調

利用qRT-PCR 檢測乳腺癌組織（BCT）和癌旁組織（PCBT）中miR-4324的差異表達。結果發(fā)現(xiàn)，相對于PCBT，miR-4324在BCT中的表達下調-10.27±1.66vs-6.64±2.49（P＜0.01，圖2）。

圖2 miR-4324在乳腺癌組織（BCT）和癌旁組織（PCBT）的表達情況Fig.2 miR-4324 expression in breast cancer tissues (BCT) and adjacent tissues (PCBT)detected by qRT-PCR.**P＜0.01 BCT vs PCBT.

2.4 miR-4324抑制SKBR-3細胞的增殖能力

SKBR-3 細胞中轉染miR-4324 mimics 后，利用qRT-PCR技術檢測miR-4324的表達，結果發(fā)現(xiàn)，相對于對照組（Control），miR-4324 陰性對照組（Negative control NC）miR-4324 的表達差異無統(tǒng)計學意義，miR-4324 mimics組差異有統(tǒng)計學意義119.04±19.23vs1.00±0.00（P＜0.01）。利用CCK-8 實驗檢測miR-4324對細胞增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)，相對于Control組，miR-4324 mimics后吸光度值明顯降低，24、48、72、96 h時，Control組與miR-4324 mimics組的吸光度值分別為：0.28±0.04vs0.25±0.03；0.64±0.01vs0.44±0.02；1.02±0.01vs0.65±0.03；1.14±0.03vs0.81±0.02，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖3）。

圖3 miR-4324 mimics對SKBR-3細胞增殖的影響Fig.3 Effect of miR-4324 mimics on proliferation of SKBR-3 cells.A:qRT-PCR to verify the transfection efficiency of miR-4324 mimics.B: Effect of miR-4324 mimics on proliferation of SKBR-3 cells detected by CCK-8 assay.**P＜0.01 vs control group.

2.5 miR-4324誘導SKBR-3細胞的凋亡

利用流式細胞術檢測miR-4324對細胞凋亡的影響，結果發(fā)現(xiàn)，相對于Control組，miR-4324 mimics組中SKBR-3 細胞的凋亡增加（13.78±1.15）%vs（3.85±0.64）%（P＜0.01，圖4）。

圖4 miR-4324 mimics誘導SKBR-3細胞的凋亡圖4 Effect of miR-4324 mimics on apoptosis of SKBR-3 cells.A:Effect of miR-4324 on apoptosis detected by flow cytometry;B:Quantitative analysis of the results.**P＜0.01.

2.6 miR-4324抑制SKBR-3細胞的遷移和侵襲能力

劃痕與侵襲實驗結果顯示，48 h時，相對于對照組（Control），miR-4324 mimics 組中SKBR-3 細胞的遷移能力（7.73±1.60）%vs（31.9±2.82）%（P＜0.01，圖5）和侵襲能力均下降81.33±30.83vs174.00±64.09（P＜0.05，圖6）。

圖5 miR-4324 mimics對SKBR-3細胞遷移能力的影響Fig.5 Effect of miR-4324 mimics on the migration capacity of SKBR-3 cells.A:Scratch experiments(×100).B:Quantitative analysis of the results.**P＜0.01.

圖6 miR-4324 mimics對SKBR-3細胞侵襲能力的影響Fig.6 Effect of miR-4324 mimics on invasive ability of SKBR-3 cells.A:Invasion experiments(×100).B:Quantitative analysis of the results.*P＜0.05.

2.7 miR-4324 mimics靶向抑制Talin2的表達

為了確定miR-4324的潛在靶基因，經(jīng)TargetScan分析，表明Talin2與miR-4324存在結合位點，可能為其潛在的靶點之一（圖7）。構建含Talin2 3'-UTR與miR-4324結合位點野生型（WT）和突變型（MUT）的雙熒光素酶基因報告載體（圖8A），熒光素酶活性實驗結果表明，相對于control組，miR-4324 mimics共轉染可顯著降低Talin2-3'-UTR WT 報告質粒的熒光素酶活性（1.00±0.04vs0.74±0.10,P＜0.05），而Talin2-3'-UTR MUT報告質粒的熒光素酶活性未見統(tǒng)計學差異（1.02±0.03vs1.00±0.07,P＞0.05，圖8B）；利用qRT-PCR 及Western blot技術檢測miR-4324對Talin2表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)，相對于control組，miR-4324 mimics組Talin2的mRNA（0.82±0.27vs1.00±0.00,P＜0.05，圖9A）和蛋白表達降低（0.68±0.12vs1.00±0.10，P＜0.05，圖9B、C）。

圖7 TargetScan預測的miR-4324與Talin2互補結合位點圖Fig.7 Complementary binding sites of miR-4324 and Talin2 predicted by TargetScan.

圖8 熒光素酶活性實驗驗證miR-4324與Talin2的關系Fig.8 Luciferase activity assay for validating the relationship between miR-4324 and Talin2.A: Potential binding site between miR-4324 and the 3'-UTR region of Talin2.B:Dual luciferase reporter gene validation of miR-4324 target gene Talin2.*P＜0.05.

圖9 通過Western-blot及qRT-PCR檢測SKBR-3細胞中Talin2的表達水平Fig.9 Detection of Talin2 expression in SKBR-3 cells by qRT-PCR(A)and Western blotting(B).C:Quantitative analysis of the results of Western blotting.*P＜0.05.

2.8 miR-4324通過靶向抑制Talin2來抑制乳腺癌細胞SKBR-3細胞的遷移能力

為了驗證miR-4324影響乳腺癌細胞的遷移能力是通過Talin2 發(fā)揮作用，我們進行了Transwell 遷移實驗。結果提示，相對于對照組（Control），miR-4324 inhibitor 組中SKBR-3 細胞的遷移能力增強（351.6±45.0vs271.3±68.8，P＜0.01）；si-Talin2組中SKBR-3細胞的遷移能力降低（151.2±18.2vs271.3±68.8，P＜0.01）；miR-4324 inhibitor+si-Talin2組中SKBR-3細胞的遷移能力居中（201.5±27.2vs271.3±68.8，P＜0.05）；（201.5±27.2vs351.6±45.0，P＜0.01，圖10A、B）

圖10 miR-4324 inhibitor調控Talin2對SKBR-3細胞遷移的影響Fig.10 Effect of miR-4324 inhibitor-mediated regulation of Talin2 on migration of SKBR-3 cells.A:Transwell migration experiment(×100).B:Quantitative analysis of the results.*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs miR-4324 inhibitor group.

3 討論

乳腺癌是一種分布廣泛，且致死率偏高的惡性腫瘤［9］。臨床上急切需求新的診斷方法與治療方案，提高乳腺癌早期檢出率，以及盡可能降低治療損傷及副作用，達到“精準治療”［10］。乳腺癌相關病理生理是一個極為復雜的過程，涉及到多種基因表達的差異以及信號通路的變化［11］，因此尚需尋找關鍵的調控因子。

目前研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、耐藥機制以及早期診斷方面的發(fā)揮關鍵的作用［12］。miRNA的異常表達可以直接參與腫瘤細胞的增殖、遷移、免疫以及細胞凋亡等生理過程［13-15］。研究表明，miRNA可通過與特定的靶點相結合來調控靶基因的表達，從而參與腫瘤細胞生物學活性的調控［16］。癌基因P-21激活激酶1（PAK1）是miR-494的直接靶點，乳腺癌中miR-494表達下調，導致PAK1的表達增加，從而誘導乳腺癌細胞的增殖、轉移和侵襲［17］；miR-4443高表達可通過抑制其靶基因磷脂酰乙醇胺結合蛋白1的表達來誘導乳腺癌的轉移［18］。因此，miRNA有望成為乳腺癌診斷及治療中的關鍵靶點。研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-4324抑制Rac-GTP酶激活蛋白1，拮抗膀胱癌的生長［19］；食管鱗癌細胞中，miR-4324可通過降低內粘著斑激酶（FAK）的表達，抑制食管癌細胞的侵襲等能力［20］。乳腺癌中，通過臨床樣本橫斷面研究，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中miR-4324表達下調［21］。在三陰乳腺癌中，發(fā)現(xiàn)PTEN缺失與miR-4324、miR-125b、miR-145和miR136等表達下調與乳腺癌轉移相關，可預測不良預后［22］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-4324在乳腺癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，過表達miR-4324可抑制細胞的增殖、侵襲和遷移能力，并誘導凋亡，表明在乳腺癌中miR-4324可能作為一個潛在的抑癌基因發(fā)揮作用。但關于miRNA-4324在乳腺癌中的作用及相關靶蛋白尚未見報道。利用Targetscan數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)Talin2與miR-4324存在潛在的結合位點，預測Talin2是miR-4324的靶基因之一。

Talin2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［23-25］，可影響腫瘤細胞的侵襲、血管生成，以及轉移等，從而加速腫瘤細胞軸突樹突的形成、運動以及通過血管滲入組織導致肺轉移［26］；阻斷乳腺癌細胞中Talin2的表達后，細胞核與染色質明顯縮小，且形態(tài)學也發(fā)生明顯改變，表明低表達Talin2誘導腫瘤細胞凋亡，并抑制細胞的轉移和侵襲力［27］。

臨床上，腫瘤組織的病理學特征可作為判斷乳腺癌類型、臨床分期、分子分型和預后等［28］，其中淋巴結轉移與術后復發(fā)關系密切，激素受體的表達及HER-2受體表達水平是確定內分泌及靶向治療的關鍵指標［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，在miR-4324低表達的乳腺癌組織中，Talin2表達呈陽性，而對應的癌旁組織表達幾乎為陰性，表明Talin2在乳腺癌中的表達增高，且miR-4324與Talin2成負相關，過表達miR-4324可靶向抑制Talin2的表達。通過臨床病理特征的相關性分析，發(fā)現(xiàn)Talin2與淋巴結的轉移、HER-2的高表達呈正相關。Transwell的回復實驗證明了miR-4324通過靶向調控Talin2抑制乳腺癌細胞SKBR-3細胞的遷移能力。Wen［30］等也證實Talin2表達的上調可以顯著增加乳腺癌腫瘤細胞的侵襲及轉移能力。

綜上所述，本研究證實在乳腺癌中，miR-4324低表達而Talin2表達上調，與乳腺癌患者的淋巴結轉移和HER-2表達呈正相關；過表達miR-4324可抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲與遷移，并誘導凋亡；miR-4324通過靶向抑制Talin2來抑制乳腺癌細胞SKBR-3細胞的遷移能力。進一步闡明miR-4324及其靶基因Talin2的作用機制，可為乳腺癌患者的早期診斷以及個體化、精準化治療提供理論依據(jù)和分子標志物。