黃蘭蘭,蔣杰賢,王金彥,張 浩*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護研究所,上海 201403;2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306)

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)屬鱗翅目Lepidoptera,夜蛾科Noctuidae,灰翅夜蛾屬Spodoptera,是世界十大植物害蟲之一,被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為全球預(yù)警的遷飛性重大農(nóng)業(yè)害蟲,對全世界的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了極其嚴(yán)重的影響[1-4],包括使玉米和水稻等糧食作物以及禾本科、豆科等作物減產(chǎn)[5-8]。草地貪夜蛾取食范圍廣、遷飛能力強[9-11],已從最初的原產(chǎn)地美洲擴散至全球100多個國家,于2019年初首次入侵我國云南地區(qū)[12-14],同年5月,上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院害蟲生態(tài)防控團隊在上海市奉賢區(qū)的玉米地中首次發(fā)現(xiàn)了入侵的草地貪夜蛾。

對物種進行準(zhǔn)確鑒定和監(jiān)測是開展防控工作的首要條件。部分夜蛾科害蟲形態(tài)差異不大,尤其是灰翅夜蛾屬Spodoptera的幾種夜蛾,成蟲之間形態(tài)差異很小[15],而且同一物種不同亞種的昆蟲形態(tài)差異可能更小,通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法鑒定夜蛾種類以及亞種往往很困難?；谏鲜鲈?用分子生物學(xué)方法鑒定和分析夜蛾科害蟲具有重要意義[16]?；诰€粒體細胞色素C氧化酶第I亞基(Cytochrome coxidase subunit I,COI)基因的序列分析是當(dāng)前物種鑒定中最常用和最有效的分子鑒定方法。除此之外,位于Z染色體上的磷酸甘油醛異構(gòu)酶(Triose-phosphate isomerase,Tpi)基因也是常用的物種標(biāo)記基因[17-19],將這兩種標(biāo)記基因結(jié)合使用,可使鑒定結(jié)果更加可靠。為科學(xué)鑒定上海地區(qū)草地貪夜蛾亞型類型,本研究在上海郊區(qū)采集了48個夜蛾樣本,利用兩個物種標(biāo)記基因(線粒體COI基因和核基因組Tpi基因)對其進行分子鑒定和遺傳分析,以期為上海地區(qū)草地貪夜蛾的監(jiān)測監(jiān)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用的害蟲樣本采集于上海市奉賢區(qū)(24個樣本)和崇明區(qū)(24個樣本)的玉米植株上。樣本采集時間是2019年5月至2020年8月,田間采集后將死蟲浸泡于無水乙醇中;活蟲置于飼養(yǎng)盒中,喂食新鮮玉米葉或人工飼料[20-21]。樣本帶回實驗室后,置于液氮中冷凍,并保存在-80℃超低溫冰箱中,用于后續(xù)研究。

1.2 DNA提取和PCR擴增

用液氮將單頭幼蟲或成蟲研磨成粉末狀,利用生工試劑盒提取各樣本夜蛾的DNA,純化的DNA經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳檢測,并使用752型紫外可見分光光度計測定濃度,置于-20℃保存待用。分別用擴增COI和Tpi基因的引物[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]對害蟲樣本基因組進行PCR擴增,引物序列見表1。采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyTaq酶進行PCR擴增,PCR反應(yīng)體系(20 μL):2×EasyTaq Mix 10 μL,正反向引物各0.5 μL(10 μmol∕L),ddH2O 8 μL,模板DNA(20 ng∕μL)1 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min,35個循環(huán)(94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min 30 s),72℃處理10 min。PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖電泳檢測,并將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 PCR擴增的引物信息Table 1 Primers used for PCR amplification

1.3 數(shù)據(jù)分析

在GenBank中查找已有的草地貪夜蛾COI和Tpi基因序列,以及Spodoptera屬近緣種的COI基因序列:Spodoptera frugiperda(HM136601,HM136600,HM136586),Spodoptera eridania(HM756083),Spodoptera dolichos(HM756086),Spodoptera pulchella(HM756076),Spodoptera litura(KF022223),Spodoptera littoralis(HM756074),Spodoptera exempta(HQ177331),Spodoptera triturata(KJ634312),Spodoptera exigua(HM756077)。用ClustalX軟件分析獲得序列的差異位點,根據(jù)已經(jīng)報道的基于COI和Tpi基因的“玉米型”和“水稻型”序列特點[12,22],通過序列比對分析鑒定采集害蟲樣本的物種和亞型。同時利用MEGA 7.0軟件分析不同物種間COI的演化關(guān)系,構(gòu)建COI的系統(tǒng)進化樹[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地貪夜蛾的形態(tài)觀察

通過萊卡顯微鏡(型號DM 4000 B)觀察不同發(fā)育時期草地貪夜蛾的形態(tài),發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾的卵塊表面一般會有覆蓋著的白色鱗毛,剛孵化的幼蟲全身呈現(xiàn)淡綠色,兩個齡期之后幼蟲頭部會出現(xiàn)倒“Y”形狀的紋路,而且腹部末端有4個呈正方形排列的黑點。草地貪夜蛾的蛹一般為橢圓狀且呈現(xiàn)金黃色或者暗紅色等,長度在16 mm左右。羽化之后的草地貪夜蛾成蟲前部翅膀為淺棕色,后部翅膀為白色,邊緣存在淺褐色帶,且雌蛾與雄蛾的翅膀花紋差異明顯[24],展翅長度約為35—40 mm(圖1)。

圖1 采自上海地區(qū)玉米田中不同發(fā)育時期的草地貪夜蛾及其寄主Fig.1 Different developmental stages of Spodoptera frugiperda collected from maize fields in Shanghai and its hosts

2.2 COI基因與Tpi基因的擴增

用COI基因與Tpi基因引物對48個樣本進行PCR擴增。結(jié)果顯示,這兩對引物在所有樣本中均擴增出了單一明亮的目的條帶。COI基因擴增的DNA片段約為800 bp,Tpi基因擴增的DNA片段約為400 bp,符合預(yù)期(圖2)。測序結(jié)果表明,48個樣本的COI基因擴增的DNA片段均為811 bp,其中47個樣本的序列完全一致(標(biāo)記為COI-SH-1),另外1個樣本與這47個樣本存在一個堿基的差異(標(biāo)記為COI-SH-2)。48個樣本的Tpi基因擴增的DNA片段均為406 bp(Tpi-SH)。

圖2 部分樣本PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測Fig.2 Gel electrophoresis of partial samples’PCR products

2.3 COI基因的進化分析

根據(jù)測序所得的上海害蟲樣本的COI基因序列及GenBank數(shù)據(jù)庫中的11條Spodoptera屬近緣物種COI序列,以小菜蛾P(guān)lutella xylostella(Linnaeus)COI基因序列作為外群,采用Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),上海地區(qū)樣本與已知的草地貪夜蛾聚為一支,與其他物種遺傳距離相對較遠,表明采自上海地區(qū)的害蟲樣本均為草地貪夜蛾。且從系統(tǒng)進化樹可以看出,草地貪夜蛾與亞熱帶粘蟲Spodoptera eridania有較近的親緣關(guān)系。

圖3 臨位相連法(NJ)構(gòu)建COI基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree analysis constructed by the Neighbor-Joining(NJ)method based on COI gene fragments

2.4 草地貪夜蛾亞型的鑒定

將測序得到的COI基因序列與草地貪夜蛾“水稻型”和“玉米型”COI基因序列[22]進行比對,發(fā)現(xiàn)樣本COI-SH-1與“水稻型”COI基因序列一致,樣本COI-SH-2與“水稻型”COI基因有1個堿基的差異;樣本COI-SH-1、COI-SH-2與“玉米型”COI基因分別有17個和16個堿基的差異(圖4)。表明上海地區(qū)草地貪夜蛾種群屬于“水稻型”。

圖4 基于COI基因片段鑒定草地貪夜蛾的亞型Fig.4 Identification of subtypes of S.frugiperda based on COI gene fragment

將測序得到的Tpi-SH序列與草地貪夜蛾“水稻型”和“玉米型”Tpi基因[12]序列進行比對,發(fā)現(xiàn)樣本Tpi-SH與“玉米型”Tpi基因序列一致,與“水稻型”Tpi基因序列存在9個堿基的差異(圖5),表明上海地區(qū)草地貪夜蛾種群屬于“玉米型”。

圖5 基于Tpi基因片段鑒定草地貪夜蛾的亞型Fig.5 Identification of subtypes of S.frugiperda based on Tpi gene fragment

3 結(jié)論與討論

利用草地貪夜蛾的標(biāo)記基因COI和Tpi可以快速對樣本進行分子鑒定,確定其物種及其亞型,這對于區(qū)分草地貪夜蛾與其他夜蛾,以及鑒定少量樣本或組織是否來源于草地貪夜蛾具有重要作用[25]。但是,草地貪夜蛾在遷飛擴散的過程中,兩個亞型種群之間可能會產(chǎn)生較為復(fù)雜的雜合個體,僅依靠一種或兩種標(biāo)記基因進行鑒定時,可能會存在誤差[26],因此,結(jié)合核糖體DNA(rDNA)、隨機擴增多態(tài)DNA(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)、微衛(wèi)星(Microsatellite)等分子標(biāo)記手段[27-29],能更準(zhǔn)確鑒定上海地區(qū)草地貪夜蛾亞型類別。

在長期的進化過程中,草地貪夜蛾分化出了“玉米型”和“水稻型”兩種亞型。兩種亞型的草地貪夜蛾在寄主尋找、取食偏好等方面已經(jīng)分化出了較大差異?！坝衩仔汀辈莸刎澮苟耆∈秤衩?、高粱等作物,而“水稻型”則嗜好水稻[30]。目前,我國所報道的草地貪夜蛾COI基因大部分為“水稻型”,Tpi基因大部分為“玉米型”,也有部分雜合型Tpi基因[31],本研究COI基因鑒定結(jié)果顯示,采集于玉米植株上的草地貪夜蛾屬于“水稻型”,而Tpi基因鑒定結(jié)果則為“玉米型”,這與我國之前對草地貪夜蛾分型的研究結(jié)果一致[26]。COI基因和Tpi基因?qū)Σ莸刎澮苟陙喰丸b定結(jié)果不一致的原因,一方面可能是COI基因與Tpi基因在細胞中的位置不同;另一方面,也存在COI基因和Tpi基因的部分位點已經(jīng)雜合的可能性。結(jié)合作者團隊近2年未在上海地區(qū)的水稻上監(jiān)測到草地貪夜蛾這一情況,認為上海地區(qū)的草地貪夜蛾更傾向于“玉米型”。但由于取樣地點、時間和取樣數(shù)目的局限性,并不能完全排除“水稻型”草地貪夜蛾已經(jīng)侵入上海地區(qū),且目前已經(jīng)在我國部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)了“水稻型”草地貪夜蛾[22,32]。另外,上海處于亞熱帶地區(qū),水稻種植面積大于玉米種植面積,因此更需要密切關(guān)注不同分型的草地貪夜蛾在上海地區(qū)的發(fā)生和為害特點,加強對其他潛在寄主作物上草地貪夜蛾為害的監(jiān)控,做好草地貪夜蛾的監(jiān)測和防控工作。