陳詩杰,曹越平

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240)

蘇云金芽孢桿菌廣泛分布于土壤中,國內(nèi)學(xué)者近年來從各地土壤樣品中分離得到對(duì)某些害蟲具有高毒力的Bt菌株,其殺蟲譜各異[9-11]。上海屬長江下游沖積平原,土壤類型以水稻土、潮土、濱海鹽土為主[12],目前對(duì)當(dāng)?shù)氐奶K云金芽孢桿菌資源的搜集工作鮮見報(bào)道。本研究以分離自上海地區(qū)土壤樣品中的Bt菌株為主要對(duì)象,通過伴孢晶體蛋白形態(tài)觀察、16S rDNA序列及cry基因類型鑒定和SDS-PAGE蛋白分析,并以草地貪夜蛾為受試?yán)ハx,篩選出具有高毒殺活性的Bt菌株,以期進(jìn)一步豐富蘇云金芽孢桿菌菌株的資源儲(chǔ)備,并為促進(jìn)Bt生物制劑的可持續(xù)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集與Bt菌株的分離

遴選上海市26個(gè)地區(qū)挖取地表下5—10 cm處土壤50 g,共計(jì)165份,記錄經(jīng)緯度、植被情況等采樣信息。預(yù)處理后利用NaAc-抗生素篩選法[13]進(jìn)行Bt菌株的分離,鏡檢觀察后根據(jù)采集地點(diǎn)和分離順序予以編號(hào)。菌株經(jīng)平板劃線增殖后制備成甘油菌保存。

1.2 蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白的形態(tài)觀察

將篩選到的Bt分離菌株劃線于1∕2 LB培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)72 h,每4 h定期涂片,石碳酸復(fù)紅染色后100×油鏡鏡檢,觀察晶體形態(tài)、大小、數(shù)量。

1.3 16S rDNA序列測定

從平板純培養(yǎng)物挑取單菌落提取總DNA,經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測其濃度后作為PCR反應(yīng)模板,引物為16S rDNA通用引物27F和1492R。20 μL PCR反應(yīng)體系如下:LA Taq(TaKaRa)0.2 μL,引物27F(10 μmol∕L)和1492R(10 μmol∕L)各1 μL,DNA模板1 μL,dNTP Mix 3.5 μL,Buffer II 4 μL,RNase-Free Water 5.3 μL。反應(yīng)程序如下:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化,連接pMD18-T載體(TaKaRa)后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌細(xì)胞(TaKaRa),挑取陽性克隆測序。將測序結(jié)果上傳至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì),根據(jù)分析比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)一步確定Bt菌株。

1.4 Bt分離菌株cry基因類型的鑒定

1.4.1 Bt質(zhì)粒的提取

Bt質(zhì)粒提取方法參見文獻(xiàn)[14]。

1.4.2cry基因類型的PCR-RFLP鑒定

以質(zhì)粒DNA為模板,利用Kuo等[15]和張杰等[16]根據(jù)cry基因序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)的通用型引物(共16對(duì)),對(duì)Bt分離菌株進(jìn)行cry1—3、cry5—9、cry11、cry18—22、cry30、cry32及cry40基因類型的鑒定。

財(cái)政事權(quán)與支出責(zé)任劃分，西方徹底分權(quán)的劃分模式中國目前不具備相應(yīng)的先決條件，應(yīng)在“中央決策、地方執(zhí)行”的框架下推進(jìn)，可考慮按照事權(quán)要素的劃分，中央決策、地方執(zhí)行，但是中央的決策權(quán)再進(jìn)一步細(xì)分，決策可分為“做什么”和“做到什么程度”，在“做什么”權(quán)力保留在中央政府的前提下，“做到什么程度”是可給地方的自主權(quán)。同時(shí)強(qiáng)化科學(xué)的績效考核機(jī)制，提升地方履行事權(quán)的效率和效果。

1.5 伴孢晶體蛋白的SDS-PAGE分析

挑取Bt單菌落置于10 mL LB液體培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)至形成伴孢晶體,取1 mL培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中超聲波破碎。取100 μL樣品,加入25 μL新配的0.5 mol∕L NaOH,25℃反應(yīng)5 min,加入50 μL 2×上樣緩沖液,100℃煮沸5 min,12 000 r∕min離心1 min,去沉淀,取10 μL上樣,130 V恒壓電泳,脫色后觀察蛋白條帶。

1.6 對(duì)草地貪夜蛾室內(nèi)殺蟲活性的測定

1.6.1 生測樣液的制備

挑取Bt單菌落于30℃、200 r∕min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)過夜,以1∶100比例轉(zhuǎn)接于1∕2 LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至大部分晶體釋放,12 000 r∕min離心收集孢晶混合物,用1 moL∕L冰冷的NaCl洗滌3次,再溶于無菌水中,并調(diào)整菌懸液濃度得到100倍液,于-70℃保存?zhèn)溆肹17]。

1.6.2 室內(nèi)殺蟲活性測定

草地貪夜蛾為室內(nèi)人工飼養(yǎng)[18];采用表面覆蓋法對(duì)飼料進(jìn)行處理,飼料中加入待測樣液后充分?jǐn)嚢杈鶆?室內(nèi)陰涼處晾干備用。

滅菌養(yǎng)蟲管中每管輕輕接入初孵幼蟲10頭,處理飼料2 g,3次重復(fù),以16 000 IU∕mg蘇云金桿菌粉劑處理為陽性對(duì)照,無菌水處理為陰性對(duì)照;置于適宜條件飼養(yǎng)[19],每日觀察蟲體和飼料情況,保證管內(nèi)清潔及透氣性。

培養(yǎng)72 h后調(diào)查死蟲數(shù),計(jì)算平均死亡率和校正死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 上海地區(qū)不同用地類型中Bt菌株的分離

對(duì)采集自上海市26個(gè)地區(qū)共計(jì)165份土壤樣品進(jìn)行處理,共分離得到芽孢桿菌610株,經(jīng)鑒定得到蘇云金芽孢桿菌50株,總檢出率為8.20%。如表1所示,不同用地類型的Bt檢出率有所差異。其中,采自吳涇工業(yè)區(qū)的土壤樣品檢出率最高,達(dá)21.62%;其次為寶山工業(yè)園區(qū),檢出率為5.41%;居民住宅區(qū)及兩大高架路段的樣品檢出率相對(duì)較低,均在4%以下。

表1 不同用地類型土壤樣品中Bt菌株的分離結(jié)果Table 1 Isolation results of Bt strains in soil samples of different land use types

2.2 Bt分離菌株伴孢晶體結(jié)構(gòu)的觀察

利用光學(xué)顯微鏡對(duì)50株芽孢桿菌進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)所含的伴孢晶體形態(tài)多數(shù)含有菱形、球形和不規(guī)則形3類,以球形晶體為主,其中菱形晶體12株,球形晶體33株,不規(guī)則晶體3株,分別占比24.0%、66.0%和6.0%。光學(xué)顯微鏡下觀察到的各晶體形態(tài)見圖1。

圖1 100×油鏡下觀察到的Bt分離菌株伴孢晶體形態(tài)Fig.1 Parasporal crystal morphology of the associated Bt strains observed under oil microscope(100×)

2.3 Bt菌株的16S rDNA鑒定分析

在對(duì)50株Bt分離菌株進(jìn)行16S rDNA序列測定中,將菌株XX2的16S rDNA基因序列提交NCBI后經(jīng)BLAST比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)其與已登錄的編號(hào)為KJ676099.1的蘇云金芽孢桿菌同源性最高,達(dá)到99%。將比對(duì)后同源性最高的6個(gè)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),可進(jìn)一步判斷菌株XX2為芽孢桿菌屬的蘇云金芽孢桿菌。

圖2 依據(jù)16S rDNA序列同源性構(gòu)建的Bt菌株XX2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Bt strain XX2 based on 16S rDNA sequence homology

2.4 Bt菌株的cry基因類型鑒定

利用PCR-RFLP體系對(duì)50株Bt菌株進(jìn)行cry基因類型鑒定,部分菌株P(guān)CR擴(kuò)增及酶切(PstI、XbaI)結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明:50株Bt菌株cry基因類型豐富,大部分菌株可成功擴(kuò)增出cry基因片段,且所含cry基因類別各有差異,包含cry1、cry3、cry8等共16種基因類型。其中,包含cry32類基因的菌株有31株,覆蓋度達(dá)62%;其次為包含cry8類基因的菌株有25株,覆蓋度達(dá)50%。對(duì)cry1類基因的酶切結(jié)果顯示,在第三等級(jí)水平下,鑒定出的cry1類基因主要有cry1Ab和cry1Ac,分別占含cry1類基因總菌數(shù)的58.83%和29.41%。部分分離菌株所含cry基因類型見表2。

圖3 cry1類基因的引物K5un2∕K3un2 PCR擴(kuò)增及酶切Fig.3 PCR amplification with primers K5un2∕K3un2 and digestion of cry1 gene

2.5 伴孢晶體蛋白的SDS-PAGE分析

如圖4所示,Bt分離菌株伴孢晶體蛋白的分子量大小從45 ku到130 ku不等,菌株大都表達(dá)130 ku蛋白。其中,菌株P(guān)D1表達(dá)約65 ku的蛋白;XX2與DX4表達(dá)50 ku、45 ku的蛋白;BS3與DX4菌株均表達(dá)80 ku蛋白;XX2、WJ3、PD1、DX4和WJ29菌株表達(dá)情況相似,均表達(dá)90 ku的蛋白。Bt菌株電泳帶型圖譜的不同,印證了Bt菌株的多樣性。

圖4 部分Bt分離菌株伴孢晶體蛋白的SDS-PAGE電泳分析Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis analysis of parasporal crystal protein of some Bt strains

2.6 對(duì)草地貪夜蛾室內(nèi)殺蟲活性的測定

利用50株Bt分離菌株對(duì)草地貪夜蛾一齡孵出幼蟲進(jìn)行室內(nèi)殺蟲活性測定,部分菌株測定結(jié)果見表2。菌株BS3與PD1對(duì)草地貪夜蛾的殺蟲活性最高,72 h處理其校正死亡率達(dá)到100%,菌株WJ3與DX4對(duì)草地貪夜蛾的校正死亡率達(dá)到90%以上,分別為93.13%與96.56%,屬于高毒力菌株,菌株XX2、WJ29對(duì)草地貪夜蛾的致死率在75%—90%,其余Bt菌株對(duì)草地貪夜蛾的殺蟲活性較低或沒有殺蟲活性。

表2 部分Bt分離菌株的cry基因類型及對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的殺蟲活性Table 2 Cry genotypes of some Bt isolates and their insecticidal activity against S.frugiperda larvae

3 討論

土壤是蘇云金芽孢桿菌主要的分布場所,本研究從上海市165份土壤樣品中共分離得到Bt菌株50株,不同用地類型的Bt分離率各有差異,依次是工業(yè)園區(qū)＞生態(tài)濕地＞交通主干道＞居民住宅區(qū),這可能與蘇云金芽孢桿菌所在的生態(tài)環(huán)境包括土壤pH、植被覆蓋度、空氣環(huán)境污染物等條件有關(guān)[20]。由于工業(yè)園區(qū)常進(jìn)駐制造加工業(yè)、石油化工業(yè)等產(chǎn)業(yè),長期以來可能對(duì)當(dāng)?shù)赝寥乐械闹亟饘俸?、氣體成分等造成一定影響[21]。蘇云金芽孢桿菌的分布與該類土壤環(huán)境之間的具體關(guān)系尚不明確[22-24],或許在環(huán)境治理、重金屬污染等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

蘇云金芽孢桿菌內(nèi)生質(zhì)粒豐富[14],不同的cry基因類型所編碼的殺蟲晶體蛋白具有不同的殺蟲活性,蛋白大小與形態(tài)通常也與cry基因類型存在關(guān)聯(lián)。對(duì)鱗翅目害蟲有毒殺活性的有cry1、cry2和cry9類基因所編碼的殺蟲晶體蛋白,多為130 ku、60—65 ku的菱形蛋白;cry3、cry8類基因的晶體蛋白對(duì)鞘翅目害蟲表現(xiàn)出高毒殺活性,多為130 ku、70 ku的球形蛋白;cry30、cry32類基因的晶體蛋白則對(duì)雙翅目害蟲表現(xiàn)出殺蟲活性,多表達(dá)130 ku的球形蛋白[4]。本研究通過PCR-RFLP體系對(duì)分離的50株Bt菌株進(jìn)行cry基因類型鑒定,結(jié)果顯示分離菌株涵蓋有cry1—3、cry5—9、cry11、cry18—22、cry30、cry32和cry40共16種基因類型,其中cry8、cry32兩類基因類型檢出比例較高,分別達(dá)到50%及62%,與光學(xué)顯微鏡下觀察到的以球形晶體蛋白為主的形態(tài)結(jié)果相吻合。

草地貪夜蛾已在多個(gè)國家經(jīng)歷化學(xué)農(nóng)藥及生物制劑的防治階段[25],對(duì)多種藥劑產(chǎn)生了不同程度抗性,且對(duì)表達(dá)cry1F蛋白的商業(yè)化Bt玉米‘TC1507’產(chǎn)生田間抗性[7-8],此外,對(duì)于連年種植的cry1Ab、cry1Ac等Bt玉米也存在產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)[26]。為篩選出高毒力Bt菌株,進(jìn)而開發(fā)穩(wěn)定的Bt產(chǎn)品,國外學(xué)者通過室內(nèi)篩選得到高毒力Bt菌株S1905與BR45,經(jīng)鑒定兩者含有cry1Aa、cry1Ab,cry1Ac、cry1B和cry2Aa等殺蟲基因[27-28]。李國平等[29]測定了幾種Bt蛋白對(duì)草地貪夜蛾初孵幼蟲的致死作用,以Vip3A和cry1Ab基因編碼的蛋白毒力較高。本研究通過室內(nèi)飼喂法篩選出對(duì)草地貪夜蛾殺蟲活性較高的6株Bt菌株,殺蟲活性均在75%以上,其中菌株XX2、WJ25、PD1和DX4均含有對(duì)鱗翅目具有殺蟲活性的cry類基因,如cry1Ab、cry1Ac等。其他菌株沒有檢測出相關(guān)基因,卻表現(xiàn)出對(duì)草地貪夜蛾的高殺蟲活性,尤其是菌株BS3,72 h處理的校正死亡率達(dá)到100%。由于蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)種類多樣[30],上述菌株是否存在對(duì)草地貪夜蛾敏感的殺蟲活性物質(zhì)如Vip3A蛋白、雙效菌素等,仍需要后期進(jìn)一步鑒定。另外,本研究在理論上驗(yàn)證了Bt分離菌株對(duì)草地貪夜蛾具有室內(nèi)殺蟲活性的可行性,與田間草地貪夜蛾幼蟲的生存環(huán)境還存在一定差異,故田間使用上述菌株時(shí)是否會(huì)產(chǎn)生同樣效果,尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。本試驗(yàn)所篩選的Bt菌株可為蘇云金芽孢桿菌資源的進(jìn)一步研究與利用提供參考。