王 浩 譚國(guó)慶 薛海鵬 徐展望△

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)2019級(jí)碩士研究生，山東 濟(jì)南 250035；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱骨科，山東 濟(jì)南 250035)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨量減少、骨密度減低、骨脆性增加，從而易發(fā)生骨質(zhì)減少性骨折乃至威脅生命的全身性疾病[1-2]。在人口老齡化形勢(shì)不斷加劇的情況下，OP的預(yù)防與治療成為人類(lèi)健康管理的重要研究方向?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療OP的藥物一般包括骨礦化促進(jìn)劑(鈣劑、維生素D)、骨吸收抑制藥(雙膦酸鹽、降鈣素)、骨形成促進(jìn)劑(氟制劑)，但其過(guò)高的費(fèi)用、較多的毒副作用等問(wèn)題難以解決[3]。隨著中醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中醫(yī)藥治療OP體現(xiàn)出不良反應(yīng)發(fā)生率低、辨證論治特異性強(qiáng)、多種療法相結(jié)合等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，得到了廣泛關(guān)注。

青娥丸最早見(jiàn)于《太平惠民和劑局方》，全方由杜仲、補(bǔ)骨脂、核桃仁、大蒜4味組成，方中杜仲溫補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋壯骨；補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎壯陽(yáng)，固精縮尿，溫脾止瀉；核桃仁補(bǔ)腎溫肺，潤(rùn)腸通便；大蒜溫中行滯，解毒消腫。全方共奏補(bǔ)腎強(qiáng)骨生髓之效，是治療OP的經(jīng)典名方?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，青娥丸有抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活動(dòng)、促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、增強(qiáng)骨的質(zhì)量和數(shù)量等多方面作用[4-5]。本研究基于生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，科學(xué)系統(tǒng)地探究青娥丸治療OP的作用機(jī)制，為該方在臨床應(yīng)用中提供理論支持，并進(jìn)一步探索中藥組方治療OP的新方向和新思路。

1 資料與方法

1.1 高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus，GEO)基因芯片數(shù)據(jù)分析OP差異表達(dá)基因 以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞檢索GEO中有關(guān)OP的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集，獲得滿足條件的編號(hào)為GSE100609的數(shù)據(jù)集，其中包含了4例從OP女性患者單核細(xì)胞中分離的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，4例屬于非OP女性單核細(xì)胞中分離的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞為對(duì)照組。利用生物信息學(xué)之RMA(robust multiarray average)算法背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理該數(shù)據(jù)集，利用R語(yǔ)言技術(shù)分析芯片數(shù)據(jù)，并結(jié)合P值和差異倍數(shù)(FC)進(jìn)行篩選，其中顯著差異基因的篩選條件為P< 0.05，logFC絕對(duì)值>0.5，最終獲得OP的差異表達(dá)基因。

1.2 OP疾病靶基因預(yù)測(cè) 以“osteoporosis”作為關(guān)鍵詞，采用疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)(DisGeNET)、人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards)、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM)、人類(lèi)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)(MalaCards)、遺傳藥理學(xué)與藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(PharmGKB)等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OP已知靶基因進(jìn)行檢索與篩選，合并各數(shù)據(jù)庫(kù)的疾病靶基因，將合并后的疾病靶基因與R語(yǔ)言技術(shù)分析芯片獲得的差異表達(dá)基因取并集，刪除重復(fù)的靶基因后，即獲得已明確的OP發(fā)病過(guò)程的疾病靶點(diǎn)。

1.3 青娥丸有效成分篩選及作用靶點(diǎn) 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)和中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(BATMAN-TCM)，檢索杜仲、補(bǔ)骨脂、核桃仁、大蒜4味中藥化學(xué)成分，TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類(lèi)藥性(drug likeness，DL)≥0.18作為篩選條件，BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)中以Score off≥20和P≤0.05作為篩選條件，篩選出青娥丸有效成分并將結(jié)果導(dǎo)入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Unitprot)進(jìn)行轉(zhuǎn)換處理，得到青娥丸有效成分的作用靶點(diǎn)。

1.4 映射靶基因獲取 將所篩選的青娥丸有效成分的作用靶點(diǎn)與OP疾病靶基因交叉生成Venny圖，得出青娥丸與OP的映射靶基因。

1.5 構(gòu)建“青娥丸藥物-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 將映射靶基因?qū)隒ytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“青娥丸藥物-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥?/p>

1.6 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI網(wǎng)絡(luò)圖) 抽取映射靶基因，借助Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建青娥丸治療OP的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度(Degree)值的大小排名順序進(jìn)行篩選，得到青娥丸治療OP的關(guān)鍵靶基因，所獲取的靶基因則是直接或間接調(diào)控發(fā)揮治療OP作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，揭示出青娥丸治療OP的關(guān)鍵機(jī)制。

1.7 基因本體(GO)生物過(guò)程及京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析 將映射靶基因?qū)牖蚬δ茏⑨寯?shù)據(jù)庫(kù)(DAVID)，進(jìn)行KEGG通路及GO生物過(guò)程的富集分析。以P≤0.05，F(xiàn)DR≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將篩選出的排名前20個(gè)GO條目借助R語(yǔ)言ggplot2包繪制富集分析氣泡圖，借助Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建映射靶基因在KEGG通路上的富集網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 OP相關(guān)差異表達(dá)基因檢索 通過(guò)OP差異表達(dá)基因分析結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)542個(gè)mRNA存在差異表達(dá)，其中上調(diào)188個(gè)，下調(diào)354個(gè)，用R語(yǔ)言中heatmap與limma程序包繪制芯片原始的差異基因熱圖與火山圖(見(jiàn)圖1、2)。

圖1 OP相關(guān)芯片差異基因聚類(lèi)圖

2.2 OP疾病靶基因篩選 通過(guò)DisGeNET、GeneCards、OMIM、MalaCards、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OP已知靶基因進(jìn)行檢索與篩選，合并后共獲得3576個(gè)疾病靶基因，將合并后的疾病靶基因與542個(gè)差異表達(dá)基因取并集并刪除重復(fù)值，獲得已明確的OP發(fā)病過(guò)程的疾病靶點(diǎn)共3811個(gè)。

2.3 青娥丸有效成分篩選及作用靶點(diǎn) 在TCMSP及BATMAN-TCM檢索到4味中藥活性成分共計(jì)48個(gè)，相對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)共計(jì)1757個(gè)，刪除重復(fù)值后得到青娥丸最終靶點(diǎn)973個(gè)。

2.4 映射靶基因獲取 將所篩選的青娥丸973個(gè)靶基因與2.2獲取的3811個(gè)OP疾病靶基因交叉生成Venny圖(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html，見(jiàn)圖3)，通過(guò)Venny圖可以直觀發(fā)現(xiàn)青娥丸對(duì)OP靶基因映射率為10%。該方共有973個(gè)有效靶點(diǎn)，其中映射靶點(diǎn)433個(gè)，作為青娥丸治療OP的直接或間接作用靶基因，占該方作用靶點(diǎn)的44.5%左右，表明該復(fù)方在治療OP方面具有顯著特異性。

圖2 OP相關(guān)芯片差異基因火山圖

圖3 “青娥丸-OP”映射靶基因Venny圖

2.5 青娥丸藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及分析 借助Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“青娥丸藥物-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖4)。按照Degree值排名順序排名前4位的有效成分為：β-谷甾醇、豆甾醇、異補(bǔ)骨脂素、槲皮素，這4種有效成分與多個(gè)作用靶點(diǎn)相互關(guān)聯(lián)，說(shuō)明這些化合物是青娥丸治療OP的主要有效成分。

圖4 青娥丸藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及分析 將433個(gè)映射靶基因?qū)隒ytoscape3.7.2軟件，根據(jù)Degre值≥45為篩選條件，得到排名前27位的映射靶基因?yàn)榍喽鹜柚委烵P的關(guān)鍵靶基因，并構(gòu)建青娥丸治療OP的關(guān)鍵靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖5)，所獲取的靶基因則是直接或間接調(diào)控發(fā)揮治療OP作用的關(guān)鍵靶基因，揭示出青娥丸治療OP的關(guān)鍵機(jī)制。

圖5 青娥丸治療OP關(guān)鍵靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 GO生物過(guò)程及KEGG通路富集分析 對(duì)2.4獲得的映射靶基因采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO生物過(guò)程和KEGG信號(hào)通路分析，得到分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞成分條目188個(gè)，KEGG通路118條，以P≤0.05，F(xiàn)DR≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，并以P值升序排列，分別篩選出符合條件的20個(gè)生物過(guò)程和20條信號(hào)通路，并將GO生物過(guò)程以氣泡圖的形式展現(xiàn)出來(lái)(見(jiàn)圖6)，將KEGG通路以表格形式展現(xiàn)出來(lái)(見(jiàn)表1)，并借助Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建映射靶基因在KEGG通路上的富集網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖7)。

圖6 青娥丸治療OP映射靶基因的GO生物過(guò)程氣泡圖

表1 青娥丸治療OP的KEGG富集通路

圖7 青娥丸治療OP映射靶基因在KEGG通路上的富集網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

隨著近年來(lái)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)OP機(jī)制的認(rèn)識(shí)，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，中藥復(fù)方青娥丸防治OP在臨床和實(shí)驗(yàn)中均取得了一定成果[1]。經(jīng)活性物質(zhì)篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，青娥丸具有諸多活性物質(zhì)協(xié)同作用調(diào)控OP進(jìn)程。植物甾醇作為一種天然活性成分，廣泛存在于各種植物中，超過(guò)250種被學(xué)者研究報(bào)道，以β-谷甾醇、豆甾醇(stigmasterol)最常見(jiàn)[2]，其生理功能包括抗高脂血癥、抗癌、抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等諸多方面[3]。植物甾醇通過(guò)抑制小腸對(duì)膽固醇的吸收來(lái)調(diào)節(jié)脂代謝，脂代謝異常引起肥胖可影響骨凋亡、骨形成、骨分化、骨微循環(huán)、骨吸收等多條信號(hào)通路的改變[4]。異補(bǔ)骨脂素(angelicin)是補(bǔ)腎中藥補(bǔ)骨脂有效成分之一，通過(guò)激活骨礦化過(guò)程激活成骨細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)骨代謝，預(yù)防骨質(zhì)疏松。張軍芳等[5]經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)初步證明了異補(bǔ)骨脂素及鋅制劑共同作用能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化。進(jìn)一步試驗(yàn)表明，異補(bǔ)骨脂素在1×10-5mol/L濃度時(shí)能最大程度使大鼠成骨細(xì)胞增殖分化成熟，顯著提高細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)，增加鈣含量，促進(jìn)骨鈣素分泌[6]。補(bǔ)骨脂另一成分補(bǔ)骨脂酚(backuchiol)對(duì)于去勢(shì)導(dǎo)致的雄性小鼠OP有較好治療作用[7]，對(duì)雌激素受體(ER)α同樣具有很強(qiáng)的結(jié)合親和力，減少絕經(jīng)后骨質(zhì)流失[8]。研究表明，補(bǔ)骨脂酚干預(yù)OP的可能機(jī)制為抑制蛋白激酶B(Akt)和激活蛋白-1(AP-1)途徑改善巨噬細(xì)胞刺激集落因子(M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和骨吸收[9]。槲皮素(quercetin)作為經(jīng)典的抗衰老活性成分，能有效清除衰老的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的增殖，刺激成骨細(xì)胞活性，改善骨質(zhì)狀態(tài)及結(jié)構(gòu)[10]。槲皮素以其雌激素拮抗劑活性在絕經(jīng)后OP治療中應(yīng)用廣泛，臨床OP常規(guī)治療基礎(chǔ)上，補(bǔ)充槲皮素明顯改善骨密度、疼痛、骨代謝等指標(biāo)[11]。青蛾丸具有肝腎同調(diào)、精血并補(bǔ)功效，組方中藥富含多種活性成分，能同時(shí)影響骨代謝和骨吸收過(guò)程，對(duì)于改善慢性疼痛、骨丟失具有重要作用。

通過(guò)靶點(diǎn)映射發(fā)現(xiàn)，大量靶點(diǎn)共同存在于青娥丸及OP，且部分靶基因同時(shí)存在于諸多活性物質(zhì)及通路，說(shuō)明青娥丸通過(guò)調(diào)控復(fù)雜靶基因網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同各活性物質(zhì)共同發(fā)揮作用。胰島素(INS)為典型降血糖成分，INS缺乏易引起糖脂代謝紊亂，導(dǎo)致體內(nèi)鈣、磷元素代謝失調(diào),使骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，加速OP進(jìn)程[12]。INS一方面作用于成骨細(xì)胞表面受體，上調(diào)成骨細(xì)胞活性；另一方面調(diào)節(jié)血糖水平，抑制高糖對(duì)成骨細(xì)胞的毒性作用[13]。諸多研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖不僅對(duì)成骨細(xì)胞具有毒性作用，同時(shí)破骨細(xì)胞骨吸收活動(dòng)對(duì)于葡萄糖具有依賴(lài)性，破骨細(xì)胞在7～25 mmol/L濃度時(shí)使骨吸收最活躍[14-15]，因此推測(cè)INS是青娥丸在糖尿病性O(shè)P臨床治療中具有良好療效的關(guān)鍵基礎(chǔ)靶基因。OP發(fā)生的根本原因是成骨與破骨之間平衡失調(diào)，而蛋白激酶B1(Akt1)正是控制這種平衡的傳導(dǎo)中間體，調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的成熟分化[16]。而且Akt1不同表達(dá)程度也會(huì)產(chǎn)生不同生理作用，Tu Q S等[17]使用脂聯(lián)素下調(diào)Akt1活性來(lái)抑制破骨細(xì)胞作用，而當(dāng)Akt1過(guò)度表達(dá)時(shí)又成功逆轉(zhuǎn)了對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制作用。在成骨方面,地塞米松能間接活化Akt1誘導(dǎo)成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的凋亡,而使用Akt1抑制劑能明顯降低成骨細(xì)胞凋亡[18]。白細(xì)胞介素6(IL-6)是生物學(xué)效應(yīng)廣泛的細(xì)胞炎癥因子，廣泛參與破骨細(xì)胞分化，最近數(shù)據(jù)顯示IL-6尤其在絕經(jīng)期后OP婦女中顯著增加[19]。有關(guān)臨床數(shù)據(jù)表明，雌激素較低時(shí)OP患者IL-6水平會(huì)高達(dá)210.0 ng/L[20]，進(jìn)一步證明了IL-6在絕經(jīng)后OP發(fā)病過(guò)程中的重要作用，其具體作用機(jī)制可能為絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素水平下降，導(dǎo)致雌激素抑制成骨細(xì)胞生成腫瘤壞死因子α(TNF-α)能力減弱，TNF-α的增加進(jìn)一步刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，進(jìn)而發(fā)揮抑制成骨、促進(jìn)破骨的作用[21]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)一方面通過(guò)血管構(gòu)建對(duì)骨組織進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)供給，增加骨量和治療OP[22]；另一方面通過(guò)血管構(gòu)建，維持骨組織穩(wěn)定氧環(huán)境，抑制因缺氧分泌的炎癥因子進(jìn)一步加快骨流失。最重要的是VEGF能產(chǎn)生成骨性生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖分化及破骨細(xì)胞活性[23]。綜上所述，眾多關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用，產(chǎn)生復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控炎性反應(yīng)及糖脂代謝等諸多相關(guān)生理過(guò)程，這可能是青蛾丸干預(yù)OP的可能內(nèi)在機(jī)制。

依托DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因可視化。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)諸多通路關(guān)于各種癌癥，癌癥相關(guān)通路普遍見(jiàn)于OP的諸多通路研究之中，癌癥患者不僅因自身病變引起代謝異常而面臨原發(fā)性O(shè)P的風(fēng)險(xiǎn)，而且還可能因特別是削弱性腺功能的相關(guān)治療引起繼發(fā)性O(shè)P[24]。研究顯示，性激素剝奪治療的前列腺及乳腺癌患者骨量丟失尤其明顯[25]，臨床數(shù)據(jù)顯示前列腺癌去勢(shì)治療后OP患病率為37%。去勢(shì)治療后降低雄激素，經(jīng)芳香化而來(lái)的雌激素也隨之減少，進(jìn)而破骨細(xì)胞增殖，活性上調(diào)，骨吸收增強(qiáng)[26]，因此在延長(zhǎng)壽命治療同時(shí)也應(yīng)及時(shí)糾正骨量丟失。有研究顯示，選擇性抑制破骨細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達(dá)，能減弱破骨細(xì)胞活性，骨吸收減少，改善骨量[27]。除改善骨代謝外，HIF-1一方面能調(diào)節(jié)組織、細(xì)胞適應(yīng)低氧或缺氧環(huán)境，缺氧對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的骨形成能力起到抑制作用[28]；另一方面，HIF-1也能調(diào)控血管生成構(gòu)建，與VEGF協(xié)同作用促進(jìn)骨血管為骨組織提供氧、營(yíng)養(yǎng)、激素、細(xì)胞因子等物質(zhì)[29]。越來(lái)越多證據(jù)表明，肝臟與骨之間有著復(fù)雜聯(lián)系，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)更是能夠通過(guò)多條通路影響骨骼發(fā)育成熟。臨床研究表明，NAFLD患者腰椎、髖部等部位的骨密度(BMD)明顯下降[30]。同時(shí),NAFLD與絕經(jīng)后女性BMD關(guān)系更密切，NAFLD被認(rèn)為是OP的高危因素。NAFLD從肝纖維化、胰島素抵抗(IR)、脂肪因子、胃饑餓素等多個(gè)方面對(duì)BMD產(chǎn)生影響。研究認(rèn)為，脂毒性更易引起低骨量和OP, 膽固醇及其代謝產(chǎn)物能影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性，降低BMD?；谝陨戏治?，青娥丸通過(guò)調(diào)控平衡多種細(xì)胞因子及代謝干預(yù)OP，尤其在性激素代謝方面調(diào)控作用顯著，推測(cè)這是臨床治療絕經(jīng)后OP療效顯著的原因。

本研究基于生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)手段，篩選青娥丸有效活性物質(zhì)及作用靶點(diǎn)，并與OP相關(guān)疾病靶點(diǎn)映射分析獲得關(guān)鍵靶基因，通過(guò)基因可視化尋找青娥丸可能作用通路，相對(duì)科學(xué)可靠地預(yù)測(cè)青娥丸干預(yù)OP的分子作用機(jī)制，為青娥丸的應(yīng)用及OP的防治提供新思路。但這種信息整合的可靠性依托數(shù)據(jù)庫(kù)的信息準(zhǔn)確與否，具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步試驗(yàn)研究的驗(yàn)證。