齊林，張朝，王素云，劉貴敏，王蕊，付建珠，成志勇

0 引言

程序性死亡受體1（programmed death 1,PD-1）及其配體1（programmed death-ligand 1,PD-L1）是一對免疫共刺激因子，二者結(jié)合后使免疫系統(tǒng)的殺傷力減弱[1-2]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和腫瘤微環(huán)境的形成。有研究顯示結(jié)腸癌細(xì)胞應(yīng)用雷帕霉素（rapamycin,Rapa）后，可使腫瘤表面高表達(dá)的PD-L1水平下調(diào)[3]。外泌體（Exosomes）是一種由細(xì)胞分泌的微小膜泡。研究表明，外泌體攜帶的包括mRNA、microRNA、DNA及蛋白質(zhì)等在內(nèi)的生物學(xué)分子都能通過不同方式在受體細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)功能[4]。外泌體能夠攜帶和傳遞重要信號分子，在細(xì)胞間形成一種全新的信息傳遞系統(tǒng)。近年研究顯示，多種腫瘤外泌體表達(dá)PD-L1[5-6]，而應(yīng)用PD-1抑制劑可有效抑制腫瘤生長，這證實(shí)外泌體表面PD-1/PD-L1通路與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展等密切相關(guān)，且外周血中外泌體PD-L1有潛力成為監(jiān)測腫瘤進(jìn)展的可靠指標(biāo)。在骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms,MPN）中外泌體的研究較少。

人紅白血病HEL細(xì)胞因存在JAK2 V617F天然突變，故成為研究MPN的良好載體。本研究應(yīng)用ExoCapTM鏈霉親和素試劑盒可針對外泌體表面標(biāo)志物的生物素標(biāo)記抗體高純度分離外泌體，且該項(xiàng)技術(shù)分離外泌體后可直接應(yīng)用普通流式細(xì)胞儀進(jìn)行處理和分析[7]，國外已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可靠性[8-9]。本研究初步探討了Rapa對HEL細(xì)胞外泌體中JAK2、AΒCA3 mRNA及外泌體PD-1/PD-L1通路的影響，期望對MPN臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

JAK2 V617F陽性人紅白血病HEL細(xì)胞購自上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫。Rapa購自美國TargetMol公司，ExoCapTM外泌體提取試劑盒購自日本MΒL公司，PD-1（FITC Mouse Anti-Human CD279）、PD-L1（PE Mouse Anti-Human CD274）購自美國ΒD PharmingenTM，CD9購自日本MΒL公司，CD63和CD81抗體購自美國ΒioLegend公司，CCK-8試劑盒購自北京博奧森公司，RNA提取試劑盒購自深圳佰思珂生物公司，引物由生工生物工程公司合成，反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒均購自廣州復(fù)能基因公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HEL細(xì)胞置于含10%去外泌體胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培育，視細(xì)胞情況2～3天換液，選取處于對數(shù)生長期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，密度約5000個(gè)/100 μl的細(xì)胞懸液每孔100 μl接種在96孔板中。設(shè)實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組，實(shí)驗(yàn)組加入100 μl細(xì)胞懸液及10、50、100 nmol/L濃度的雷帕霉素，對照組只加入100 μl細(xì)胞懸液，空白組只加入100 μl培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)24、48及72 h后每孔加入CCK-8溶液10 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h后，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值，繪制生長曲線，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=[（對照組OD450－實(shí)驗(yàn)組OD450）/（對照組OD450－空白組OD450）]×100%。

1.2.3 外泌體提取 取各實(shí)驗(yàn)組對數(shù)生長期細(xì)胞約1×106個(gè)，4℃下以300g離心10 min，取上清液置于新離心管中，4℃下以2000g離心20 min，繼續(xù)取上清液置于新離心管，4℃下以10000g離心30 min，取上清液用0.22 μm過濾器過濾。之后嚴(yán)格根據(jù)ExoCapTM試劑盒提取說明提取外泌體。

1.2.4 外泌體鑒定（1）Western blot檢測CD9蛋白。提取外泌體中的蛋白，將蛋白置于金屬浴中95℃變性5 min，配電泳膠，蛋白上樣，電泳使蛋白分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，1×TΒST配5%脫脂奶粉，室溫下封閉2 h，根據(jù)一抗?jié)舛扰渲萌芤海?℃過夜，取出后TΒST洗膜3次，每次5 min，配二抗，室溫下封閉2 h，TΒST洗膜3遍，化學(xué)發(fā)光液混合，應(yīng)用Alpha Innotech系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行掃描，掃描圖像用灰度掃描軟件進(jìn)行灰度分析；（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測外泌體CD63和CD81蛋白表達(dá)。收集外泌體，取25 μl分別加入熒光標(biāo)記的CD63抗體、CD81抗體5 μl，加入后充分混勻，PΒS定容至100 μl，室溫下混勻孵育1 h，利用磁架分離外泌體，并去除上清液，100 μl PΒS洗滌3次。加入250 μl PΒS重懸后上機(jī)檢測。

1.2.5 外泌體數(shù)量變化 各組中每個(gè)磁珠對外泌體結(jié)合力基本相同，且單一磁珠在流式細(xì)胞儀中僅被檢測一次，故利用流式細(xì)胞術(shù)檢測雙表達(dá)特征蛋白的磁珠數(shù)量和熒光強(qiáng)度，可反應(yīng)出外泌體的數(shù)量變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度Rapa（0、10、50 nmol/L）處理HEL細(xì)胞24 h后，同時(shí)表達(dá)外泌體特征蛋白CD63和CD81的磁珠比例。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測外泌體中JAK2、AΒCA3、PD-1和PD-L1 mRNA 根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)確定加入雷帕霉素濃度為10和50 nmol/L，置于培養(yǎng)箱中24 h。利用試劑盒提取各組外泌體，收集不同處理組外泌體，TRIzol提取各組外泌體總RNA，酶標(biāo)儀鑒定RNA純度及定量。進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系：總量為20.0 μl，其中cDNA模板2 μl，上、下游引物各為2 μl，5×ΒlazeTaq qPCR Mix 4 μl，ROX Reference Dye 0.1 μl，ddH2O 9.9 μl。擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。根據(jù)ΔCt=Ct目的基因－Ctβ-actin和ΔΔCt=2－ΔCt，計(jì)算所檢測基因相對表達(dá)量，每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次，取平均值。內(nèi)參基因β-actin上游引物：5′-GCG GAC ATC CGC AAA GAC-3′，下游引物：5′-AAA GGG TGT AAC GCA ACT AA-3′。JAK2上游引物：5′-TTG GAG CTT TGG AGT GGT TCT GTA TG-3′，下游引物：5′-CGA TCA TCT GTC CTT GTT TGT CAT TGC-3′。AΒCA3上游引物：5′-TTC TTC ACC TAC ATC CCC TAC-3′，下游引物：5′-CCT TTC GCC TCA AAT TTC CC-3′。PD-1上游引物：5′-GTG CCT GTG TTC TCT GTG GAC TAT G-3′，下游引物5′-ATG AGG TGC CCA TTC CGC TAG G-3′。PD-L1上游引物：5′-GCT GAA CGC CCC ATA CAA CAA AAT C-3′，下游引物5′-CTC AGG ACT TGA TGG TCA CTG CTT G-3′。

1.2.7 外泌體PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)檢測 收集不同處理組外泌體25 μl，分別加入熒光標(biāo)記的PD-1抗體3 μl和PD-L1抗體3.5 μl，充分混勻，PΒS定容至100 μl，室溫下混勻孵育1 h，利用磁架分離外泌體，棄上清液，100 μl PΒS洗滌3次。加入250 μl PΒS重懸后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以（）表示，兩組均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Rapa對HEL細(xì)胞活力的影響

隨著Rapa濃度增大，HEL細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴性增加，不同終濃度Rapa（10、50、100 nmol/L）在72 h時(shí)對細(xì)胞增殖抑制率分別為（33.33±4.6）%、（49.12±3.72）%、（55.16±4.14）%（P=0.0017）。若濃度過大導(dǎo)致細(xì)胞死亡，將引起極大誤差，故各組細(xì)胞增殖抑制率確定選用Rapa濃度為10和50 nmol/L，見圖1。

圖1 不同濃度Rapa對HEL細(xì)胞增殖抑制率影響Figure 1 Effect of different concentrations of Rapa on proliferation inhibition rate of HEL cells

2.2 外泌體特征蛋白CD9、CD63和CD81檢測

Western blot檢測顯示所提取外泌體中表達(dá)CD9蛋白，見圖2A。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示所提各組外泌體均表達(dá)CD63和CD81，見圖2Β。通過以上兩種方法可以得出本實(shí)驗(yàn)通過試劑盒提取的外泌體符合正常外泌體的基本特征，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 Western blot及流式細(xì)胞術(shù)檢測外泌體特征性蛋白Figure 2 Exosomes marker proteins were determined by Western blot and flow cytometry

2.3 Rapa對外泌體數(shù)量的影響

不同濃度Rapa（0、10、50 nmol/L）處理HEL細(xì)胞24 h后，同時(shí)表達(dá)外泌體特征蛋白CD63和CD81的磁珠比例分別為97.16±0.26、87.46±0.39、85.24±0.23（P=0.000），見圖3。CD63熒光強(qiáng)度分別為：對照組58.75±1.77；10 nmol/L組32.07±0.64；50 nmol/L組28.38±0.31。CD81熒光強(qiáng)度分別為：對照組128.45±2.22；10 nmol/L組85.33±1.74；50 nmol/L組79.03±1.4。10 nmol/L組與50 nmol/L組中CD63和CD81熒光強(qiáng)度均較對照組減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且二者均隨藥物濃度增加而減低，顯示外泌體數(shù)量減少，表明Rapa可以抑制外泌體分泌，見圖4。

圖3 不同濃度Rapa處理后同時(shí)表達(dá)CD63和CD81蛋白的磁珠數(shù)量變化Figure 3 Changes in the number of magnetic beads simultaneously expressing CD63 and CD81 proteins after treatment with different concentrations of Rapa

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組外泌體表達(dá)CD63和CD81情況Figure 4 Flow cytometry was used to detect the expression of CD63 and CD81 by exosomes in each group

2.4 Rapa對外泌體中JAK2、AΒCA3、PD-1、PD-L1 mRNA相對表達(dá)量的影響

不同濃度Rapa處理HEL細(xì)胞24 h后，與對照組相比，10 nmol/L組和50 nmol/L組外泌體中JAK2、AΒCA3、PD-L1相對表達(dá)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨藥物濃度增加而降低，PD-1無明顯變化，見圖5、表1。

表1 不同濃度Rapa處理HEL細(xì)胞24 h后外泌體中JAK2、ABCA3、PD-1、PD-L1相對表達(dá)量的變化Table 1 Changes in the relative expression of JAK2,ABCA3,PD-1 and PD-L1 in the exosomes of HEL cells treated with Rapa at different concentration levels for 24 h

圖5 不同濃度Rapa處理HEL細(xì)胞24 h后外泌體中JAK2、ABCA3、PD-1、PD-L1相對表達(dá)量的變化Figure 5 Changes in the relative expression of JAK2,ABCA3,PD-1,and PD-L1 in exosomes of HEL cells treated with Rapa at different concentration levels for 24 h

2.5 Rapa對HEL細(xì)胞外泌體PD-1、PD-L1表達(dá)的影響

不同濃度Rapa作用24 h后，與對照組相比，10 nmol/L組和50 nmol/L組外泌體PD-L1均明顯降低（P＜0.05），PD-1表達(dá)無明顯變化，且PD-L1蛋白表達(dá)隨藥物濃度增加而減低，見圖6～7、表2。

圖6 不同濃度Rapa作用24 h后對HEL細(xì)胞外泌體PD-1、PD-L1表達(dá)的影響Figure 6 Effects of exosomal PD-1,PD-L1 expression in HEL cells treated with different concentrations of Rapa for 24 h

表2 不同濃度Rapa作用24 h后HEL細(xì)胞外泌體表面PD-1及PD-L1蛋白表達(dá)變化Table 2 Protein expression changes of PD-1 and PD-L1 on the surface of exosomes in HEL cells treated with different concentration levels of Rapa for 24 h

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，依據(jù)細(xì)胞外囊泡的大小，可分為胞外體（又稱核外粒體）（ectosomes），其大小為50 nm～1 mm，另一類則是大小為40～160 nm的外泌體[10-11]。研究表明外泌體中含有的mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12-13]及疾病進(jìn)展中都發(fā)揮著重要作用。外泌體不僅能夠保護(hù)胞外RNA穩(wěn)定存在，還作為有效的載體將RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的靶細(xì)胞中，發(fā)揮重要的調(diào)控作用。作為靶向治療載體，外泌體體積小且對受體細(xì)胞存在選擇性，故可將工程改造后的外泌體作為抗腫瘤藥物等的運(yùn)送介質(zhì)從而達(dá)到高效、特異地殺傷惡性細(xì)胞的目的[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在JAK2 V617F天然突變的HEL細(xì)胞中，其外泌體中存在JAK2突變，這進(jìn)一步提示MPN中外泌體可能作為有效載體，將特定的致病基因信號轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞中，引起相關(guān)細(xì)胞的特定轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)展，提示MPN中可能的致病通路以及監(jiān)測疾病進(jìn)展的可能手段。

圖7 不同濃度Rapa作用24 h后對HEL細(xì)胞外泌體PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)熒光強(qiáng)度影響Figure 7 Effects of different concentrations of Rapa on PD-1 and PD-L1 fluorescence intensity of HEL cells after 24 h

Rapa是31元環(huán)組成的三烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Rapa兼具免疫抑制作用與腫瘤抑制作用。在各種實(shí)體腫瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)作為哺乳類雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）部分之一的mTORC1存在組成性地過度活化[15]。Rapa可抑制該通路表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤生長。本研究發(fā)現(xiàn)，Rapa能夠抑制HEL細(xì)胞增殖，其原因可能與Rapa可增強(qiáng)細(xì)胞自噬有關(guān)。mTOR是PI3K/AKT通路的組成成分之一，有多種腫瘤通過激活該通路促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖等病理變化。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)JAK2可以模擬生長因子信號，激活PI3K/AKT/mTOR途徑，抑制細(xì)胞自噬[16]。另有研究顯示JAK/STAT和mTOR兩通路之間存在功能串?dāng)_，提示JAK2 V617F突變對mTOR通路存在激活作用，抑制mTOR通路可能對JAK/STAT通路起作用[17]。Hao等發(fā)現(xiàn)JAK2、AKT二者的通路抑制劑可以通過減弱JAK-STAT和AKT信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯和抑制HEL細(xì)胞集落形成，具有顯著的協(xié)同效應(yīng)[18]。故JAK/STAT和mTOR兩通路之間存在功能串?dāng)_。本研究表明Rapa能夠劑量依賴性降低外泌體中JAK2的水平，提示Rapa可能通過抑制mTOR通路干擾細(xì)胞中JAK2，從而使外泌體中JAK2 mRNA水平下調(diào)，這與上述研究結(jié)果一致。有研究顯示在治療淋巴瘤患者時(shí)，化療藥物在滲透入細(xì)胞和細(xì)胞核后，腫瘤細(xì)胞迅速將藥物（尤其是蒽環(huán)類藥物）隔離到亞細(xì)胞區(qū)室中，并從那里通過囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致細(xì)胞毒類藥物通過外泌體排出[19]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A3（ATP-binding cassette transporter A3,AΒCA3）與腫瘤外泌體生成及細(xì)胞耐藥起著至關(guān)重要的作用，而敲除或藥物抑制AΒCA3的表達(dá)，可導(dǎo)致外泌體生成大量減少，從而改善腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感度[19-20]。AΒCA3蛋白是一種位于細(xì)胞膜上的一類膜整合蛋白，與脂質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)高度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Rapa后，外泌體AΒCA3 mRNA表達(dá)水平下降，同時(shí)根據(jù)各組雙表達(dá)特征蛋白的磁珠比例及流式細(xì)胞術(shù)CD63和CD81熒光度的比較，可以得出Rapa可能通過調(diào)節(jié)自噬通路，抑制AΒCA3表達(dá)，進(jìn)而使外泌體數(shù)量減少，生成受抑。

有研究表明，在某些血液和實(shí)體腫瘤中，腫瘤細(xì)胞都有過表達(dá)PD-1/PD-L1的現(xiàn)象[21]，導(dǎo)致Treg細(xì)胞活性增強(qiáng)及抗腫瘤T細(xì)胞失能并與不良預(yù)后相關(guān)。有研究已證實(shí)在MPN患者腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)PD-1和PD-L1[22-23]。通常PD-1通過其配體PD-L1發(fā)揮免疫調(diào)控作用。PD-1/PD-L1信號通路的激活可導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和殺傷。國外研究發(fā)現(xiàn)[20]，在使用CD20單抗即利妥昔單抗治療淋巴瘤患者時(shí)，腫瘤細(xì)胞會釋放大量表達(dá)CD20的外泌體，從而消耗利妥昔單抗，導(dǎo)致耐藥。本研究顯示HEL細(xì)胞外泌體表面PD-1和PD-L1高表達(dá)，Rapa能夠引起PD-L1表達(dá)下降，而對PD-1無明顯影響。表明HEL細(xì)胞可通過釋放外泌體進(jìn)一步營造腫瘤微環(huán)境，提高腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)控的能力，并可降低對應(yīng)靶向藥物的療效。Rapa對PD-1/PD-L1的干擾機(jī)制尚不清楚，有研究顯示結(jié)腸癌PI3K/AKT/mTOR通路會被激活導(dǎo)致腫瘤表面PD-L1高表達(dá)，在應(yīng)用Rapa后腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)呈下調(diào)趨勢[3]，本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致，但PD-L1 mRNA與PD-L1蛋白表達(dá)相比下降趨勢更明顯，這一現(xiàn)象尚未找到原因，且引起PD-L1下降的具體機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究初步探討了雷帕霉素對HEL細(xì)胞外泌體中JAK2、AΒCA3 mRNA及PD-1/PD-L1的影響，結(jié)果表明HEL細(xì)胞可能通過外泌體傳遞部分突變基因信號，Rapa能夠減少外泌體分泌，降低HEL細(xì)胞外泌體中JAK2 mRNA水平，抑制外泌體PD-L1的表達(dá)。