于姣姣，查莉，曾書娥

0 引言

肝癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全球肝癌的發(fā)病率占所有癌癥的第6位，死亡率占第4位[1]。肝癌是一種高度致命的惡性腫瘤，它的發(fā)病率與死亡率大致相當(dāng)[2]。除手術(shù)外，化療、免疫治療及抗血管生成治療等也是臨床上常用的藥物治療方法，但各類藥物的不良反應(yīng)及耐藥性的產(chǎn)生也是臨床亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用超聲微泡介導(dǎo)肝癌的靶向治療成為研究的熱點(diǎn)，并有望為肝癌患者提供一種更安全、有效的治療方法。本文將對(duì)超聲微泡在肝癌治療中的應(yīng)用研究綜述如下。

1 超聲微泡

常見(jiàn)的超聲微泡一般由外膜和其包裹的氣體構(gòu)成，外膜材料主要為脂質(zhì)類、高分子材料類、蛋白類以及非離子表面活性劑類等，這些材料構(gòu)成的外膜不僅能夠防止氣體逸出，還能阻止微泡間的相互融合。微泡包裹的氣體主要為高分子氣體或惰性氣體（如氟碳?xì)怏w等），穩(wěn)定的氣體核心，不僅具有更好的超聲散射和反射效果，同時(shí)也能安全的從肺內(nèi)排出，消除體內(nèi)殘留的隱患。傳統(tǒng)微泡粒徑通常在1～8 μm，在超聲波激發(fā)下，能夠增強(qiáng)組織回聲，提高組織顯影。目前還有納米級(jí)的微泡[3-4]，是一種含納米級(jí)別氣泡的混懸液，如液態(tài)氟碳微泡，它不僅具備粒徑小、穩(wěn)定性好、循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)的特點(diǎn)，而且有無(wú)毒性、生物相容性好等諸多優(yōu)勢(shì)，還可以用作靶向分子探針[5]。納米微泡作為藥物或基因的載體，較微米級(jí)微泡具有更強(qiáng)的穿透力，能透過(guò)血管內(nèi)皮間隙，滲入到腫瘤的空隙中，能夠在體內(nèi)存在足夠長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間；納米微泡表面更容易被修飾，從而有效地聚集到腫瘤中，對(duì)病變部位表現(xiàn)出更強(qiáng)的靶向能力，減少對(duì)周圍正常組織的損傷，增強(qiáng)治療的效果[6-7]。目前臨床上使用的微泡造影劑主要為微米級(jí)，能自由通過(guò)肺循環(huán)，但不能穿透血管內(nèi)皮，主要用于顯影來(lái)診斷腫瘤等疾病。納米微泡是目前超聲微泡發(fā)展的研究熱點(diǎn)。

2 超聲微泡介導(dǎo)基因或藥物的治療機(jī)制

超聲微泡載基因或藥物的方式主要有以下幾種[8]：（1）附著于微泡表面；（2）包裹于微泡內(nèi)部；（3）直接成為微泡的外膜材料之一；（4）嵌入雙分子層的微泡內(nèi)外膜之中；（5）利用靜電的相互作用，被非供價(jià)結(jié)合至微泡表面。攜帶藥物或基因的超聲微泡到達(dá)靶組織或靶器官后，在一定強(qiáng)度超聲的輻照下，微泡可以發(fā)生破裂，從而產(chǎn)生一定的微射流、切應(yīng)力和沖擊波，使相應(yīng)的細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，其內(nèi)皮細(xì)胞的間隙增大，基因或藥物從間隙進(jìn)入，到達(dá)指定的部位，來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向治療的目的。在一定強(qiáng)度的超聲輻照下，微泡作為一種空化核，它可以不斷振動(dòng)、膨脹、壓縮，甚至破裂，從而產(chǎn)生空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，二者均能使細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，尤以空化效應(yīng)為主。空化效應(yīng)主要分為兩種：第一種是穩(wěn)態(tài)空化：在低強(qiáng)度超聲的作用下，引發(fā)的輻射壓和微射流也較小，對(duì)細(xì)胞或組織產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)；第二種是瞬時(shí)空化：在高強(qiáng)度超聲的作用下，能夠達(dá)到瞬時(shí)空化的閾值，從而產(chǎn)生高速的微射流、巨大的切應(yīng)力以及高能效沖擊波，使細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)、內(nèi)皮細(xì)胞的間隙增大以及微血管發(fā)生破裂，這有利于藥物的吸收以及基因的轉(zhuǎn)染，最終引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死。有學(xué)者研究表明[9]，在基因轉(zhuǎn)染中起到主要作用的是超聲的瞬時(shí)空化效應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生的微射流、切應(yīng)力以及沖擊波，可在細(xì)胞膜上形成可逆或不可逆的小孔，讓外源基因從小孔進(jìn)入到細(xì)胞，上述現(xiàn)象稱為聲孔效應(yīng)，這種聲孔效應(yīng)正是藥物或基因突破細(xì)胞膜的屏障進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重要環(huán)節(jié)，也是超聲微泡增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)染與表達(dá)十分重要的原因。

除了上述機(jī)制外，曾也有學(xué)者表明[10]，超聲輻照之后，外源基因的表達(dá)會(huì)增高，與細(xì)胞損傷修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)也增高了，由此可見(jiàn)，與細(xì)胞損傷修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)，有可能是外源基因轉(zhuǎn)染的機(jī)制之一。和機(jī)械損傷后膜的修復(fù)動(dòng)力學(xué)以及囊泡的胞吐作用相似，從而成為外源基因的輸送途徑，提高轉(zhuǎn)染率。Meijering等[11]研究發(fā)現(xiàn)，超聲輻照微泡破裂后，可以產(chǎn)生活性氧（H2O2），讓鄰近細(xì)胞膜Ca2+內(nèi)流，使細(xì)胞膜的通透性增加，從而誘導(dǎo)外源性分子（如攜帶基因或藥物的微泡）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。

3 超聲微泡在肝癌治療中的應(yīng)用

3.1 超聲微泡靶向傳遞化療藥物

化療在肝癌的治療中起著重要作用，但化療藥物在腫瘤部位的藥物利用率較低、耐藥性的產(chǎn)生以及對(duì)正常組織的毒副作用等，一直是臨床面臨的難題。眾多研究數(shù)據(jù)表明，超聲微泡不僅能增強(qiáng)腫瘤病灶的顯像，還能作為一種新型載體，對(duì)基因和藥物進(jìn)行靶向傳遞，并在局部釋放，達(dá)到治療疾病的目的[12-15]。楊健等[16]采用機(jī)械振蕩法和生物素-親和素連接法制備了DR5靶向載多烯紫杉醇微泡，聯(lián)合超聲靶向微泡破裂技術(shù)通過(guò)下調(diào)Βcl-2和NF-κΒ表達(dá)、上調(diào)Caspase-8和DR5表達(dá)，從而增強(qiáng)了對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及阻滯細(xì)胞周期的能力，相對(duì)于僅使用多烯紫杉醇藥物，DR5靶向載多烯紫杉醇微泡組抗腫瘤作用明顯增強(qiáng)。常瑞姣等[17]在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，超聲輻照載多西紫杉醇微泡，能夠?qū)θ烁咿D(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97-H荷瘤裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)起到明顯抗腫瘤效應(yīng)，并且還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此認(rèn)為載多西紫杉醇微泡和單獨(dú)給予化療藥物治療相比較，前者是一種更安全、能減少不良反應(yīng)的給藥和治療方式。載藥超聲微泡治療肝癌，主要通過(guò)增加局部藥物的吸收，降低全身化療藥物的劑量，提高對(duì)化療的耐受性，從而達(dá)到減少全身毒性的作用。其次超聲介導(dǎo)載藥微泡能夠在超聲輻照的腫瘤區(qū)域釋放，使腫瘤內(nèi)藥物濃度增加，微泡破裂形成更小的納米顆粒，積聚在腫瘤內(nèi)，緩慢釋放藥物，從而延長(zhǎng)藥物的代謝時(shí)間。超聲微泡介導(dǎo)化療藥物的靶向傳輸作為一種非侵入性方法，是增強(qiáng)腫瘤患者化療效果，改善患者對(duì)化療不良反應(yīng)的新方法。

3.2 超聲微泡靶向遞送基因

肝癌的基因治療，是指將外源基因引入到患者靶組織或靶細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染并表達(dá)，以殺死腫瘤細(xì)胞，這種方法被認(rèn)為是一種極其有前景的腫瘤治療方法，也是目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的一種重大趨勢(shì)。盡管如此，但以往研究發(fā)現(xiàn)，裸露的基因治療存在許多缺點(diǎn)，例如：（1）容易被各種核酸酶降解；（2）基因在血液中降解較快，半衰期較短；（3）裸露的基因缺乏靶向性，細(xì)胞對(duì)其攝取率極低；（4）基因自身的負(fù)電荷和細(xì)胞膜上的負(fù)電荷能夠相互排斥，從而導(dǎo)致其通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用入胞的能力和逃逸內(nèi)涵體的能力比較差。因此，要使基因治療取得成功，關(guān)鍵在于安全有效的傳遞系統(tǒng)。超聲微泡作為一種非病毒靶向治療載體，在超聲空化效應(yīng)的作用下，使釋放的基因進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)、血管壁和組織的間隙，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)染與表達(dá)，使之發(fā)揮靶向治療作用[18]。Chowdhury等[19]將反義miR-21載入微泡內(nèi)作用于小鼠肝癌皮下移植瘤，通過(guò)超聲聚焦輻照，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積顯著縮小，肝癌細(xì)胞的增殖遷移以及侵襲能力降低，同時(shí)還提高了肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感度。朱芳方等[20]利用超聲微泡介導(dǎo)miR-181c-shRNA轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞后，miR-181c在細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)生下調(diào)，細(xì)胞的增殖也受到抑制，細(xì)胞周期發(fā)生了阻滯，將有望為肝癌的基因治療提供新的靶點(diǎn)。譚妍迪等[21]研究發(fā)現(xiàn)，超聲介導(dǎo)載miR-206和sPD-1基因納米微泡，作用于小鼠H22肝癌皮下移植瘤，不僅能夠阻斷PD-1與PD-L1的互相結(jié)合，還能上調(diào)干擾素-γ，下調(diào)PD-L1，解除T細(xì)胞的抑制，從而提高T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤作用，并未對(duì)周圍組織造成損傷，這說(shuō)明超聲聯(lián)合微泡是一種新型非病毒轉(zhuǎn)染的安全有效的基因治療方法。

3.3 超聲微泡增強(qiáng)肝癌治療中經(jīng)皮局部消融技術(shù)的療效

經(jīng)皮局部消融技術(shù)主要包括溫度消融和化學(xué)消融兩種形式。溫度消融主要包括微波消融、射頻消融、激光消融、高強(qiáng)度聚焦超聲（high intensity focus ultrasound,HIFU）以及冰凍消融等；而化學(xué)消融主要包括酒精消融及醋酸消融等。有研究顯示，超聲靶向微泡能夠改變組織中的聲環(huán)境，而達(dá)到提高消融效率的目的[22]。Xiao等[23]發(fā)現(xiàn)超聲微泡能增強(qiáng)兔VX2肝癌微波消融的效果，而且肝癌細(xì)胞壞死和凋亡率較其他組高，同時(shí)沒(méi)有產(chǎn)生嚴(yán)重的肝功能損傷。范蕊等[24]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，微波消融聯(lián)合載阿霉素超聲微泡靶向擊破可提高肝癌細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，抑制腫瘤增殖和微血管生成，彌補(bǔ)了單純微波消融治療適形性不足，同時(shí)降低藥物對(duì)心、腎的不良反應(yīng)，為降低肝癌復(fù)發(fā)提供了新的聯(lián)合治療思路。任春蓉等[25]制備了葉酸受體靶向的載10-羥基喜樹堿（10-HCPT）相變納米粒，在HIFU輻照后，能夠破壞微泡，定向釋放HCPT，靶向作用于裸鼠肝癌移植瘤，結(jié)果顯示，該治療組不僅消融范圍變大、肝癌細(xì)胞的增殖率最低、凋亡率最高，而且腫瘤生長(zhǎng)最為緩慢，其轉(zhuǎn)移灶最少，由此發(fā)現(xiàn)該治療方式對(duì)肝癌的遠(yuǎn)期療效最好。微泡是一種高聲阻抗的物質(zhì)，可以增強(qiáng)熱效應(yīng)，從而提高治療效果，HIFU聯(lián)合超聲微泡還可增加靶目標(biāo)自由基的形成，擴(kuò)大治療的范圍，減少治療的時(shí)間。

3.4 超聲微泡介導(dǎo)肝癌微血管栓塞的治療

肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)是肝癌治療中常用的方法之一，但現(xiàn)有技術(shù)只適用于中大型血管，尚難以對(duì)肝內(nèi)大量微血管進(jìn)行栓塞。有學(xué)者[26]研究表明，腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與腫瘤微血管有很大關(guān)系，肝癌的大小也和微血管的分型呈正相關(guān)趨勢(shì)，通過(guò)栓塞供養(yǎng)腫瘤的微循環(huán)以及側(cè)枝循環(huán)，成為治療肝癌的一個(gè)靶點(diǎn)。超聲微泡經(jīng)靜脈注入，進(jìn)入到微循環(huán)中，在超聲輻照下，產(chǎn)生空化效應(yīng)，可促使供應(yīng)腫瘤的微血管發(fā)生破裂，誘發(fā)血管栓塞，使腫瘤壞死。仇春麗等[27]發(fā)現(xiàn)超聲介導(dǎo)自制納米微泡聯(lián)合順鉑對(duì)小鼠肝癌皮下移植瘤具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，且腫瘤微血管密度的表達(dá)降低，其機(jī)制可能是抑制了腫瘤微血管的生成，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Kim等[28]利用超聲微泡介導(dǎo)載阿霉素的納米粒聯(lián)合動(dòng)脈化療栓塞在兔VX2肝癌模型中，通過(guò)抑制肝癌微血管生成，阻斷供血，使腫瘤生存能力降低，腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，提高了肝癌治療效果。因此，超聲微泡介導(dǎo)微血管栓塞，增強(qiáng)肝動(dòng)脈化療栓塞，有望成為一種新的肝癌治療方法。

4 問(wèn)題與展望

超聲微泡能夠靶向傳遞化療藥物，將外源基因?qū)氲礁伟┘?xì)胞內(nèi)，還能增強(qiáng)經(jīng)皮局部消融治療的療效，為肝癌提供了新的治療方法。目前大部分研究仍處于臨床前階段，由于對(duì)超聲分子影像技術(shù)的研究有限，有許多實(shí)際問(wèn)題尚待解決。如：超聲介導(dǎo)微泡治療時(shí)，有可能會(huì)發(fā)生血管內(nèi)外的溶血、毛細(xì)血管破裂、心肌受損、微循環(huán)被破壞、炎性反應(yīng)以及細(xì)胞死亡等并發(fā)癥，超聲微泡的相關(guān)聲學(xué)特性還需要進(jìn)一步的明確，微泡的制備方法和超聲輻照參數(shù)仍然需要更進(jìn)一步的優(yōu)化。關(guān)于微泡載藥量低，達(dá)不到臨床試驗(yàn)所需要的劑量，如何提高載藥量也是治療中需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。另外，如何保證藥物或基因在靶組織中能夠安全穩(wěn)定的釋放與表達(dá)，如何提高靶向微泡的靶向結(jié)合能力等，均有待在微泡材料、制備方法以及參數(shù)設(shè)置等方面深化研究。隨著以上問(wèn)題的攻克，超聲微泡介導(dǎo)藥物或基因在肝癌的治療中將發(fā)揮更大的作用。